反轉(zhuǎn)錄的原理及應(yīng)用(1)

1、2016年11月吳思思原原理理酶酶過(guò)過(guò)程程意意義義本實(shí)本實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)所用的用的技術(shù)技術(shù)12345頁(yè)碼 RNA RNA反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄6注意注意事項(xiàng)事項(xiàng) RNA RNA反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄原理原理反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscripatase),合成DNA的過(guò)程，是DNA生物合成的一種特殊方式。問(wèn)題1：反轉(zhuǎn)錄酶是指代哪些？是特定的一個(gè)還是多個(gè)酶共同作用？答：反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，一種是來(lái)源于哺乳動(dòng)物，另一種來(lái)源于鳥(niǎo)類(lèi)。哺乳類(lèi)的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈；鳥(niǎo)類(lèi)的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。所以反轉(zhuǎn)錄酶是特定的一個(gè)酶，但是它具有多種活性，在反轉(zhuǎn)錄不同階段中發(fā)揮不同的作用。 RNA RNA

2、反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄原理原理注：反轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄不等同。反轉(zhuǎn)錄是進(jìn)行基因工程過(guò)程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過(guò)程；逆轉(zhuǎn)錄是RNA類(lèi)病毒自主行為，在整合到宿主細(xì)胞內(nèi)以RNA為模板形成DNA的過(guò)程。二者雖同為RNADNA的過(guò)程，但地點(diǎn)不同，相對(duì)性的來(lái)說(shuō)，反轉(zhuǎn)錄在體外，逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi)。 RNARNA反反轉(zhuǎn)錄過(guò)轉(zhuǎn)錄過(guò)程程 反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄酶（酶（RDDP)RDDP)的活性的活性反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄酶錄酶以RNA為模板，催化dNTP聚合成cDNA反轉(zhuǎn)錄酶RNase H從RNA5端水解掉RNA分子RNase H活性以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條cDNA單鏈為模板，再合成第二條cDNA分子DNA指

3、導(dǎo)的DNA聚合酶活性問(wèn)題2：反轉(zhuǎn)錄酶能不能現(xiàn)在進(jìn)行生物體外技術(shù)合成？答：反轉(zhuǎn)錄酶是生物中提取的。還不能自主合成。 反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的生物的生物學(xué)學(xué)意意義義（1）對(duì)分子生物學(xué)的中心法則進(jìn)行了修正和補(bǔ)充（2）在致癌病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了癌基因，在人類(lèi)一些癌細(xì)胞如膀胱癌、 小細(xì)胞肺癌等細(xì)胞中，也分離出與病毒癌基因相同的堿基序列，稱(chēng)為細(xì)胞癌基因或原癌基因。癌基因的發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)病機(jī)理的研究提供了很有前途的線索。（3）在實(shí)際工作中有助于基因工程的實(shí)施。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備，可將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成cDNA用以獲得目的基因。 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用RT-PCRRT-PCRRT-PCR又稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄PCR。是將RNA

4、的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。其原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的RNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得大量的cDNA。問(wèn)題3：cDNA與DNA的區(qū)別答：cDNA就是由成熟mRNA經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程而成反轉(zhuǎn)錄的DNA,與正常DNA相比區(qū)別是內(nèi)部無(wú)內(nèi)含子等結(jié)構(gòu)。 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用RT-PCRRT-PCR問(wèn)題4：為什么選dT引物？答：真核生物的mRNA都有個(gè)PolyA的尾端，dT引物能識(shí)別這個(gè)尾端并且結(jié)合上去。 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用RT-PCRRT-PCR引物 隨機(jī)六聚體引物：對(duì)總

5、RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 Oligo(dT)：對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 操作操作RT-PCRRT-PCR以本實(shí)驗(yàn)下丘腦以本實(shí)驗(yàn)下丘腦c-fos mRNA表表達(dá)測(cè)定為列。達(dá)測(cè)定為列。在微量在微量EP管中加入以下反應(yīng)溶液：管中加入以下反應(yīng)溶液：步驟1dT 引物dNTP 混合物處理過(guò)RNA酶的水 操作操作RT-PCRRT-PCR以本實(shí)驗(yàn)下丘腦以本實(shí)驗(yàn)下丘腦c-fos mRNA表表達(dá)測(cè)定為列。達(dá)測(cè)定為列。反應(yīng)結(jié)束后在冰上急速冷卻，并加入以下試劑：反應(yīng)結(jié)束后在冰上急速冷卻，并加入以下試劑：步驟2得到得到cDNA引物 RNA 酶抑制劑反轉(zhuǎn)錄酶處理過(guò)RNA酶的水 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用RT-PCRRT-PCRPCR儀1、按

6、PCR 儀正面左下角電源開(kāi)關(guān)，啟動(dòng) PCR 儀。2、放 PCR 離心管。3、反向重復(fù)第二步驟將頂蓋板向后拉，蓋好頂蓋。4、按 F2“Create”新建一個(gè)擴(kuò)增的 PCR 程序。5、按控制臺(tái)面右方上下左右方向鍵，可隨意移動(dòng)編輯位置，輸入需要的溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。6、據(jù) PCR 離心管中加入的反應(yīng)體積總量，在“Reaction volume”后輸入相應(yīng)數(shù)值，有 Std“1100ul”和 9600“150ul”兩檔可供選擇。7、按 F1“Start”啟動(dòng)8、按“INFO”對(duì)應(yīng)鍵查看 PCR 結(jié)束鍵。9、擴(kuò)增完成后按臺(tái)面左方“Stop”鍵退出。10、按“Hist”，可查看上次擴(kuò)增的歷史記錄。11、完全退出后，按臺(tái)面左下方電源開(kāi)關(guān)，拔出插銷(xiāo)，切斷電源。 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用RT-PCRRT-PCR1 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂。2 防止DNA的污染，采用DNA酶處理RNA樣品。3. 防止蛋白質(zhì)的污染注意事項(xiàng) 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用擴(kuò)擴(kuò)展展QPCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。 技技術(shù)應(yīng)術(shù)應(yīng)用用擴(kuò)擴(kuò)展展QPCRQPCR所以通過(guò)RT-RCR與Q-PCR聯(lián)用的QRT-PCT可以測(cè)定基因的表達(dá)量。首先通過(guò)RT-PCR從mR