蛋白質(zhì)含量測(cè)定——雙縮脲試劑法實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、南方醫(yī)科女曇生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名：學(xué) 號(hào)：專(zhuān)業(yè)年級(jí)：組 另生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)蛋白質(zhì)含量測(cè)定雙縮脲試劑法實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)合作者指導(dǎo)老師評(píng)分教師簽名批改日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1. 掌握雙縮脲測(cè)定血清總蛋白的基本原理、操作；1.2. 掌握雙縮脲試劑的配制；1.3. 熟悉血清總蛋白的臨床意義；1.4. 了解雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的特點(diǎn)和注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理2.1.兩分子尿素加熱脫氨縮合成的雙縮脲（ H2N-OC-NH-CO-NH2 ），因分子內(nèi)含有 兩個(gè)鄰接的肽鍵，在堿性溶液中可與 Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物。2.2.蛋白質(zhì)分子含有大量彼此相連的肽鍵 （-CO-N

2、H- ），同樣能在堿性條件下與 Cu2+ 發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成的紫紅色絡(luò)合物，且在540nm處的吸光度與蛋白質(zhì)的含量在10 120g/L 范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。三、材料與方法：3.1.實(shí)驗(yàn)材料：3.1.1實(shí)驗(yàn)試劑：小牛血清；6.0mol/LNaOH溶液；雙縮脲試劑：硫酸酮、酒石 酸鉀鈉、碘化鉀；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（70g/L:0.9%NaCl;蒸餾水。3.1.2實(shí)驗(yàn)器材：試管；燒杯；容量瓶；加樣槍?zhuān)豢潭任?；玻璃?® 1100分光光度計(jì)；電子天平；水浴鍋。3.2實(shí)驗(yàn)步驟廠(chǎng)取3支試管，做好標(biāo)記，按下表操作：加入物（ml）B （空白）S （標(biāo)準(zhǔn)）U （待測(cè)）小牛血清（1:10-0.5蛋白質(zhì)

3、標(biāo)準(zhǔn)液（1:10）-0.5-0.9%Nacl0.5雙縮脲試劑4.04.04.0a各管混勻，觀(guān)察各試管顏色;b.將各試管置于37C水浴鍋中加熱20min,觀(guān)察顏色;c將試管中的液體倒入比色杯中，置于1100分光光度計(jì)的樣品槽內(nèi)，在波長(zhǎng)540nm,以空白管調(diào)零，測(cè)S和U管吸的光度;d.測(cè)定結(jié)束后，將比色杯中的樣品回收進(jìn)試管。r血清總蛋白（ 依據(jù)公式算出結(jié)果：Ag/L）3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/L）A s四、結(jié)果與討論：4.1實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：選取三支潔凈無(wú)損的試管，從左往右依次加入0.9%氯化鈉溶液、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液、相應(yīng)的小牛血清各0.5ml,分別命名為B試管、S試管和U試管，再分別向三支試管內(nèi) 加入4ml

4、的雙縮脲試劑，溶液均成藍(lán)色透明狀。圖二分光計(jì)讀數(shù)管號(hào)0.1850.1840.1850.1847將三支試管放入37C水浴鍋中加熱20min,取出后，B試管呈淡藍(lán)色，S試管和U試管均成淺紫色，且S試管的顏色比U試管的顏色深。（如圖一）圖一水浴后三支試管顏色4.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定次數(shù)平均吸光度U0.1520.1510.1520.1517結(jié)果計(jì)算：代入公式：血清總蛋白（g/L）=（Au/As）X蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液濃度（g/L），得出結(jié)果：血清總蛋白=57.493g/L。4.3結(jié)果討論經(jīng)查閱資料得：正常成人血清總蛋白含量為 6080g/L，而小牛血清總蛋白含量比 正常成人血清總蛋白含量略低一點(diǎn)，本次結(jié)果得出小牛血

5、清總蛋白含量為57.493g/L，符合情況。4.3.1成功原因：本次試驗(yàn)的試劑混合水浴后出現(xiàn)了預(yù)期效果： B試管呈淡藍(lán)色，S試管和U試管 均成淺紫色，且S試管的顏色比U試管的顏色深。B試管呈淡藍(lán)色是因?yàn)锽試管中沒(méi)有 發(fā)生任何反應(yīng)，所以呈現(xiàn)雙縮脲試劑本來(lái)的淡藍(lán)色， 而S試管和U試管呈淺紫色是因?yàn)?試劑中的蛋白質(zhì)和雙縮脲發(fā)生了雙縮脲反應(yīng)而呈淺紫色。精品吸光度測(cè)試后得到的數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算后得到了預(yù)期中的結(jié)果，是因?yàn)榍懊娌僮鲊?yán)謹(jǐn)。432誤差分析 三次重復(fù)測(cè)定過(guò)程中出現(xiàn)了一些浮動(dòng)數(shù)據(jù)，可能是因?yàn)閮x器本身存在的可允許的誤差范圍。 第一次嘗試使用分光光度計(jì)的時(shí)候得到了負(fù)值，經(jīng)查明是因?yàn)榉胖迷谄鋬?nèi)的比色杯將磨面對(duì)

6、準(zhǔn)了通光面，經(jīng)調(diào)整后，獲得了正確的數(shù)據(jù)。4.4課后復(fù)習(xí)題4.4.1什么叫雙縮脲試劑？為什么要在雙縮脲試劑中加入酒石酸鉀鈉和碘化鉀？答：雙縮脲試劑是一個(gè)用于鑒定蛋白質(zhì)的分析化學(xué)試劑，遇到蛋白質(zhì)顯紫色。它是 一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍(lán)色，由 0.1g/ml氫氧化鈉或氫氧化鉀、0.01g/ml硫酸銅和酒 石酸鉀鈉配制。硫酸銅、酒石酸鉀鈉的堿性溶液中會(huì)生成紫紅色絡(luò)合物，在這種比例的堿 性水溶液中，本來(lái)形成的Cu(0H)2會(huì)與溶液中多余的0H-形成Cu(OH)42-絡(luò)離子，酒 石酸鉀鈉的作用就是保護(hù)這種絡(luò)離子不被析出變?yōu)槌恋?，向試劑中加入碘化鉀，可延長(zhǎng)試 劑的使用壽命。4.4.2試劑配制過(guò)程中，為何NaOH要單獨(dú)配制，最后加入？答：先單獨(dú)加入NaOH溶液是為了營(yíng)造一個(gè)堿性環(huán)境，在堿性環(huán)境下雙縮脲試劑B 中的Cu2+與蛋白質(zhì)肽鍵絡(luò)合產(chǎn)生顏色反應(yīng).如果先將雙縮脲試劑A與雙縮脲試劑B混合, 即NaOH與CuSO4溶液混在一起，那么就會(huì)產(chǎn)生Cu(OH)2沉淀，藥劑就會(huì)失去作用，看不 到效果，也就無(wú)法判斷是否存在蛋白質(zhì).4.4.3簡(jiǎn)述血清總蛋白測(cè)定的臨床意義。答：臨床上，當(dāng)血清總蛋白濃度降低時(shí)，可能代表：血清總蛋白濃度降低