人苯丙氨酸羥化酶基因克隆及其原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1、人苯丙氨酸羥化酶基因克隆及其原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建                 作者：張志， 黃宗青， 沈琪， 劉洪濤， 鄧英太， 李愛東， 周國(guó)強(qiáng)， 汪華僑， 何蘊(yùn)韶   【摘要】  【目的】 克隆健康人苯丙氨酸羥化酶基因全長(zhǎng)cDNA序列，構(gòu)建并鑒定其原核表達(dá)質(zhì)粒pTrcHisB/PAH?！痉椒ā?采用RT-PCR方法從人肝組織中擴(kuò)增 PAH基因全長(zhǎng)cDNA，T/A 克隆到pMD18-T載體中，

2、雙酶切后將cDA亞克隆入pTrcHisB載體，構(gòu)建pTrcHisB/PAH質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定并測(cè)序?！窘Y(jié)果】 人PAH基因cDNA正確克隆入pTrcHisB表達(dá)載體，與Genebank中PAH基因序列一致?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建pTrcHisB/PAH表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步進(jìn)行研究PAH蛋白表達(dá)和重組蛋白活性鑒定奠定基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  苯丙酮尿癥； 苯丙氨酸羥化酶； 克?。?原核表達(dá)質(zhì)粒    J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):288-291      苯丙

3、酮尿癥(phenylketonuria, PKU)是神經(jīng)科常見氨基酸代謝障礙的常染色體隱性遺傳病。98%99%是由于苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）基因突變導(dǎo)致肝臟苯丙氨酸羥化酶活性降低而致病1。當(dāng)前的基因治療為本病治療提供了嶄新的思路2。國(guó)外學(xué)者已經(jīng)在PKU小鼠模型上用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PAH進(jìn)行基因治療獲得一定的成功，但是始終未能解決生物安全和如何長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)等問題3,4,阻礙了這種方法的臨床推廣和應(yīng)用。本研究旨在通過體外原核表達(dá)活性PAH蛋白，開發(fā)新型PKU基因治療藥物，改進(jìn)當(dāng)前PKU治療單純依靠飲食控制的現(xiàn)狀。我們采用基因工程重組技術(shù)從健康人肝

4、細(xì)胞中定向克隆出人PAH基因,構(gòu)建pTrcHisBPAH原核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定，為以后PAH蛋白的體外表達(dá)打下基礎(chǔ)，結(jié)果報(bào)道如下。    1   材料與方法    1.1   材料    1.1.1   主要材料和試劑   新鮮肝臟標(biāo)本來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科肝血管瘤病人手術(shù);pTrcHisB、TOP10 (Invitrogen), pMD18-T Vector (TaKaRa),Trizol (GIBCO)、Reve

5、rtAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (#1621)、EcoRI、Kpn I (MBI Fermentas), QIA quick Gel Extraction Kit、QIA Spin Miniprep Kit (QIAGene)、T4?鄄DNA Ligase (Invitrogen)。大腸桿菌DH5為中山大學(xué)達(dá)安基因中心提供。    1.1.2   主要設(shè)備   玻璃勻漿機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、80 冰箱（日本SANYO公司）、PE9600 PCR擴(kuò)增儀、ABI

6、3100 Avant DNA測(cè)序儀（美國(guó)PE公司）。    1.2   方法    1.2.1  引物設(shè)計(jì)   GeneBank上登錄PAH基因mRNA序列(GI：18765884)，在Primer Premier5.0和 Olig6.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PAH的編碼序列(CDS)，5端設(shè)計(jì)Kpn 和EcoR 酶切位點(diǎn)加上3個(gè)保護(hù)堿基。引物由上海生工合成。    1.2.2   目的基因的獲得   從人新鮮肝臟標(biāo)本Tr

7、izol法提取總RNA，檢測(cè)A260和A280值，計(jì)算濃度，80 保存。取RNA 2 g采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA(complement DNA)。以PAHcDNA為模板做RTPCR。反應(yīng)條件: 93 10 min、 93 45 s、56 45 s、72 1 min，35個(gè)循環(huán)后, 72 10 min。PCR產(chǎn)物濃縮后在0.8%瓊脂糖上電泳（1 377 bp），用QIA quick Gel Extraction Kit割膠純化， 1瓊脂糖電泳鑒定、拍照、20 保存。    1.2.3

8、60;  PCR產(chǎn)物克隆和鑒定   克隆反應(yīng)體系:純化的PCR產(chǎn)物4 L、 pMD18-T Vector 1 L、Ligation Solution I 5 L，16 過夜，得到pMD18-T/PAH質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5a，涂含氨芐青霉素LB平板，IPTG進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，體外擴(kuò)增并PCR初篩后菌液抽提pMD18-T/PAH質(zhì)粒，用Kpn和EcoR雙酶切并測(cè)序鑒定。測(cè)序正向引物為M-47, 反向?yàn)镸-48, 中間引物為5-TGGAATACATGGAGGAAGA-3。測(cè)序在中山大學(xué)達(dá)安基因中心完成。    1.2

9、.4   原核表達(dá)載體   pTrcHisB/PAH 構(gòu)建和鑒定  質(zhì)粒pTrcHisB空載體和質(zhì)粒pMD18-T/PAH分別經(jīng)Kpn和EcoR雙酶切，割膠回收目的基因片斷和空載體。目的基因與空載體pTrcHisB按51的比例混合進(jìn)行連接反應(yīng), 加入4連接酶2,反應(yīng)體積為10 ,18 連接過夜。反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TOP10細(xì)菌中培養(yǎng)過夜，在含氨芐青霉素LB平板上隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，搖菌培養(yǎng)，PCR初篩后抽提pTrcHisB/PAH質(zhì)粒，用Kpn和EcoR雙酶切并全長(zhǎng)測(cè)序鑒定，測(cè)序引物為RTPCR引物和上述中間引物。  

10、  2   結(jié)   果    2.1   肝組織總RNA結(jié)果    提取總RNA電泳后可見三條帶, 說明提取的RNA較完整。所測(cè)1、2兩個(gè)標(biāo)本的A260 / A280分別為2和1.99，其濃度分別為4.84和2.85 ?滋g/?滋L，RNA純度符合要求。    2.2   PAH基因CDS序列的RT-PCR結(jié)果    本研究設(shè)計(jì)RTPCR片段大小為1 377 bp，包含PAH基因的CDS

11、序列1 359 bp。圖1中P為RTPCR產(chǎn)物，片段大小與預(yù)期設(shè)計(jì)基本相符。    2.3   pMD18-T/PAH酶切結(jié)果    RT-PCR的片段大小為1 377 bp,pMD18-T的大小為2 692 bp, PMD-18/PAH大小理論上應(yīng)為1 377+2 692= 4 069 bp。酶切鑒定結(jié)果(圖2)與設(shè)計(jì)結(jié)果相符。    2.4   pTrcHis/PAH酶切結(jié)果    pTrcHisB空質(zhì)粒大小為4 400 

12、 bp,PAH基因CDS的大小為1 359 bp,理論上pTrcHis-PAH的大小為4 400+1 359=5 759 bp,酶切鑒定結(jié)果(圖3)與設(shè)計(jì)結(jié)果相符。    2.5   pMD18-T/PAH測(cè)序結(jié)果    測(cè)序結(jié)果表明pMD18-T/PAH序列與GeneBank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致, pMD18-T/PAH5端起始密碼子(ATG)和3端終止子(TAA)及兩側(cè)Kpn和EcoR限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列均完整。    2.6 

13、0; 重組表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果    測(cè)序結(jié)果表明pTrcHis-PAH質(zhì)粒序列與GeneBank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致, pTrcHis-PAH質(zhì)粒（圖）5端起始密碼子(ATG)和3端終止子(TAA)及兩側(cè)KpnI和EcoRI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列均完整, 序列完全正確，未見框移和突變(圖)。    3   討   論    PKU是1934年法國(guó)醫(yī)生Folling首次報(bào)道。PKU是常染色體隱性遺傳病，其致病基因PAH基因已經(jīng)成功分離、

14、克隆5。PAH基因定位于12號(hào)染色體(12q22-12q24.1)，大約由1.5 Mb堿基組成。PAH基因是斷裂基因，mRNA為2.4 kb，編碼區(qū)包含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。mRNA大小為1 353 bp，翻譯成含451個(gè)氨基酸的酶單體6,7。    PKU是由于PAH基因突變導(dǎo)致PAH酶的催化活性減弱或消失引起1。迄今全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PKU有524多種不同類型的突變（http:/www.mcgill.ca/pahdb）。1997年后PKU分子遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)為PAH基因突變的功能研究，即進(jìn)入PAH后基因組學(xué)研究，我國(guó)學(xué)者也在這個(gè)領(lǐng)域做了大量的工作，發(fā)現(xiàn)

15、了很多新的突變8。迄今全世界共發(fā)現(xiàn)70余種致病突變，導(dǎo)致PAH酶的催化功能減弱或消失，引起體內(nèi)苯丙氨酸的蓄積致病 9,10。    我們于2003年采用熒光PCR技術(shù)成功建立經(jīng)典型PKU的基因診斷方法11。鑒于目前國(guó)內(nèi)外研究PKU基因治療的報(bào)道尚少，為了探討PKU的新型基因治療方法，彌補(bǔ)PKU治療的缺陷，本研究采用基因工程技術(shù)，根據(jù)Genebank中PAHcDNA序列,自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物,分別在引物5端和3端設(shè)計(jì)KpnI和EcoRI酶切識(shí)別位點(diǎn),并添加保護(hù)堿基,擴(kuò)增包括目的基因在內(nèi)的全部序列,PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體構(gòu)建pMD18-T/PAH質(zhì)粒，KpnI

16、和EcoRI雙酶切鑒定后全長(zhǎng)測(cè)序證實(shí)pMD18-T/PAH質(zhì)粒序列完整、正確，即包含起始密碼、終止密碼及兩端的KpnI和EcoRI識(shí)別序列。pMD18-T/PAH質(zhì)粒雙酶解消化，目的基因片段定向克隆入pTrcHisB表達(dá)載體，藍(lán)白斑篩選挑白色菌落，PCR初篩后轉(zhuǎn)化入TOP10菌體中擴(kuò)增，抽提重組質(zhì)粒，Kpn和EcoR雙酶解鑒定，最后全長(zhǎng)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明我們獲得的pTrcHisB/PAH質(zhì)粒序列與GeneBank上PAH基因cDNA序列(GI:18765884)一致, 且pTrcHis/PAH質(zhì)粒中5端起始密碼子(ATG)和3端終止子(TAA)及兩側(cè)KpnI和EcoRI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列均

17、完整, 序列和方向完全正確，未見框移和突變,表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建為下一步重組蛋白的表達(dá)和純化研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前,該重組質(zhì)粒的表達(dá)及其重組蛋白的活性鑒定研究正在進(jìn)行之中?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  張 志,何蘊(yùn)韶.苯丙酮尿癥分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展 J. 遺傳, 2004, 26(5): 729-734.DING Z, HARDING C O, THONY B. State-of-the-art 2003 on PKU gene therapy J.Mol Genet Metab, 2004, 81(1): 1-2.HARDING C O, GILLINGHAM M B, HAMMAN K, et

18、 al. Complete correction of hyperphenylalaninemia following liver-directed, recombinant AAV2/8 vector-mediated gene therapy in murine phenylketonuria J. Gene Ther, 2006, 13(5): 457-462.OH H J, LEE H, PARK J W, et al. Reversal of gene expression profile in the phenylketonuria mouse model after adeno

19、associated virus vector mediated gene therapy J. Mol Genet Metab, 2005,86 Suppl 1:S124-32.WOO S L C, LIDSKY A S, GUTTLER F D, et al. Cloned human phenylalanine hydroxylase gene and allows prenatal diagnosis and carried detection of classical phenylketonuria J. Nature, 1983, 306(1):151-155.SCRIVER C R, WATERS P J, SARKISSIAN C, et al. PAHdb: a locus-specific knowledge base J. Hum Mutat, 2000, 15(1):