蛋白質(zhì)含量測定——雙縮脲試劑法實驗報告

1、南方醫(yī)科女曇生物化學實驗報告姓 名：學 號：專業(yè)年級：組 另生物化學與分子生物學實驗教學中心實驗名稱蛋白質(zhì)含量測定雙縮脲試劑法實驗日期實驗地點合作者指導老師評分教師簽名批改日期一、實驗目的1.1. 掌握雙縮脲測定血清總蛋白的基本原理、操作；1.2. 掌握雙縮脲試劑的配制；1.3. 熟悉血清總蛋白的臨床意義；1.4. 了解雙縮脲法測定血清總蛋白的特點和注意事項。二、實驗原理2.1.兩分子尿素加熱脫氨縮合成的雙縮脲（ H2N-OC-NH-CO-NH2 ），因分子內(nèi)含有 兩個鄰接的肽鍵，在堿性溶液中可與 Cu2+發(fā)生雙縮脲反應，生成紫紅色絡合物。2.2.蛋白質(zhì)分子含有大量彼此相連的肽鍵 （-CO-N

2、H- ），同樣能在堿性條件下與 Cu2+ 發(fā)生雙縮脲反應，生成的紫紅色絡合物，且在540nm處的吸光度與蛋白質(zhì)的含量在10 120g/L 范圍內(nèi)有良好的線性關系。三、材料與方法：3.1.實驗材料：3.1.1實驗試劑：小牛血清；6.0mol/LNaOH溶液；雙縮脲試劑：硫酸酮、酒石 酸鉀鈉、碘化鉀；蛋白質(zhì)標準液（70g/L:0.9%NaCl;蒸餾水。3.1.2實驗器材：試管；燒杯；容量瓶；加樣槍；刻度吸管；玻璃棒;® 1100分光光度計；電子天平；水浴鍋。3.2實驗步驟廠取3支試管，做好標記，按下表操作：加入物（ml）B （空白）S （標準）U （待測）小牛血清（1:10-0.5蛋白質(zhì)

3、標準液（1:10）-0.5-0.9%Nacl0.5雙縮脲試劑4.04.04.0a各管混勻，觀察各試管顏色;b.將各試管置于37C水浴鍋中加熱20min,觀察顏色;c將試管中的液體倒入比色杯中，置于1100分光光度計的樣品槽內(nèi)，在波長540nm,以空白管調(diào)零，測S和U管吸的光度;d.測定結(jié)束后，將比色杯中的樣品回收進試管。r血清總蛋白（ 依據(jù)公式算出結(jié)果：Ag/L）3 蛋白質(zhì)標準液濃度（g/L）A s四、結(jié)果與討論：4.1實驗現(xiàn)象：選取三支潔凈無損的試管，從左往右依次加入0.9%氯化鈉溶液、蛋白質(zhì)標準液、相應的小牛血清各0.5ml,分別命名為B試管、S試管和U試管，再分別向三支試管內(nèi) 加入4ml

4、的雙縮脲試劑，溶液均成藍色透明狀。圖二分光計讀數(shù)管號0.1850.1840.1850.1847將三支試管放入37C水浴鍋中加熱20min,取出后，B試管呈淡藍色，S試管和U試管均成淺紫色，且S試管的顏色比U試管的顏色深。（如圖一）圖一水浴后三支試管顏色4.2實驗數(shù)據(jù)測定次數(shù)平均吸光度U0.1520.1510.1520.1517結(jié)果計算：代入公式：血清總蛋白（g/L）=（Au/As）X蛋白質(zhì)標準液濃度（g/L），得出結(jié)果：血清總蛋白=57.493g/L。4.3結(jié)果討論經(jīng)查閱資料得：正常成人血清總蛋白含量為 6080g/L，而小牛血清總蛋白含量比 正常成人血清總蛋白含量略低一點，本次結(jié)果得出小牛血

5、清總蛋白含量為57.493g/L，符合情況。4.3.1成功原因：本次試驗的試劑混合水浴后出現(xiàn)了預期效果： B試管呈淡藍色，S試管和U試管 均成淺紫色，且S試管的顏色比U試管的顏色深。B試管呈淡藍色是因為B試管中沒有 發(fā)生任何反應，所以呈現(xiàn)雙縮脲試劑本來的淡藍色， 而S試管和U試管呈淺紫色是因為 試劑中的蛋白質(zhì)和雙縮脲發(fā)生了雙縮脲反應而呈淺紫色。精品吸光度測試后得到的數(shù)據(jù)，經(jīng)計算后得到了預期中的結(jié)果，是因為前面操作嚴謹。432誤差分析 三次重復測定過程中出現(xiàn)了一些浮動數(shù)據(jù)，可能是因為儀器本身存在的可允許的誤差范圍。 第一次嘗試使用分光光度計的時候得到了負值，經(jīng)查明是因為放置在其內(nèi)的比色杯將磨面對

6、準了通光面，經(jīng)調(diào)整后，獲得了正確的數(shù)據(jù)。4.4課后復習題4.4.1什么叫雙縮脲試劑？為什么要在雙縮脲試劑中加入酒石酸鉀鈉和碘化鉀？答：雙縮脲試劑是一個用于鑒定蛋白質(zhì)的分析化學試劑，遇到蛋白質(zhì)顯紫色。它是 一個堿性的含銅試液，呈藍色，由 0.1g/ml氫氧化鈉或氫氧化鉀、0.01g/ml硫酸銅和酒 石酸鉀鈉配制。硫酸銅、酒石酸鉀鈉的堿性溶液中會生成紫紅色絡合物，在這種比例的堿 性水溶液中，本來形成的Cu(0H)2會與溶液中多余的0H-形成Cu(OH)42-絡離子，酒 石酸鉀鈉的作用就是保護這種絡離子不被析出變?yōu)槌恋恚蛟噭┲屑尤氲饣?，可延長試 劑的使用壽命。4.4.2試劑配制過程中，為何NaOH要單獨配制，最后加入？答：先單獨加入NaOH溶液是為了營造一個堿性環(huán)境，在堿性環(huán)境下雙縮脲試劑B 中的Cu2+與蛋白質(zhì)肽鍵絡合產(chǎn)生顏色反應.如果先將雙縮脲試劑A與雙縮脲試劑B混合, 即NaOH與CuSO4溶液混在一起，那么就會產(chǎn)生Cu(OH)2沉淀，藥劑就會失去作用，看不 到效果，也就無法判斷是否存在蛋白質(zhì).4.4.3簡述血清總蛋白測定的臨床意義。答：臨床上，當血清總蛋白濃度降低時，可能代表：血清總蛋白濃度降低