免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理

1、免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的抗體有哪些？免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個(gè) B 淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲彳#的免疫血清，是多個(gè) B 淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切

2、片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、竣甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行 IHC 染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱

3、法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是 pH6.0 的 0.01mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液。免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素一一抗生物素染色法最常用?？贵w交叉反應(yīng)的原因：指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的原因有以下幾個(gè)方面：1 .抗原特異性指用于免疫動(dòng)物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種

4、與上述物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。2 .共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。3 .決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系，某一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時(shí)的結(jié)合力小于吻合時(shí)的結(jié)合力。歡迎常到免疫版討論區(qū)做客我為人人，人人為我免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的概述*免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry,ICC）-是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分（主要是多肽和蛋白

5、質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為。（一）對(duì)抗原和抗體的要求- 具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件。- 對(duì)抗體的要求：純度高、比活性強(qiáng)；- 高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。- 對(duì)抗原的要求：純度高，免疫原性強(qiáng)，穩(wěn)定無(wú)變化。（二）抗原（antigen,Ag）- 抗原的概念：凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和（或）細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原?？乖哂袃蓚€(gè)方面的特性：- 免疫原性：引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋細(xì)胞的特性；- 免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。- 根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為：- 完全抗原：分子量較大，一般在 10kDa

6、以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。- 免疫原性最強(qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。- 半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。- 半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。載體- 通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。- 常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白（keyholelimpethemocyanin,KLH）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）等。- 用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過(guò)功能基團(tuán)-NH2、-COOH 等將

7、半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為 5kDa 結(jié)合 525 個(gè)分子的小肽。（三）抗體（antibody,Ab）1、抗體的概念：- 機(jī)體受到抗原刺激后， 由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白， 被稱為抗體。- 抗體主要存在于血清內(nèi)；- 抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。- 免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既 IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。2、免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體。- 單克隆抗體：是一個(gè) B 淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備的。- 特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。- 多克隆抗體：是將純化后的抗

8、原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè) B 淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。- 特異性低，會(huì)產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。- 多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機(jī)會(huì)。- 抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過(guò)量時(shí)，是不能聚合成大顆粒。3、抗體的制備多克隆抗體的制備* 動(dòng)物的選擇* 佐劑(adjuvant)* 免疫方法* 免疫劑量* 抗體效價(jià)的測(cè)定* 放血或定期抽血(1)動(dòng)物的選擇選擇什么動(dòng)物來(lái)免疫取決于：* 所需抗血清的量* 小鼠只能提供 1.01.5ml 的血液，而山羊能提供幾升。* 能供免疫用的抗原量* 小鼠 50?g 足夠，而山羊需要幾毫克。(1)動(dòng)

9、物的選擇(續(xù))* 動(dòng)物的品系：免疫動(dòng)物與提供抗原的動(dòng)物之間的種系差異越大越好。* 例如哺乳動(dòng)物的抗原可選擇非哺乳動(dòng)物來(lái)制備抗體。* 常用的動(dòng)物有兔、羊、馬、豬等，以兔(新西蘭兔，年輕，健壯，體重在 2.5kg 左右，雄性)為最常用。(2)佐劑(adjuvant)* 一般可溶性抗原注射后，迅速?gòu)淖⑸洳课粩U(kuò)散、吸收代謝。佐劑可延長(zhǎng)潴留時(shí)間，且延長(zhǎng)免疫刺激作用。因此在制備抗體的過(guò)程中，常將抗原和佐劑一起注射。* 最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為：* 弗氏不完全佐齊 U(Freund/sincompleteadjuvant)* 弗氏完全佐齊 U(Freund/scompleteadjuvant)弗氏不完

10、全佐劑(Freund/sincompleteadjuvant,FIA)* 是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或 Tween80)混合而成，比例為 1:1、2:1、3:1 或 5:1,可根據(jù)需要而定，通常 2:1。* 使用時(shí)與水溶性抗原按 1:1 比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。弗氏完全佐劑(Freund/scompleteadjuvant,FCA)* 在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌(終濃度為 220mg/ml),即成為FCA。* 免疫動(dòng)物時(shí)，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化后(油包水)注入動(dòng)物。* 一般首次注射時(shí)用完全佐劑乳化，第二次或第三次注

11、射時(shí)用不完全佐劑或不用佐劑。佐劑與抗原乳化的方法* 研磨法：適于制備大量的佐劑抗原* 先將不完全佐劑加熱，取 1.73ml 放人無(wú)菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩滴入 0.23ml 活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。* 按同樣方法滴人抗原，每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應(yīng)成為乳白色粘稠的油包水乳劑。* 缺點(diǎn)：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對(duì)微量或難得抗原不宜采用。佐劑與抗原乳化的方法(續(xù))* 注射器混合法-將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個(gè) 5ml 注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動(dòng)針管混勻，往復(fù)操作直至形成粘稠的乳劑為止。*優(yōu)點(diǎn)：無(wú)菌操作，節(jié)省抗原或

12、佐劑。*缺點(diǎn)：不易乳化，時(shí)間長(zhǎng)。佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)）*快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。-將抗原和佐劑按所需量加入一離心管中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm,離瓶底 0.5cm 左右，以免打碎離心管。-每次乳化 1015s,然后置冰箱 lmin 左右。反復(fù)乳化 34 次即可完全乳化。管內(nèi)殘余量 800r/min 離心 510min 收集。*優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、節(jié)省材料。乳化劑的鑒定*判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上（冷水中），如能長(zhǎng)時(shí)間保持圓珠形而不散開(kāi)，表示乳化達(dá)到要求。（3）免疫方法一一免疫途徑*常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、

13、淋巴結(jié)、腳掌等注射。*一般采用多點(diǎn)注射方法-常在足、掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部?jī)蓚?cè)、頜下、耳后等處的皮內(nèi)或皮下。-皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于提高抗體的效價(jià)。（3）免疫方法一一免疫途徑（續(xù)）*幾點(diǎn)說(shuō)明：-大動(dòng)物一般不用腹腔注射-顆?？乖褪褂米魟r(shí)不能靜脈注射-抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，只需 10100?g 抗原即可獲得較好的免疫效果。-皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時(shí)更難注入。（3）免疫方法一一次數(shù)及間隔時(shí)間*次數(shù)一般為 23 次（初次免疫和加強(qiáng)免疫）-首次注射后，1015 天再加強(qiáng)注射；-劑量同首次或?yàn)槭状蔚囊话?，用不全佐劑或不用佐劑?間隔時(shí)間，一般而言，動(dòng)物越大，間隔越長(zhǎng)-豚鼠、大

14、鼠為 78 天，兔子為 1015 天，羊?yàn)?1428 天；-第三次注射的間隔時(shí)間更長(zhǎng)些，效果更好。舉例 1:家兔的免疫*初次免疫-用 50200?gAg 加入 FCA,在背部皮下注射 68 點(diǎn)，每點(diǎn) 0.10.2ml,也可肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射；*兩周后，加強(qiáng)免疫-將 50200?gAg 于 PBS 或 FIA 中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射；*抗體效價(jià)的檢測(cè)：加強(qiáng)免疫一周后，耳緣靜脈采血-抗體效價(jià)測(cè)定可用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、瓊脂雙向擴(kuò)散法等方法。前者抗體效價(jià)在 1:4000 以上，后者在 1:16 以上，即可采血，取血清進(jìn)一步提純。舉例 2:微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔*一般選擇 2.53.0kg

15、的新西蘭種公兔-先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑 0.2ml（卡介苗每兔合 5mg）;-10 天后，見(jiàn)胭窩淋巴結(jié)腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化；-以后每隔 20 天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強(qiáng) 2 次，各次注射的抗原均為 2550?g;-末次注射兩周后兔耳放血測(cè)價(jià)（可達(dá) 1:128）。舉例 3:豚鼠和大鼠的免疫*初次免疫-用 10100?gAg 加入 FCA,在背部皮內(nèi)注射 46 點(diǎn)，每點(diǎn) 0.lml,也可肌肉內(nèi)或皮下注射；*加強(qiáng)免疫-每隔 78 天，將 1050?gAg 于 PBS 或 FIA 中。在肌肉、皮下或靜脈注射；*抗體效價(jià)的檢測(cè)（

16、4）免疫劑量*抗原性強(qiáng)的抗原量應(yīng)小，過(guò)大反會(huì)引起免疫抑制；*免疫周期長(zhǎng)的動(dòng)物可少量多次注射，短的可大量少次。（4）免疫劑量（續(xù)）* 各種動(dòng)物首次免疫抗原劑量和加強(qiáng)免疫的劑量（5）抗體效價(jià)的檢測(cè)多采免疫雙向擴(kuò)散法【基本原理】* 指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都擴(kuò)散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。-將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個(gè)相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進(jìn)行相互擴(kuò)散，當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時(shí)，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線。* 優(yōu)缺點(diǎn)：簡(jiǎn)便，但敏感性較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。免疫雙向擴(kuò)散法的操作步驟* 將玻璃板用水洗凈后用 75%乙醇沖洗，晾干后放在水平臺(tái)上備用。* W1%agar 融化后，置 5

17、6c 水浴。* 在玻璃板上鋪膠，約 1.5mm 厚，凝固后打孔（直徑 3rnm）,孔間距 10mm。* 中心孔加 5?l 抗原樣品，周圍孔內(nèi)每孔加 5?l 抗血清（抗體預(yù)先作系列倍比稀釋即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32 等比例）。* 凝膠板置濕盒內(nèi)，室溫?cái)U(kuò)散 24h。* 觀察結(jié)果?？贵w效價(jià)檢測(cè)的其它方法* 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用；* 對(duì)流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴(kuò)散法敏感，較簡(jiǎn)便、實(shí)用；* 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。放血或定期抽血常用以下 3 種方法* 頸動(dòng)脈放血法：放血量較多，動(dòng)物不易中途死亡。例如：2.5kg 白兔可放血約 80ml。家兔、山羊、綿羊等動(dòng)

18、物采血常用此法。* 心臟采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動(dòng)物，但操作不當(dāng)易引起動(dòng)物死亡。* 靜脈采血：家兔可用耳緣靜脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這種放血法可隔日 1 次，有時(shí)可采集多量血液。放血或定期抽血（續(xù)）* 采血過(guò)程中，動(dòng)作要輕柔，盡量避免溶血* 血液凝固后，及時(shí)離心收集血清，否則細(xì)胞溶解釋放的雜蛋白（例如蛋白水解酶）將污染抗體并將抗體水解，降低效價(jià)；* 加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護(hù)劑如 BSA、甘油等。二、組織和細(xì)胞標(biāo)本的制備* 標(biāo)本制備恰當(dāng)，是免疫組化成功的首要條件* 免疫組化對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求* 保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)；* 在原位最大

19、程度地保持待測(cè)抗原（或抗體）的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。* 免疫組化的組織和細(xì)胞標(biāo)本，制作流程與常規(guī)處理方法基本相同，但對(duì)組織、細(xì)胞的處理又有其特殊要求及注意事項(xiàng)。* 各種抗原由于其含量及特性的差異對(duì)標(biāo)本處理方式常有不同要求， 因此要選擇適用于本實(shí)驗(yàn)的最佳方法。免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本* 組織標(biāo)本* 石蠟切片* 冰凍切片* 細(xì)胞標(biāo)本* 組織印片* 細(xì)胞培養(yǎng)片（細(xì)胞爬片）* 細(xì)胞涂片（一）石蠟切片* 石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法* 最大優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；* 石蠟塊還能長(zhǎng)期存檔，供回顧研究。* 石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織

20、內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過(guò)某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)* 標(biāo)本新鮮：一般在 2h 以內(nèi)進(jìn)行，超過(guò) 2h,組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散。* 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時(shí)應(yīng)有抗原陽(yáng)性和陰性區(qū)，以形成自身對(duì)照。* 細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時(shí)應(yīng)盡可能避開(kāi)壞死區(qū)。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)（續(xù)）* 避免擠壓：取材時(shí)組織受擠壓可使邊緣部細(xì)胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因而取材時(shí)應(yīng)使用鋒利的刀刃；* 鐐?cè)〗M織動(dòng)作

21、要輕；* 經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過(guò)度擠壓，觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)有所考慮。2、固定及常用的固定液* 取材后的組織需立刻投于固定劑中* 固定使組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)；* 對(duì)免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。* 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。* 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）* 醇類（常用乙醇）* 其它（丙酮）（1）醛類* 甲醛（福爾馬林）應(yīng)用最廣* 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。* 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，組織收縮少。* 缺點(diǎn)：* 甲

22、醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液 pH 降低，影響染色；* 醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成竣甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；* 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。* 注意事項(xiàng)：* 縮短固定時(shí)間，降低固定溫度（4?C）,為此組織塊不宜過(guò)厚。* 改用中性緩沖福爾馬林，以 pH 值 7.27.40.01mol/L 的磷酸鹽緩沖液配制成 10%甲醛固定液，減少固定液 pH 的變化。* 固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。* 切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)（抗原修復(fù)）。* 戊二醛：* 穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對(duì)抗原有一

23、定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。* 多聚甲醛(常用 4%):* 可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。* 主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。(2)醇類* 最常用的醇類固定劑是乙醇。* 其固定作用：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。* 優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存好。* 缺點(diǎn)：* 脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)(2h 內(nèi))。* 乙醇使蛋白變性的作用輕， 固定后可再溶解； 染色過(guò)程中， 溫育時(shí)間長(zhǎng)， 抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。(3)其它固定劑* 丙酮：* 對(duì)抗原性的保存好，但脫

24、水性更強(qiáng)，較少用于組織標(biāo)本，但細(xì)胞爬片常用丙酮固定。3-抗原修復(fù)一一原因* 常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果使得：* 抗原性物質(zhì)形成醛鍵、竣甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；* 蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。* 要求：在染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3-抗原修復(fù)方法* 化學(xué)方法*加熱方法-水浴加熱法-微波照射法-高壓加熱法-酸水解法(1)化學(xué)方法*主要是通過(guò)一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。-胰蛋白酶：一般使用濃度為 0.05%0.1%,消化時(shí)間為 37?C,1040min,主要用于細(xì)胞內(nèi)抗

25、原的顯示；-胃蛋白酶： 一般使用濃度為 0.1%0.4%,消化時(shí)間為 37?C、 30180min,主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。*例如：Laminin、CollagenIV(2)水浴加熱法*將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù) 1015 分鐘。-優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實(shí)驗(yàn)室，-缺點(diǎn)：對(duì)封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3)微波照射法*將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至 95c 以上，持續(xù) 1015 分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行。*此方法由于微波場(chǎng)內(nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動(dòng)，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，且因分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)熱、效率高、時(shí)間短，

26、對(duì)抗原再現(xiàn)效果好。(4)高壓加熱法暴露抗原*將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓*由于高壓下受熱均勻，特別使用于大批量標(biāo)本的染色。(1)酸水解法*酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原。*將玻片浸入 1mo1/LHC1 溶液中，室溫作用 20min(溫度升高，作用時(shí)間縮短)。*此法能增強(qiáng)特異性染色，降低背景，但需注意水解過(guò)度將破壞抗原性及形態(tài)結(jié)構(gòu)。加熱法的注意事項(xiàng)*達(dá)到規(guī)定的溫度(9295?C 以上)；*維持一定的時(shí)間；*避免切片干涸(抗原可能完全丟失)；*加熱后必須經(jīng)過(guò)室溫自然冷卻 2030 分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型；*修復(fù)液：-最常用的是 pH6.0 的 0.01mo1/L 的枸檬酸

27、鹽緩沖液；-最新研究表明堿性修復(fù)液更有效，推薦使用 1mM 的 EDTA 緩沖 3夜(pH8.0)。4、載玻片的處理*抗原修復(fù)過(guò)程中，由于高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。-新載玻片上有油污，要用洗液浸泡 1224h,自來(lái)水沖洗后再用蒸儲(chǔ)水清洗；用綢布擦干或烤箱烤干。清潔的載玻片再用粘附劑處理。*常用的粘附劑有：-APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)-Polv-L-Lysine(多聚賴氨酸)-銘明膠溶液APES(3-aminopropyltriethoxysilane)3-氨丙基三乙氧基硅烷*現(xiàn)用現(xiàn)配。用純丙酮或甲醇配制 2%APES(v/v);*將洗凈

28、的玻片浸于此液中 2030 秒鐘；*取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結(jié)合的 APES,置通風(fēng)櫥中晾干或 60?C 烤箱烤干。Polv-L-Lysine(多聚賴氨酸)*將清潔玻片浸于 100?g/ml(10%w/v)的多聚賴氨酸溶液中(去離子水稀釋)，37?C 放置30min,然后 60?C 烤箱烘烤 1h 或室溫過(guò)夜干燥。裝盒備用。銘明膠溶液*試劑：銘明磯(chromealum)0.25g明膠(gelatine)2.5g蒸儲(chǔ)水 500ml*先將銘明磯溶解于 40?C 少量蒸儲(chǔ)水中，再加入明膠及蒸儲(chǔ)水，可在 70?C 水浴中使明膠溶化，攪拌均勻后，即可使用。如有殘?jiān)?，可過(guò)濾后再用。*用時(shí)稍加

29、溶化，切片浸入 23min,過(guò)夜晾干。(二)冰凍切片*冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接切片。*在切片前組織不經(jīng)過(guò)任何化學(xué)藥品處理或加熱過(guò)程。-縮短了制片時(shí)間-抗原性不受損失*對(duì)穩(wěn)定性差的抗原，如淋巴細(xì)胞表面抗原尤其適合。*組織凍結(jié)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)、外的水分會(huì)形成冰晶，凍結(jié)的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴(yán)重影響組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此制備凍塊時(shí)要求低溫、速凍。1、冰凍組織塊的常用方法*液氮中冰凍：組織投入液氮中（一 196?C）中 1020sec；*干冰中加入丙酮（或異戊烷），液體立即氣化起泡，溫度降至一 70?C,將組織投入，若在干冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內(nèi)結(jié)凍則更好；-上

30、述組織在速凍時(shí)應(yīng)浸埋于 OCT 包埋劑或甲基纖維素糊狀液內(nèi)，以保護(hù)組織。-制成凍塊后若需保存，應(yīng)以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存于-70?C 冰箱。2、切片*供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，并有連續(xù)性。*載玻片也應(yīng)清潔無(wú)油污，但一般無(wú)需涂抹粘附劑；*切片時(shí)，使用恒溫冷凍切片機(jī)，在箱內(nèi)溫度-25?C。切片厚度一般為 48?m。3、切片后處理*切好的冰凍切片，室溫下自然晾干 12h 后，入 4?C 丙酮固定 10min,待干燥后作免疫組化染色或封存于-20C。*冰凍切片由于切片技術(shù)要求較高，不易得到連續(xù)性很好的切片，其形態(tài)結(jié)構(gòu)亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便于長(zhǎng)期貯存，因此冰凍切片的應(yīng)用受限。（三

31、）組織印片*將潔凈載玻片輕壓于已暴露病灶的新鮮組織切面，細(xì)胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定 10min,自然干燥后染片或-20C 保存。（四）細(xì)胞培養(yǎng)片（細(xì)胞爬片）*貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)，達(dá)適當(dāng)密度后取出固定（丙酮-20?C 固定 1020min）,再進(jìn)行免疫染色。-蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時(shí)間 2h 即可。-為了防止細(xì)胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。（五）細(xì)胞涂片*大多數(shù)細(xì)胞涂片由細(xì)胞懸液制成，包括：-血液、尿液、腦脊液；-體腔積液；-組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結(jié)或其他實(shí)質(zhì)性組織-懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或貼壁細(xì)胞經(jīng)消化后形成的懸液。（五）細(xì)胞涂

32、片（續(xù)）*細(xì)胞涂片的方法：-手涂法*將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到 106/ml 左右，可直接涂于載玻片上，但要均勻、不重疊。*圖片范圍應(yīng)小于 1cm 直徑，以節(jié)約試劑。-涂片機(jī)涂片法*將細(xì)胞樣品制成 2X1056/ml 細(xì)胞懸液， 吸取 50100?l （12X1045cells） 加入涂片機(jī)內(nèi)， 1000rpm離心 2min 后細(xì)胞就均勻分布于玻片上。三、免疫組化常用的染色方法*根據(jù)標(biāo)記物的不同分為-（一,）免疫熒光法-（二）免疫酶標(biāo)法-（三）親和組織化學(xué)法（一）免疫熒光法【原理】*用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原；*熒光素經(jīng)某種特定波長(zhǎng)的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長(zhǎng)更

33、長(zhǎng)而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤；*借助于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。1、常用的熒光素* （1）異硫氟酸熒光素（FluoresceinIsothiocyanate,FITC）* （2）四甲基異硫鼠酸羅丹明（TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC）* （3）四乙基羅丹明（RB200）* （4）碘化丙咤（propidiumiodide,PI）（1）異硫氟酸熒光素（FITC）*易溶于水和乙醇。*最大吸收光譜為 490495nm,最大發(fā)射光譜為 520530nm,呈翠綠色熒光，分子量389.4。在堿性條件下，F(xiàn)ITC 的異硫氟酸基在水溶液中與 Ig 的自由

34、氨基形成共價(jià)鍵，成為標(biāo)記的熒光抗體。一個(gè) lgG 分子上最多能標(biāo)記 1520 個(gè) FITC 分子。（2）四甲基異硫鼠酸羅丹明（TRITC）最大吸收光譜 550nm,最大發(fā)射光譜 620nm,呈紅色熒光，分子量為 444。與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式同 FITC。四乙基羅丹明（RB200）*不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。*最大吸收光譜為 570nm,最大發(fā)射光譜為 595600nm,呈橙紅色熒光，分子量為 580。*RB200 在五氯化磷（PCl5）作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl）,在堿性條件下，易與蛋白質(zhì)的賴氨酸?-氨基反應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。碘化丙咤（PI）*是常用的 DNA 熒光標(biāo)記探針，可作為 FI

35、TC 的胞核對(duì)比染色。*PI 可嵌入到雙鏈 DNA 和 RNA 堿基對(duì)中并與之結(jié)合，但對(duì)堿基無(wú)特異性選擇。*最大吸收光譜是 493nm,最大發(fā)射光譜是 630nm,呈紅色熒光。2、熒光抗體的保存*一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發(fā)猝滅。-一般認(rèn)為 04?C 可保存 12 年，-20?C 可保存 34 年。-要小量分裝，防止反復(fù)凍融。-保存前需加防腐劑（濃度為 1:500010000 的硫柳汞或 1:10005000 疊氮化鈉）。3、免疫熒光的染色方法*免疫熒光染色法常用的有-直接法-間接法原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)直接免疫熒光法的操作步驟標(biāo)本的處理：細(xì)胞涂

36、片、細(xì)胞爬片浸入冷丙酮或 4%的多聚甲醛固定 10min,然后用 0.01MPBST（含0.1%TritonX-100pH7.4）漂洗 5minx3/次；石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用 0.01MPBST 漂洗 5minX3/次；2%BSA 或 10%BSA37?C 濕盒內(nèi)封閉 30min抗體染色：-在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體（1:8 或 1:16 稀釋），放在濕盒中，37?C 孵育 30min；?直接免疫熒光法的操作步驟（續(xù)）0.0lmol/LPBS（pH7.4）漂洗 5minx3/次，不時(shí)震蕩（洗去多余游離的熒光素標(biāo)記的抗體）。緩沖甘油封片分析純無(wú)熒光的甘油

37、 9 份+pH9.2,0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制。鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察。（用來(lái)檢測(cè)未知抗原）優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測(cè)多種抗原需制備多種相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體。?直接免疫熒光法的注意事項(xiàng)對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度；一般稀釋度不應(yīng)超過(guò) 1:20,抗體濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察。?直接免疫熒光法的注意事項(xiàng)（續(xù)）染色溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化；染色時(shí)間：從 10min 到數(shù)小時(shí)，一般 30min;染色溫度：多采用室溫（25?C）,高于 37?C

38、 可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用 0-2?C 的低溫，延長(zhǎng)染色時(shí)間。低溫染色過(guò)夜較 37?C30min 效果好的多。?直接免疫熒光法的注意事項(xiàng)（續(xù)）試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下列對(duì)照：自發(fā)熒光對(duì)照（空白對(duì)照）：標(biāo)本加 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 代替一抗。陽(yáng)性對(duì)照：用已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。若標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。?直接免疫熒光法的注意事項(xiàng)（續(xù)）一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò) 3min,就有熒光減弱現(xiàn)象

39、；經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。（2）間接法又稱為熒光抗-抗體法?需要兩種抗體參與，即一抗和二抗（熒光素標(biāo)記）。一抗對(duì)標(biāo)本中的抗原來(lái)說(shuō)起抗體的作用，但對(duì)熒光標(biāo)記的二抗來(lái)說(shuō)又起著抗原作用。-可用來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中未知抗原，也可檢測(cè)血清中未知抗體。?間接免疫熒光法操作步驟*標(biāo)本的處理及非特異染色的封閉同直接法；*一抗染色：-加未標(biāo)記的特異性抗體（通常 1:100 稀釋，用 0.01MpH7.4 的 PBS 稀釋），37?C 作用 30min或 4?C 過(guò)夜。0.01MPBST 漂洗 5minX3 次（震蕩漂洗）；?間接免疫熒光法操作步驟（續(xù)）加熒光標(biāo)記的二抗抗體，3

40、7?C 濕盒避光作用 30min。0.01MPBST 避光漂洗 5minX3 次（例如包上錫紙，在搖床上漂洗）；甘油緩沖液封片鏡檢*優(yōu)點(diǎn)：敏感性較高，比直接法高 10 倍左右；制備一種熒光標(biāo)記抗體，可應(yīng)用于多種一抗；*缺點(diǎn)：是參加反應(yīng)的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機(jī)會(huì)增多。?間接免疫熒光法的注意事項(xiàng)*熒光染色后一般在 1h 內(nèi)完成觀察，或于 4c 保存 4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱。*每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：-陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物-陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物-熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物?間接免疫熒光法的注意事項(xiàng)（續(xù)）*標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免

41、干燥。*一抗和二抗應(yīng)始終保持在標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。（二）免疫酶酶標(biāo)法【原理】*以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位；*酶降解底物的量與色澤濃度成正比。可反映被測(cè)定的抗原或抗體的量。1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物*辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）及底物*堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）及底物（1）辣根過(guò)氧化物酶（HRP）及底物*HRP 是應(yīng)用最廣的一種酶，來(lái)源于植物辣根，由無(wú)色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結(jié)合而成，分子量約 40kDa,穩(wěn)定性好；*底物為過(guò)氧化物和

42、供氫體（DH2）-過(guò)氧化物：常用過(guò)氧化氫和過(guò)氧化氫尿素。-供氫體：多用無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)生成有色的氧化型染料，最常用的供氫體是DAB。DAB（二氨基聯(lián)苯胺）*DAB 本身無(wú)色，反應(yīng)后呈棕色，不溶于水，不易褪色，電子密度高，最為常用。*目前已經(jīng)有商品化的試劑盒，使用起來(lái)非常方便。（2）堿性磷酸酶（AP）及底物*AP 為磷酸酯的水解酶，可通過(guò)兩種反應(yīng)顯色：-偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，底物為？-蔡酚磷酸鹽，經(jīng)水解后得？-蔡酚，與重氮化合物如堅(jiān)牢藍(lán)（fastblue）或堅(jiān)牢紅（fastred）形成不溶性沉淀，分別呈蘭色或紅色。-靛藍(lán)-四口坐反應(yīng)：底物為澳氯羥口引味磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-

43、3-indodylphosphate,BCIP）,經(jīng)酶水解并氧化形成靛藍(lán)，而氮藍(lán)四吵（NBT）在此氧化過(guò)程中被還原成不溶性紫蘭色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法*又分為以下兩種方法：-酶標(biāo)抗體法*直接法*間接法-非標(biāo)記抗體酶法*酶橋法*PAP 法（1）酶標(biāo)抗體法*通過(guò)共價(jià)鍵將酶結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，與標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)后，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。-優(yōu)點(diǎn)：切片能長(zhǎng)期保存、反復(fù)觀察，適于鏡下半定量分析。-缺點(diǎn)：酶與抗體形成的共價(jià)鍵，可損害抗體和酶的活性；易產(chǎn)生非特異染色。（1）酶標(biāo)抗體法一一直接法?將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相

44、應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。（1）酶標(biāo)抗體法一一間接法*將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗（酶標(biāo)抗體）與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟*標(biāo)本準(zhǔn)備：-石蠟脫蠟至水；-冰凍切片浸入 4?C 丙酮固定 10min,0.01MPBST 漂洗，5minX3;-細(xì)胞爬片先用 PBS 洗，然后 4?C 丙酮固定 10min,再 0.01MPBST 漂洗，5minX3;*石蠟切片需要進(jìn)行抗原修復(fù)，其它標(biāo)本則不用；（2）酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟（續(xù)）*封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育 510min（濕盒內(nèi)）；*0.01MPBST 漂洗，5minX3;*510%正常山羊血清（0.01MPBS 稀釋）封閉，室溫孵育 30min（濕盒內(nèi)）；*傾去血清勿洗，力口 1%BSA（PBST 配制）稀釋的一抗，37?C 孵育 60min 或 4?C 過(guò)夜（濕盒內(nèi)）；（2）酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟（續(xù)）0.01MPBST 漂洗，5minX3;HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育 lh 或 37?C30min;加 0