菌種的分離與培養(yǎng)

1、菌種的分離與培養(yǎng)在自然界里，食用菌都不是單獨存在的，而是和許多細(xì) 菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所謂菌種分離，就是把 這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來，通過培養(yǎng)，獲得純 的優(yōu)良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。(一)母種的分離培養(yǎng) 食用菌母種的分離，可分為孢子分離法、組織分離法以及 基內(nèi)菌絲分離等。1.孢子分離法孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發(fā)成菌 絲，培養(yǎng)成菌種的方法。這種菌種生活力較強(qiáng)，但孢子個體 之間有差異，且自然分化現(xiàn)象較嚴(yán)重，變異大，需經(jīng)出菇試 驗才能在生產(chǎn)上應(yīng)用。(l)單孢分離法：是每次或每支試管只取一個擔(dān)孢子，它萌發(fā)成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分

2、離得到的菌絲，有結(jié)實能力，可采用此法分離生產(chǎn)純菌種。 單孢分離生產(chǎn)上較少采用，而且技術(shù)復(fù)雜，一般采用多孢分 離法。( 2)多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養(yǎng)基上， 讓它們萌發(fā)、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具 體操作方法，有以下幾種： 種菇孢子彈射法： 選擇個體健壯、 朵形圓正， 無病蟲害、 出菇均勻、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)的八九分成熟的種菇，切去 大部分，菌柄用無菌水沖洗數(shù)遍后再用已滅菌的紗布或脫脂 棉、濾紙吸干表面水分。在接種箱或無菌室內(nèi)，把種菇的菌 褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養(yǎng)皿上面； 上端小孔用棉花塞住。培養(yǎng)皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上， 靜置1220小時，

3、菌褶上的孢子就會散落在培養(yǎng)皿內(nèi)。形 成一層粉末狀孢子印 （平菇極淡紫色， 蘑菇、 草菇 為褐色， 香菇、金針菇孢子印白色） 。用接種針沾取少量孢子在試管 中的瓊脂外面或培養(yǎng)皿上劃線接種。待孢子萌發(fā)，生成菌落 時，選孢子萌發(fā)早、長勢好的菌落進(jìn)行試管培養(yǎng)。 還可用孢子采集器收集孢子。方法是選好種菇后，按上述程 序，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼 絲架上，放在培養(yǎng)皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鐘 掌周圍塞好。并在紗布上倒少許升汞或無菌水。移入20C左右恒溫箱培養(yǎng)。 褶上涂抹法：按無菌操作分離時；應(yīng)選擇成熟的種菇， 用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未 彈射的孢子

4、，再在培養(yǎng)基上劃線接種。 鉤懸法： 取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片 （黑木耳、 毛木耳、白木耳 ，用無菌不銹鋼絲（或鐵絲、棉線等其他 懸掛材料）懸掛于三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基的上方，勿使接觸到培養(yǎng)基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接即可。 貼附法：按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊， 溶化的瓊脂培養(yǎng)基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養(yǎng) 基正上方的試管壁上。經(jīng) 612小時的培養(yǎng)，待孢子落在斜 面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養(yǎng)基移植到新的試管中培 養(yǎng)即可。 孢子分離得到的母種、必須進(jìn)一步提純復(fù)壯，當(dāng)母種定植一 星期左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老 化、無感染雜茵的母種試管， 進(jìn)而轉(zhuǎn)管

5、擴(kuò)大， 一般到栽培種， 轉(zhuǎn)管不宜超過 5 次。孢子分離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑒定為優(yōu)質(zhì)菌 種后，才可供生產(chǎn)使用。一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等， 都可用多孢分離法獲得母種。現(xiàn)就銀耳孢子分離略述于下： 按無菌操作獲取種耳后，懸掛種耳的三角瓶經(jīng) 12 小時培養(yǎng) 后，瓶底培養(yǎng)基表面就有'孢子印'。取出種耳，置20C 25C 溫箱培養(yǎng) 23 天，培養(yǎng)基表面會出現(xiàn)乳白色透明的糊狀小 菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此 時移接入試管斜面培養(yǎng)基上，待長滿斜面后，再移接入營養(yǎng) 豐富，且表面比較干燥的培養(yǎng)基上。經(jīng) 30 天左右，菌落長 出白色菌絲。銀耳

6、的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌(香灰菌絲)混合培養(yǎng)時，由后者幫助分解木材及其他一些 纖維物質(zhì)，提供營養(yǎng)，才能利于銀耳孢子萌發(fā)，菌絲的定植 和子實體的形成。在兩種菌絲交會時，先選出兩種純菌絲。羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長迅速，爬壁力強(qiáng) 的試管斜面或種瓶， 取先端菌絲，轉(zhuǎn)管移接，置25 C 28 C 上培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)管幾次即可得到優(yōu)良純種。銀耳菌絲的特點，菌絲生長緩慢，擔(dān)孢子也不易萌發(fā)。在進(jìn)行兩菌混合時，先取經(jīng) 810天培養(yǎng)的銀耳菌絲斜面，按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約 0.5 厘米處接入一小塊羽毛狀菌絲。置25C下培養(yǎng)1周即得到混合好的銀耳母 種。2組織分離培養(yǎng)法利用

7、子實體內(nèi)部組織，進(jìn)行無性繁殖而獲得母種的簡便方法， 即組織分離。該法操作簡便，菌絲生長發(fā)育快，品種特性易 保存下來，特別是雜交育種后，優(yōu)良菌株用組織分離法能使 遺傳特性穩(wěn)定下來。常采用以下分離方法。(I) 子實體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優(yōu)良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內(nèi)以 0.1 的升汞水 浸幾分鐘， 再用無菌水沖洗并揩干或用 75酒精棉球擦拭菌 蓋與菌柄 2 次，進(jìn)行表面消毒。接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織；移接 到PDA培養(yǎng)基上。置25C左右溫度下培養(yǎng) 3-5天，就可以看到組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大即得到菌種。如香 菇、平菇等可

8、以用此方法。（ 2 ）菌核分離： 茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易采集。 而常見的是它貯藏營養(yǎng)的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得 菌種。方法是將菌核表面洗凈，用酒精或升汞消毒后，切開 菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在 PDA 培養(yǎng) 基斜面上，保溫培養(yǎng)。應(yīng)注意的是，菌核是貯藏器官，大部 分是多糖類物質(zhì)，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要 大一些，如果組織塊過小，則不易分出菌種。（ 3）菌素分離：有一部分子實體不易找到，也沒有菌核， 可以用菌素進(jìn)行分離。如蜜環(huán)菌、假蜜環(huán)菌。其操作方法是 先用酒精或升汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭23次，然后去掉黑色外皮層（菌鞘） ，抽出白色菌髓部分；用無菌

9、剪 刀將菌髓剪一小段，接種在培養(yǎng)基上，保溫培養(yǎng)，即得該菌 菌種。菌素分離要注意：因菌素比較細(xì)小，分離素也比較細(xì)小，分 離時極易污染雜菌，所以要嚴(yán)格操作。3基內(nèi)菌絲分離培養(yǎng)法 利用食用菌生育的基質(zhì)作為分離材料，來得到純菌種的一種 方法，叫基內(nèi)菌絲分離法。此種分離方法是適宜只有在特定的季節(jié)才出現(xiàn)，而且是朝生 暮死，不易采得的子實體?；鶅?nèi)分離法與組織分離法不同之 點是，干燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態(tài)。接種后有 時并不立刻恢復(fù)生長。因此，有必要保留較長的時間（約 1 個月），以斷定菌絲是否能成活。 基內(nèi)菌絲分離法又可分為， 材中菌絲分離（即菇木或耳木分離法） 及土中菌絲分離法等。（1）材中菌絲分

10、離法：就是菇木或耳木分離法，為了減少 雜菌的感染，菇（耳）木在分離之前，必須進(jìn)行無菌處理。 可以把菇（耳）水表面用酒精燈火焰輕輕燒過，以燒死霉菌 的孢子，或再用 0.1的升汞水浸孢幾分鐘，然后用無菌水 沖洗后用無菌濾紙吸干。接種塊切取時應(yīng)注意。接種塊必須 在該菌菌絲分布的范圍內(nèi)切取。所以，菌絲生長緩慢的種類 應(yīng)淺??；菌種生長快的種類可以深取。同時。還應(yīng)根據(jù)菇菌 的種類、木材質(zhì)地、菇（耳）木粗細(xì)、發(fā)育時間的長短來確 定菌絲分布的范圍。然后用一把利刀進(jìn)行切取。接種塊應(yīng)盡 量小些，以減少雜菌感染機(jī)會，提離菌種的純度。接種塊移 到培養(yǎng)基上，就應(yīng)該放到適合菌絲生長的22C26C 的溫室或溫箱中培養(yǎng)，使菌

11、絲恢復(fù)生長。（2）土中菌絲分離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌； 孢子不易萌發(fā)。組織分離也不易成功，用土中菌絲分離獲得 純種的方法，叫土中菌絲分離。土中菌絲分離時要注意，由于土中菌絲體的周圍生活著多種 多樣的土壤微生物，因此分離時必須盡可能避開這些微生物 的干擾，盡可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接 種，反復(fù)用無菌水沖洗，在培養(yǎng)基中加入一些抑制細(xì)菌 生 長的藥物，如 40 微克升的鏈霉素或金霉素。如發(fā)現(xiàn)感染 細(xì)菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來， 接種到木屑培養(yǎng)基中。 因細(xì)菌沒有分解木質(zhì)素的能力，因此在木屑培養(yǎng)基中不易擴(kuò) 展；只局限于接種處。待菌絲長出感染區(qū)后，就可以再進(jìn)行 擴(kuò)大提純了。

12、（3）子實體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體 基部分離出新菌絲的方法，叫子實體基部分離，現(xiàn)以袋栽銀 耳為例說明： 從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中；選擇生活力最 強(qiáng)的幼耳 5 袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場所進(jìn)行后 期培養(yǎng)，以增強(qiáng)菌絲體的生活力。經(jīng)培養(yǎng)710天后，待子實體直徑達(dá)45厘米時便可取回，作為分離的母體。再從 中篩選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實體，放置于0C的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然 后用 75酒精或升汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質(zhì)，連同接種工具、接種培養(yǎng)基等移進(jìn)無菌室。經(jīng)滅菌后，用接種刀把袋 口上部約 15 毫米厚的老菌根挖除，并進(jìn)行培養(yǎng)。

13、待袋口露 出白色菌絲時，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結(jié)體， 迅速移入母種試管培養(yǎng)基的中央，輕輕地脫去接種針，塞 上棉塞。 為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有 100 200 支試管，以便從中選擇。分離后應(yīng)及時移入 22C 24C恒溫箱或溫室中培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基內(nèi)水分較多， 菌絲恢復(fù)要比耳木分離得快。經(jīng) 2-3 天后，分離物的邊緣就 可看 到白色菌絲。 每天要至少觀察兩次， 以便提純。 觀察、 提純方法與耳木分離法擔(dān)同。經(jīng)適溫培養(yǎng) 10-15 天后，當(dāng)接 種塊扭結(jié)團(tuán)出現(xiàn)紅、黃色水珠時，即可擴(kuò)大原種。（二）原種和栽培種的接種培養(yǎng) 母種獲得以后，為了滿足菌種生產(chǎn)的需要。應(yīng)選出優(yōu)良、純 度高的母

14、種進(jìn)一步擴(kuò)大為原種。原種培養(yǎng)基一般采用棉籽殼、 木屑、草類等培養(yǎng)基。 瓶裝或袋裝的原種培養(yǎng)基滅菌后，可送入滅過菌的接種箱內(nèi)， 待瓶中的培養(yǎng)基冷至 30 C以下，可按照無菌操作程序進(jìn)行接 種。 菌種瓶（袋）放入培養(yǎng)室時，要經(jīng)常進(jìn)行檢查，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)雜 菌污染，立即取出。培養(yǎng)成的原種，菌絲體必須健壯有力， 緊貼瓶壁而不干縮， 顏色純正， 具有一定清香味， 生活力強(qiáng)， 擴(kuò)制成栽培種時吃料快。 栽培種就是將原種進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)成三級種，它和原種的接 種及培養(yǎng)相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳 的栽培種多用鋸木、 棉皮作培養(yǎng)基。 蘑菇多用糞草做培養(yǎng)料。 栽培種要求料塊不脫水干縮。菌絲體健壯有力、顏色

15、純正， 有清香味，無老化現(xiàn)象，無雜菌污染，有的種許可有少量原 基，接入栽培料后，發(fā)菌快，長勢好，生活力強(qiáng)。 原種在接栽培種時，原種瓶口的一層菌絲體應(yīng)挖去不用。（三）液體種的簡單培養(yǎng) 目前，用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)菌種， 具有生產(chǎn)量大、 周期短、 菌齡整齊、成本低廉、接種方便等特點，是實現(xiàn)食用菌工廠 化生產(chǎn)的目標(biāo)。現(xiàn)將液體種培育過程簡述于后，供參考。 簡言之就是將純正優(yōu)良的菌種，接入液體培養(yǎng)基（固體培養(yǎng) 基不加凝固劑） ，使菌絲繁殖形成大量小菌球，然后將這種 培養(yǎng)基拌入木屑或棉籽皮料內(nèi)，制成菌塊、培養(yǎng)其形成子實 體。還可用于制原種、栽培種。 培養(yǎng)液體菌種，可將培養(yǎng)液裝入三角瓶中，約占空瓶的五分 之一

16、重量。用搖瓶機(jī)（也稱搖床）來培養(yǎng)。搖瓶機(jī)有旋轉(zhuǎn)式 和往復(fù)式兩種，一般多用往復(fù)式。液體培養(yǎng)基可用馬鈴薯汁 （加糖），麥芽汁配制，也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機(jī) 鹽等配制。可以混合培養(yǎng)基，因適用于多種食用菌和藥用菌 的培養(yǎng)，均有好效果。組分：豆餅粉 2，玉米粉 1， 葡 萄糖 3，酵母粉 0.5，磷酸二氫鉀 0.1 ，碳酸鈣 0.2， pH自然，12C滅菌半小時。然后接種培養(yǎng)。 如果生產(chǎn)量較大，在三角瓶的基礎(chǔ)上，再逐級擴(kuò)大種子缸， 發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層通氣發(fā)酵，產(chǎn)生大量菌種。但由于生 產(chǎn)中要求設(shè)備繁多，技術(shù)性強(qiáng)，我們還應(yīng)創(chuàng)造條件；實現(xiàn)食用菌栽培的現(xiàn)代化（四）菌種質(zhì)量的鑒定 菌種質(zhì)量鑒定最好的方法是

17、， 做出菇試驗。 但是時間比較長。 在購置菌種時，或在菌種生產(chǎn)中，如何能知菌絲生長情況， 快速判斷菌種質(zhì)量？我們介紹幾種方法：1. 肉眼觀察：優(yōu)良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整 齊，速度快，香味濃厚。2. 優(yōu)良菌種標(biāo)準(zhǔn)可歸納為： '純、香、正、壯、潤 '五個字。 檢查時，打開瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色 澤，聞其氣味，手捏料塊檢查其含水量，看是否符合上述要 求標(biāo)準(zhǔn)。3. 顯微鏡檢查：挑取少量菌絲，置顯微鏡上觀察其形態(tài)，菌 絲分枝， 分隔情況， 鎖狀聯(lián)合， 細(xì)胞膜的厚薄。 培養(yǎng)觀察： 從菌種瓶中挑取小塊菌絲體，接種斜面試管培養(yǎng)基上，置 23C25C恒溫中培養(yǎng)，經(jīng)

18、五周后檢查菌種生活力。如果菌 絲生長快，旺盛純一，健壯濃厚，長且整齊，則表示菌種的 生活力強(qiáng)。4. 分塊法： 在桌上放一張白紙， 把菌齡相同的菌種從瓶內(nèi)取 出一大塊，用手分成 2 塊，再把 2 塊分成 4 塊， 4 塊 分成 8 塊，依次進(jìn)行。優(yōu)良菌種整塊多，碎渣少。劣次菌整塊少， 碎渣多。5. 液體菌種鑒別： 當(dāng)三角瓶或發(fā)酵缸培養(yǎng)3-7 天后， 如液面出現(xiàn)氣泡，產(chǎn)生 '油皮 '、混濁等現(xiàn)象，說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮，或遲遲長出很薄的菌絲層，則說明菌種生 活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀，表明菌種 生命力強(qiáng)。（五）菌種生產(chǎn)過程中的雜茵防治 在生產(chǎn)菌種時，要時刻注意雜菌污染，以防為主，一旦發(fā) 生，根治很不容易。所以整個制種過程都必須在無菌條件下 進(jìn)行。接種箱及所有分離、接種的用具、器皿，都要進(jìn)行嚴(yán) 格的消毒滅菌。工作人員的雙手要用消毒劑清洗，并穿戴消 過毒的工作服、帽和口罩，動作要敏捷、準(zhǔn)確，盡量不要講 話走動，以