病毒感染細(xì)胞篩選

1、細(xì)胞篩選一 嘌呤霉素（ 一 ） 確定最優(yōu)篩選濃度當(dāng)用于篩選特定細(xì)胞的嘌呤霉素合適濃度未知時，需進(jìn)行滴定，或制定針對那種細(xì)胞的嘌呤霉素殺菌曲線。 一般而言， 嘌呤霉素濃度范圍在2-10 微克 / 毫升時是足以殺滅大多數(shù)未轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞系。 1. 培養(yǎng)待轉(zhuǎn)染（而不是轉(zhuǎn)染后）的細(xì)胞。 （篩選的目的是殺滅未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞） 2. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞 （一般在鋪滿培養(yǎng)器皿底部的7080%時），用新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基制成1.5 x 105個 的細(xì)胞懸液。3. 向 96 孔培養(yǎng)板中加細(xì)胞懸液，每孔 100 微升（使每孔細(xì)胞數(shù)在1.5 X 104個），然后向每孔加新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基適量，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)

2、過夜。 （這樣做是為了保證在固定細(xì)胞密度下確定最佳G418藥物篩選濃度。）4. 第二天用嘌呤霉素濃度分別為 0,2, 4,6,8,10 微克/ 毫升的新鮮無抗無血清培養(yǎng)基溶液替換各孔中的舊的培養(yǎng)基。 （每個濃度可用兩個復(fù)孔， 相當(dāng)于每個濃度測定三次） 。（注意： 對于多數(shù)細(xì)胞種類而言， 過量的嘌呤霉素能引起許多非必需的表型的反應(yīng)。 ）5. 每日檢查細(xì)胞活力， 根據(jù)細(xì)胞活力， 每三天 （ 即每隔兩天）更換含嘌呤霉素的新鮮無抗無血清培養(yǎng)基溶液一次。如細(xì)胞生長過快，可以縮短換液時間（每隔一天）6. 在正常的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程時 ， 一種細(xì)胞最優(yōu)篩選濃度的確立時間隨細(xì)胞的生長率和一般生存時間而定，大概需 3

3、 到 14 天。在所需時間之后，嘌呤霉素的導(dǎo)致所有細(xì)胞死亡的最小濃度就是應(yīng)該用于該細(xì)胞和該實(shí)驗(yàn)的濃度。 最優(yōu)濃度為在 3-5 天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的濃度。（ 二 ） 轉(zhuǎn)染細(xì)胞1. 第一天：在60 培養(yǎng)皿內(nèi)種植細(xì)胞，細(xì)胞密度為能使第二天細(xì)胞融合能達(dá)到7080%的密度，2 孵箱過夜培養(yǎng)。2. 第二天： 準(zhǔn)備 3 無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基， 加入使其終濃度為8以o將已經(jīng)制備的病毒顆粒0.5 加至上述培養(yǎng)基， 輕吹混勻。 去除 60培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基。 （能夠增加病毒感染的效率，然而，有時候?qū)?xì)胞有毒性。這時，可以用 代替）（ 三 ） 篩選細(xì)胞1. 病毒感染后 24 小時，可以換用含最優(yōu)濃

4、度的培養(yǎng)基。2. 如果病毒對細(xì)胞有毒性， 可以減少感染時間至4-6 小時， 然后換用新鮮培養(yǎng)基， 24-48 小時后換加含最優(yōu)濃度的培養(yǎng)基。最好設(shè)立一個對照皿，不加病毒液，加入，觀察是否對細(xì)胞有毒性；如果沒有毒性，還可以加入，作為是否有效的對照。3. 以后每隔一天換用新鮮含的無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基， 以替換含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。直到抗性群落能被識別出（一般是在篩選后 10 到 12 天） 。4. 待抗性細(xì)胞長滿以后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入10 培養(yǎng)皿，同時，留一部分細(xì)胞在原來的 60 平皿內(nèi)。 5.60 平皿內(nèi)細(xì)胞長滿后，收獲細(xì)胞，在蛋白或水平鑒定基因敲低效率。6.10 培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞待長滿后傳代，首先每種穩(wěn)

5、定細(xì)胞系凍存 4-5 支細(xì)胞，待基因敲低鑒定清楚后，解凍凍存細(xì)胞，進(jìn)行表型觀察分析。通常情況下，由于慢病毒為復(fù)制缺陷型病毒， 受感染的細(xì)胞不能產(chǎn)生新的病毒， 因此從加入病毒顆粒開始，經(jīng)過5-6 次換液后，培養(yǎng)基內(nèi)已不存在病毒顆粒，可以移至普通細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)研究。二 G418（ 一 ） 確定最優(yōu)篩選濃度由于每種細(xì)胞對G418 的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的 G418 的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。1.G418的配制： 取1g G418溶于11的液，加蒸儲水定容至10 （使G418終濃度為0.1 終濃度為 100） ，過濾消毒， 4 度保存。的化

6、學(xué)全稱為羥乙基呱嗪乙硫磺酸（ N -） ，分子量238.31 ， 是一種氫離子緩沖劑， 能較長時間的控制溶液的處于恒 定的范圍，而對細(xì)胞無毒性作用。1 的簡單配置： 23 83g ，溶解于80 的雙蒸水中，用 10 的調(diào)節(jié)至( : 21)(21, ()$('')();, ()$('')(););7.2-7.4 ， 定容至 100， 0.22 小 濾器過濾 。 使用 終濃度為10-50。2.制備篩選培養(yǎng)基：在 1001000范圍內(nèi)按 0 、100、 200、 300、 400，500、 600、 700、 800， 900、 1000 濃度用無抗無血清培養(yǎng)基稀釋G

7、418制成篩選培養(yǎng)基。心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染3T3 細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測試過3T3細(xì)胞對 G418 的敏感性，我用的篩選濃度是200 。這時你就可以做 150、 200、300 三個濃度進(jìn)行篩選。 3. 培養(yǎng)待轉(zhuǎn)染 （而不是轉(zhuǎn)染后）的細(xì)胞。（篩選的目的是殺滅未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞） 4. 取對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般在鋪滿培養(yǎng)器皿底部的7080%寸），用新鮮無抗無血清的培養(yǎng)基制成1 X 104個 的細(xì)胞懸液。5. 向 96 孔培養(yǎng)板中加細(xì)胞懸液，每孔 100 微升（使每孔細(xì)胞數(shù)在1 X 103個），然后向每孔加新鮮

8、無抗無血清的培養(yǎng)基適量，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。 （這樣做是為了保證在固定細(xì)胞密度下確定最佳 G418藥物篩選濃度。）匯合度：實(shí)際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比例， 如果細(xì)胞鋪滿了整個容器， 我們就認(rèn)為它們100%匚合，也就是匯合度100%匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50% ！6. 培養(yǎng) 6 小時左右開始加藥。加篩選培養(yǎng)基篩選 : 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基適量。7. 換液： 每日檢查細(xì)胞活力， 根據(jù)細(xì)胞活力和培養(yǎng)基的顏色，每三天 （ 即每隔兩天） 更換篩選培養(yǎng)基一次。如細(xì)胞生長過快，可以縮短換液時間（每隔一天） 。有死細(xì)胞勤換液，可以減

9、少對存活細(xì)胞的影響。8. 確定最佳篩選濃度： 在正常的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程時， 一種細(xì)胞最優(yōu)篩選濃度的確立時間隨細(xì)胞的生長率和一般生存時間而定，在篩選1014天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳 G418濃度的可能性不大， 最有可能的是出現(xiàn)這種情況： 用某一濃度G418的量在篩選14 天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個梯度的 G418的量在 10 天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400 不能殺死細(xì)胞， 而 800 在第 5 天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒耍瑒t可以再用 500 、 600、700 進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度。（ 二 ） 轉(zhuǎn)染細(xì)胞1. 第一天：在60 培養(yǎng)皿內(nèi)種

10、植細(xì)胞，細(xì)胞密度為能使第二天細(xì)胞融合能達(dá)到 7080%的密度，2 孵箱過夜培養(yǎng)。2. 第二天：準(zhǔn)備3 無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，加入，終濃度為 8以o將已經(jīng)制備的病毒顆粒0.5加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除60 培養(yǎng)皿內(nèi)的舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基。 （能夠增加病毒感染的效率，然而，有時候?qū)?xì)胞有毒性。這時，可以用 代替） 3. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 小時或者更長，到細(xì)胞增長接近70 匯合時按1： 4 密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50%70%匯合時開始篩選。（ 三 ） 篩選細(xì)胞1. 加G418:去掉培養(yǎng)液，洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基（無抗無血清）（實(shí)際應(yīng)用時可以比最佳篩

11、選濃度高一級別 ） 。2. 換液： 根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況， 每 35 天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選1014天后，可見有抗性的克 隆出現(xiàn)，停藥用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。3. 待其逐漸增大后，挑出單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到 1 個/10 。在 96 孔板中加入培養(yǎng)基150 孔，再加入細(xì)胞懸液10 孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到 48 孔中增殖。 4. 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總， 做檢測目的基因是否存在。養(yǎng)板大小生長面積（ 2） 大約細(xì)胞數(shù)組織培養(yǎng)皿（小60）28板（小35）22.6 ）40 5典型貼壁細(xì)胞平板密度培培養(yǎng)

12、基容積（）6. 6X 1055-66 孔培養(yǎng)9.53 X 1051-212孔培養(yǎng)板小1.3X 1050. 5-124 孔培養(yǎng)板（小 8）0. 6X1050 25-0 5慢病毒使用操作手冊一、慢病毒的儲存與稀釋:1. 病毒的儲存： 收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以將病毒暫時放置于 4 保存；如需長期保存請放置于 -80 （病毒置于凍存管，并使用封口膜封口） 病毒可以存放于 -80 6 個月以上；但如果病毒儲存時間超過6 個月， 建議在使用前需要重新滴定病毒滴度 反復(fù)凍融會降低病毒滴度： 每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中應(yīng)僅盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融,建議

13、收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分 裝。2. 病毒的稀釋： 如果需要稀釋病毒， 請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細(xì)胞用或無血清培養(yǎng)基（ 含血清或含雙抗不影響病毒感染 ） ?；靹蚍盅b后 4保存 （ 請盡量在三天內(nèi)用完 ） 分裝后使用。二、慢病毒用于體外（ ）實(shí)驗(yàn)：感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系細(xì)胞。 慢病毒對各種細(xì)胞和組織的親嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對您的目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)（ 值）以及在體（ ）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的感染復(fù)數(shù)（ 值） （使用 24 孔板檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性） 。慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)1

14、. 慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)： 測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時， 需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞（293T ， ） 作為平行實(shí)驗(yàn)的對照細(xì)胞。 在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時， 可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。 一般慢病毒單位為， 即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。 如： 病毒滴度為 >1X108 即每毫升病毒液中至少含有1X108個具有生物活性的慢病毒顆粒。2. 以 24 孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行目的細(xì)胞和293T 細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前按照不同的設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量，

15、 如有必要可以使用溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液。第一天，準(zhǔn)備細(xì)胞：在 24 孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種 35X104 個目的細(xì)胞，鋪板時細(xì)胞的融合率為 50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 屋；進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為70%左右。第二天，準(zhǔn)備病毒：取出4保存的病毒，使用臺式離心機(jī)離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可） ；如果是凍存在 -80 的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況將按照準(zhǔn)確計(jì)算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中， 并盡可能保證所獲得的含( : 21)(21, ()$('')();, ()$('')(););有慢病毒的培

16、養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效 率。第二天，感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng) 箱中拿出細(xì)胞，首先察細(xì)胞生長狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實(shí) 驗(yàn)。a使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的 培養(yǎng)基。b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細(xì)胞生 長良好，密度適宜，則不用換液）。c在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液。d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37C、52）孵育過 夜。注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低 影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。 亦可以將預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng) 器皿中。慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低，通過提高

17、 值可以提高病毒的感染效率，但是當(dāng)高于 20時，我們建議在培養(yǎng)基中 加入（8 以左右）來提高病毒的感染效率。第三天，更換培養(yǎng)液：一般在 24小時候后將含有 慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài)，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜） 。第一次換液后，如果慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。第六天， 感染效率檢測： 在倒置熒光顯微鏡觀察熒光， 估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率； 如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶 的， 可以通過檢測目的基因的表達(dá)來拍評估感染效率。 注意：有些慢病毒載體上帶有綠色熒光蛋白， 使用者可以在病毒感染96 小時后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，以觀察病毒對目的細(xì)胞的感染情況。 如果慢病毒載體攜帶其他如可以用熒光顯微鏡在對應(yīng)的激發(fā)光波長下觀察熒光表達(dá)的情況。慢病毒表達(dá)時間較慢， 熒光表達(dá)所需時間較長， 建議感染后 96 小時后觀測熒光表達(dá)。 感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周， 通過觀察熒光的表達(dá)時間和表