腺病毒中文操作手冊(cè) (2)【精選文檔】

1、腺病毒中文操作手冊(cè) (2)【精選文檔】腺病毒載體操作手冊(cè)中文版腺病毒重組系統(tǒng)AdEasyTM操作手冊(cè)目 錄第一章 簡(jiǎn)介 1第二章 應(yīng)用重組腺病毒的優(yōu)點(diǎn) 2第三章 AdEasyTM 技術(shù) 33.1 技術(shù)概況 33.2 AdEasyTM系統(tǒng)中產(chǎn)生重組腺病毒的時(shí)程 3第四章 主要流程 44。1 將基因克隆入AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體 4  4。1.1 克隆的一般原則 4  4.1。2 構(gòu)建重組AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體 54.2 細(xì)菌內(nèi)AdEasyTM重組子的產(chǎn)生 5  4.2。1 共轉(zhuǎn)化的一般原則 5  4。2。2 共轉(zhuǎn)化方法 5  4。2。3 預(yù)期結(jié)

2、果 54。3 AdEasyTM重組質(zhì)粒的篩選和擴(kuò)增 64.4 AdEasyTM重組子轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞 6  4。4。1 細(xì)胞鋪板 6  4。4。2 磷酸鈣轉(zhuǎn)化技術(shù) 7第五章 常用技術(shù) 85。1 QBI-293A細(xì)胞培養(yǎng) 8  5。1。1 QBI293A細(xì)胞的初始培養(yǎng) 8  5。1.2 QBI-293A細(xì)胞的維持培養(yǎng)和增殖 8  5。1.3 QBI293A細(xì)胞的凍存 85.2 QBI293A細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和病毒空斑的產(chǎn)生 9  5。2。1 感染QBI293A細(xì)胞 9  5.2。2 病毒空斑形成 9  5.2。3

3、瓊脂糖覆蓋被感染細(xì)胞 95.3 MOI測(cè)定 105。4 腺病毒感染力測(cè)定 10  5.4。1 XGal染色 115。5 重組腺病毒的篩選和純化 11  5.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達(dá)和基因輸送 11  5。5.2 病毒空斑挑選和小量擴(kuò)增 12  5。5。3 Western雜交 13  5。5。4 Southern雜交和點(diǎn)雜交 13  5。5.5 病毒裂解產(chǎn)物PCR 14  5.5。6 免疫測(cè)定 14  5。5.7 功能測(cè)定 145。6 病毒顆粒在QBI293A細(xì)胞中的大量擴(kuò)增 155。7 兩次氯化銫密度梯度離

4、心純化重組腺病毒 16  5。7。1 不連續(xù)密度梯度離心 17  5。7。2 連續(xù)密度梯度離心 17  5.7.3 病毒溶液去鹽和濃集 175.8 病毒滴度測(cè)定 18  5。8。1 O。D.260 nm （VP/ml） 19  5.8.2 空斑測(cè)定法 20  5。8。3 50%組織培養(yǎng)感染劑量法 20第六章 疑難解答 226.1 QBI-293A細(xì)胞培養(yǎng) 226。2 感染力測(cè)定 226.3 轉(zhuǎn)移載體克隆 236.4 在BJ5183細(xì)胞中共轉(zhuǎn)化和重組 246。5 轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞 256。6 篩選和測(cè)定 256.7 在QBI-2

5、93A細(xì)胞中表達(dá) 266.8 重組腺病毒的擴(kuò)增 266。9 純化 266.10 病毒滴度測(cè)定 27縮寫 英文全稱 中文全稱Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒載體Amp Ampicillin 氨芐青霉素Gal -Galactosidase 半乳糖苷酶bp Base Pair 堿基對(duì)BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互補(bǔ)DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 閉環(huán)螺旋DNAC

6、PE Cytopathic Effect 細(xì)胞病理效應(yīng)CsCl Cesium Chloride 氯化銫DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM培養(yǎng)基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亞砜DTT Dithiothreitol 二硫蘇糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙錠FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小時(shí)ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重復(fù)Kan

7、Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千堿基對(duì)KDa KiloDaltons 千道爾頓LB LuriaBertani ( broth ) LB培養(yǎng)基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位點(diǎn)Min Minute 分鐘MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ） 感染復(fù)數(shù)mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝膠電泳PBS Phosphate Buffered Sa

8、line 磷酸鹽緩沖液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成單位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右側(cè)反向末端重復(fù)SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸鈉TBE Tris Borate/EDTA 三羥甲基氨基甲烷硼酸鹽/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50組織培養(yǎng)感染劑量TCP Total Cellular Protein

9、細(xì)胞總蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型XGal 5-bromo-4-chloro3-indolylD-Galactopyranoside 5-溴4-氯3-吲哚D-半乳糖苷第一章 簡(jiǎn) 介當(dāng)今基因輸送技術(shù)的發(fā)展日趨復(fù)雜，一些治療藥物(生長(zhǎng)激素、干擾素、抗病毒和抗癌復(fù)合物）和診斷性蛋白（單克隆抗體）的設(shè)計(jì)、發(fā)展與合成需要更高效的基因輸送工具。人類基因組計(jì)劃和正不斷發(fā)展的基因治療同樣急需發(fā)展快速有效和治療性的分析工具。為解決這一問(wèn)題，基因輸送技術(shù)（通常使用病毒載體如增殖缺陷的腺病毒)通過(guò)基因工程不斷發(fā)展，致力于生產(chǎn)基因表型藥物.重組腺病毒提供了一類在基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)發(fā)

10、展中有極大潛力的新的生物治療劑。1953年對(duì)普通感冒病因的探索和研究導(dǎo)致了腺病毒的發(fā)現(xiàn)。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了40多種不同血清型和93種不同種類的腺病毒，它們通常感染眼、呼吸道或胃腸上皮（Fields等,1996)。1977年，F(xiàn)rank Graham博士建立了一種細(xì)胞株，可在無(wú)輔助病毒的情況下產(chǎn)生重組腺病毒(Graham等，1977）。此后，腺病毒載體作為極具潛力的哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移載體而得到廣泛應(yīng)用,尤其是在基因治療相關(guān)領(lǐng)域.迄今為止已有大量關(guān)于腺病毒及其應(yīng)用的綜述發(fā)表，我們給感興趣的讀者推薦以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用來(lái)在人體細(xì)胞中過(guò)量

11、表達(dá)蛋白（Massie et al，1998 A， B)。但迄今為止還只有熟知腺病毒的研究人員才會(huì)采用腺病毒系統(tǒng)。昆騰生物科技公司是第一個(gè)提供完備而且能廣泛應(yīng)用的重組腺病毒試劑盒AdenoQuestTM系統(tǒng)及其相關(guān)產(chǎn)品和客戶服務(wù)的公司，這個(gè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)是在293細(xì)胞中產(chǎn)生重組腺病毒.現(xiàn)在介紹的AdEasyTM系統(tǒng)以細(xì)菌內(nèi)重組取代哺乳動(dòng)物細(xì)胞（He et al，1998)，使獲得重組腺病毒對(duì)任何有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的分子生物實(shí)驗(yàn)室都更方便.重組腺病毒事實(shí)上可在任何細(xì)胞或組織中用來(lái)研究表達(dá)重組蛋白。AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體可允許插入7。5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它區(qū)的缺失以提高腺病毒在基因治療

12、中的應(yīng)用.這本手冊(cè)提供了重組腺病毒技術(shù)中所有必須遵循的原則,并詳細(xì)描述了產(chǎn)生一個(gè)重組腺病毒的所有實(shí)驗(yàn)步驟，包括重組腺病毒在QBI-293A細(xì)胞中擴(kuò)增并純化到1012VP的操作步驟.AdEasyTM載體系統(tǒng)包含了生產(chǎn)5型重組腺病毒所需的全部試劑，所有成分購(gòu)買后即可使用。第二章 應(yīng)用重組腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1。 宿主范圍廣, 對(duì)人致病性低這套腺病毒載體系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達(dá)。腺病毒可感染一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因此在大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中均可用來(lái)表達(dá)重組蛋白。2。 在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞，因此DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進(jìn)行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)

13、。腺病毒則能感染幾乎所有的細(xì)胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。腺病毒是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)，它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進(jìn)行對(duì)比。3. 能有效進(jìn)行增殖，滴度高這套腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生1010到1011VP/ml，濃縮后可達(dá)1013VP/ml,這一特點(diǎn)使它非常適用于基因治療。4。 無(wú)需輔助病毒，可容納7.5 kb外源DNA: 為提供克隆空間，此腺病毒缺失了E1和E3早期區(qū).此外，此腺病毒可包裝比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105）。這些特點(diǎn)允許插入腺病毒的基因或多基因表達(dá)盒可達(dá)7。5kb。5. 與人類基因同源該腺病毒載體系統(tǒng)應(yīng)用了人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞

14、作為宿主，因此為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個(gè)理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能。6。 不整合到染色體中,無(wú)插入致突變性逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體，導(dǎo)致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中,因此不會(huì)干擾其它的宿主基因。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)較好的系統(tǒng)。7。 能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增： 293細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴(kuò)增。大量事實(shí)證明懸浮293細(xì)胞可在120L的生物反應(yīng)器中表達(dá)重組蛋白。8。 能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因這是第一個(gè)可以在同一細(xì)胞株或組織

15、中用來(lái)設(shè)計(jì)表達(dá)多個(gè)基因的表達(dá)系統(tǒng).最簡(jiǎn)單的方法是將含有兩個(gè)基因的雙表達(dá)盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中,或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來(lái)分別表達(dá)一個(gè)蛋白。測(cè)定不同重組病毒的MOI比值可正確估計(jì)各重組蛋白的相對(duì)共表達(dá)情況。第三章 AdEasyTM技術(shù)3。1 技術(shù)概覽AdEasyTM系統(tǒng)是由T。C。He等(1998)構(gòu)建的用來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)的一個(gè)快捷系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，只需二步即可產(chǎn)生重組腺病毒:先將表達(dá)盒裝入轉(zhuǎn)移載體，然后再通過(guò)同源重組插入腺病毒基因組.將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過(guò)同源重組，原因是：1）腺病毒DNA是大型的線性分子,含有幾乎所有的內(nèi)切酶切位點(diǎn)；2）基因組過(guò)大（36k

16、b），難于操作。在AdEasyTM載體系統(tǒng)中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質(zhì)粒，而不是線性DNA,同源重組則在大腸桿菌進(jìn)行。相對(duì)于傳統(tǒng)系統(tǒng)而言,這二點(diǎn)改進(jìn)使病毒DNA操作更容易，同時(shí)由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡(jiǎn)單。在本系統(tǒng)中,首先將基因cDNA插入一個(gè)轉(zhuǎn)移載體，將得到的質(zhì)粒用PmeI線性化，然后在大腸桿菌BJ5183中與病毒DNA質(zhì)粒pAdEasy1進(jìn)行同源重組.pAdEasy-1缺失了E1和E3區(qū),其E1區(qū)功能將在293A細(xì)胞中得到互補(bǔ)。重組子通過(guò)卡那霉素篩選，用內(nèi)切酶進(jìn)行鑒定分析.最后將得到的重組腺病毒用PmeI線性化,暴露其反向末端重復(fù)序列（IT

17、R,Iaverted Termined Repeats）,轉(zhuǎn)染QBI293A細(xì)胞后產(chǎn)生重組病毒顆粒。同源重組在線性化的轉(zhuǎn)移載體和完整的超螺旋腺病毒質(zhì)粒之間進(jìn)行.應(yīng)用完整的腺病毒質(zhì)粒而不用內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，對(duì)于產(chǎn)生重組腺病毒至關(guān)重要。轉(zhuǎn)移載體中的卡那霉素抗性基因則可用來(lái)篩選重組子。由于線性化的轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生卡那霉素抗性克隆的背景較低,因此此同源重組系統(tǒng)有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183有recA活性，但同時(shí)缺失介導(dǎo)細(xì)菌重組的其它酶,具有高效的轉(zhuǎn)化和重組能力.一旦重組子經(jīng)確定,則可轉(zhuǎn)入普通的無(wú)recA、endA活性的細(xì)菌株如DH5等進(jìn)行擴(kuò)增.由于缺乏recA活性,DH5不能用于腺病毒的同源重組.3

18、.2 Ad EasyTM系統(tǒng)中產(chǎn)生重組腺病毒的時(shí)程與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，AdEasyTM系統(tǒng)中篩選和純化腺病毒所需的時(shí)間大大縮短了.克隆和篩選約需1-3周，重組后需驗(yàn)證重組病毒質(zhì)粒是否含有目的基因。重組子在DH5中擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞293A，最后將293A細(xì)胞中產(chǎn)生的重組病毒顆粒進(jìn)行純化和滴定。最終得到的重組腺病毒只能在提供E1區(qū)功能的293A細(xì)胞中進(jìn)行增殖。一般來(lái)說(shuō)，用傳統(tǒng)方法產(chǎn)生重組腺病毒并不需要大量工作,每天只需1小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代和觀察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整個(gè)過(guò)程就需要很長(zhǎng)時(shí)間.而AdEasyTM載體系統(tǒng)用大腸桿菌產(chǎn)生重組病毒，大大縮短了所需時(shí)間。我們強(qiáng)烈建議初學(xué)者用QBI

19、Infect陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行感染力測(cè)定(見5.2.2).進(jìn)行這些測(cè)定之前，必須先擴(kuò)增QBI293A細(xì)胞（見5。5。1）。感染力測(cè)定使你能觀察到病毒增殖導(dǎo)致的細(xì)胞表型的改變，獲知你所用細(xì)胞對(duì)腺病毒的敏感性,而病毒空斑測(cè)定可讓你觀察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 將基因克隆入AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體AdEasyTM系統(tǒng)中有2種轉(zhuǎn)移載體可供進(jìn)行重組腺病毒構(gòu)建:pShuttle和pShuttleCMV，這2個(gè)載體都含有多克隆位點(diǎn)（MCS）供插入基因。pShuttle不含有啟動(dòng)子和多聚腺苷酸位點(diǎn)（polyA），允許插入含特定啟動(dòng)子和polyA位點(diǎn)的表達(dá)盒。pShuttle-CMV含有單拷貝CMV啟

20、動(dòng)子和polyA位點(diǎn)供基礎(chǔ)表達(dá)和高表達(dá)重組蛋白,你只需將目的基因插入pShuttleCMV的多克隆位點(diǎn)。表1提供了各轉(zhuǎn)移載體的特性。表1 AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體特性載體名稱 克隆能力 啟動(dòng)子 polyA位點(diǎn) 克隆位點(diǎn) 線性化位點(diǎn) 說(shuō)明pShuttle 7.5kb - MCS 共轉(zhuǎn)化位點(diǎn)PmeI（ECoRI）轉(zhuǎn)染位點(diǎn)（PacI） 將完整的表達(dá)盒裝入多克隆位點(diǎn)（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共轉(zhuǎn)化位點(diǎn)PmeI（ECoRI)轉(zhuǎn)染位點(diǎn)（PacI） CMV啟動(dòng)子能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)蛋白4.1。1 克隆的一般原則AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體的特殊設(shè)計(jì)使其極易在

21、克隆中應(yīng)用,但在設(shè)計(jì)克隆策略時(shí)應(yīng)考慮以下因素：1) 在BJ5183中進(jìn)行共轉(zhuǎn)化之前必須將轉(zhuǎn)化載體線性化。確證表1中所列的線性化位點(diǎn)不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI線性化時(shí)，需要用RecA輔助的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。如果插入基因含有所有線性化酶切位點(diǎn)，那么必須進(jìn)行定向突變。2） 重組腺病毒質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞之前也必須用PacI進(jìn)行線性化.同樣，插入基因中不能含有PacI位點(diǎn)，如果有則必須進(jìn)行定向突變。3） 克隆能力是指質(zhì)粒載體能夠克隆并且不影響病毒增殖能力的插入基因的最大長(zhǎng)度。各轉(zhuǎn)移載體的克隆能力見表1,建議插入基因的長(zhǎng)度最好不超過(guò)它的上限。在pShutt

22、le和pShuttleCMV中分別插入大于7。5kb和6。6kb的基因?qū)⒋蟠蠼档驼麄€(gè)系統(tǒng)的效率。盡管也可能得到重組子，但可能會(huì)發(fā)生DNA重排,生長(zhǎng)速度也將減慢。4） 如果要插入多個(gè)表達(dá)盒,應(yīng)避免以頭對(duì)頭方向插入相同的元件（如CMV啟動(dòng)子),否則同源重組時(shí)兩個(gè)元件之間的部分可能會(huì)發(fā)生丟失。5） 在進(jìn)行構(gòu)建腺病毒之前最好測(cè)定重組蛋白的暫時(shí)性表達(dá)。這里沒(méi)有提供詳細(xì)的操作方法，但在CMV或其它強(qiáng)力啟動(dòng)子控制下的基因很容易進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)實(shí)驗(yàn)。但某些啟動(dòng)子控制下的蛋白表達(dá)水平在無(wú)病毒增殖時(shí)可能不足以達(dá)到檢測(cè)水平。6） 載體DNA可用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心或親和柱法進(jìn)行純化.我們不主張用小量粗制的D

23、NA進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，因?yàn)槲廴镜腄NA將大大降低菌落和空斑的形成數(shù)。4。1.2 構(gòu)建重組AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建重組AdEasyTM轉(zhuǎn)移載體的一般指導(dǎo)如下，但我們建議對(duì)于詳細(xì)的克隆技術(shù)和操作方法還需參考通用的分子生物學(xué)手冊(cè)。1 若cDNA含有位置正確的粘性內(nèi)切酶位點(diǎn)，則可將它直接克隆入轉(zhuǎn)移載體。如果沒(méi)有，可以使用鈍末端內(nèi)切酶位點(diǎn)，也可用含合適的酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR或連接含有酶切位點(diǎn)的接頭使cDNA產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。PCR插入酶切位點(diǎn)的方法較快速，但對(duì)于長(zhǎng)cDNA則應(yīng)使用連接接頭，因?yàn)樵跀U(kuò)增過(guò)程中Taq酶可能會(huì)使序列的某些位點(diǎn)發(fā)生突變。2 插入基因的鑒定可以用限制性內(nèi)切酶分析或PCR的

24、方法。3 轉(zhuǎn)化之前用PmeI或EcoRI將轉(zhuǎn)移載體重組子線性化，消化應(yīng)盡可能徹底，以減少背景信號(hào).4 瓊脂糖凝膠上觀察消化產(chǎn)物,若消化已完全，放入65 20分鐘進(jìn)行滅活.5 凝膠純化線性化載體。盡管膠純化可能會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，但不完全消化往往產(chǎn)生較高的背景，從而降低重組率。將線性化質(zhì)粒去磷酸化也有助于降低背景信號(hào)。6 重懸純化的DNA，濃度至少為0.2ug/ul。每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)取1ug進(jìn)行，包括對(duì)照。4.2 細(xì)菌內(nèi)AdEasyTM重組子的產(chǎn)生4。2。1 共轉(zhuǎn)染的一般原則1) 將線性化轉(zhuǎn)移載體和pAdEasyTM1 DNA共轉(zhuǎn)化BJ5183必須要用高活性的感受態(tài)細(xì)胞。試劑盒中提供的細(xì)菌為電穿孔感受態(tài)

25、，有很高的轉(zhuǎn)化效率。如果不用電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，那么必須制備化學(xué)敏感性感受態(tài)細(xì)胞，并在應(yīng)用之前試驗(yàn)其轉(zhuǎn)化活性（108已足夠）。2） DH5不可用于轉(zhuǎn)化,因其不支持重組,它只是用來(lái)擴(kuò)增重組病毒DNA。3) 本實(shí)驗(yàn)需要2ug線性化膠純化的重組轉(zhuǎn)移載體，共轉(zhuǎn)化和對(duì)照各需1ug。4.2.2 共轉(zhuǎn)化方法同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組共轉(zhuǎn)化：1ug線性化重組轉(zhuǎn)移載體(5ul)和1.0ul pAdEasyTM1載體（100ug/ul）對(duì)照組轉(zhuǎn)化:1ug（5ul)線性化重組轉(zhuǎn)移載體1 將BJ5183感受態(tài)細(xì)胞和電穿孔杯置于冰上。將細(xì)胞分為2管，每管40ul.2 40ul感受態(tài)細(xì)胞中至多加入6ul DN

26、A，且DNA必須溶于水，避免含有離子。3 將BJ5183轉(zhuǎn)入2mm電穿孔杯，防止有氣泡形成。4 按電穿孔供應(yīng)商的使用說(shuō)明轉(zhuǎn)化BJ5183，Bio-Rad儀器一般使用的參數(shù)為：200 Ohms、25uF、2。5KV;BTX儀器則為:5 Ohms、2。5KV、C=0.5 用1mlLB重懸轉(zhuǎn)化物。6 轉(zhuǎn)入1550ml離心管中,37震蕩培養(yǎng)60分鐘。7 將轉(zhuǎn)化物鋪35塊 LB/Kan（50ug/ml)培養(yǎng)板，37培養(yǎng)24小時(shí)。建議分別鋪100、300和600ul，以提高至少在一塊板中得到可分離菌落的機(jī)率,應(yīng)該得到40100個(gè)菌落.8 挑出24個(gè)最好的克隆，轉(zhuǎn)入2ml LB/Kan(50ug/ml）培養(yǎng)

27、液中培養(yǎng)1015個(gè)小時(shí)。不要儲(chǔ)存BJ5183培養(yǎng)液，因有可能產(chǎn)生非目的重組子。盡快抽提重組AdEasyTM質(zhì)粒。9 用傳統(tǒng)堿裂解法小量制備質(zhì)粒，取一半進(jìn)行0。7%瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證超螺旋質(zhì)粒的大小.玻璃珠或樹脂制備質(zhì)粒的試劑盒應(yīng)避免使用，但粘粒DNA抽提試劑盒可以用。重組質(zhì)粒大小約40kb，由于它是低拷貝質(zhì)粒，所以小量制備時(shí)應(yīng)相應(yīng)調(diào)整具體操作。4。2。3 預(yù)期結(jié)果20%以上的菌落應(yīng)含有大質(zhì)粒（近40kb），這些是侯選重組子.與對(duì)照培養(yǎng)板生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行對(duì)照即可大概估計(jì)線性化轉(zhuǎn)移載體再連接所致的背景強(qiáng)弱。由于在此高效重組recA+細(xì)菌中重組轉(zhuǎn)移載體會(huì)形成多聚體，因此背景將表現(xiàn)為一個(gè)梯度.4。3

28、AdEasyTM重組質(zhì)粒的篩選和擴(kuò)增將侯選重組子進(jìn)行酶切分析，驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。比如：PacI酶切后通常得到約30kb的片段和一個(gè)3。0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重組位置在左臂還是復(fù)制子而不同。建議同時(shí)用克隆基因的內(nèi)切酶進(jìn)行分析，鑒定是否含有插入基因.挑選最佳陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)入DH5中進(jìn)行擴(kuò)增：轉(zhuǎn)化DH5只需15ul小量制備的重組子。這一步對(duì)于擴(kuò)增時(shí)保持重組DNA的結(jié)構(gòu)是必需的，因?yàn)锳dEasyTM這樣的大質(zhì)粒在recA+細(xì)菌株如BJ5183中是不穩(wěn)定的,會(huì)迅速出現(xiàn)缺失,而在DH5中能很容易地獲得大量DNA。1 將DH5感受態(tài)細(xì)胞和電穿孔杯置于冰上。2 將15ul DNA加入40ul DH5感

29、受態(tài)細(xì)胞中，DNA必須用水溶，避免含有離子。3 將DH5感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)入2mm電穿孔杯，防止形成氣泡.4 按照說(shuō)明轉(zhuǎn)化DH5:BioRad儀器一般使用的參數(shù)為：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX儀器則為：50 Ohms、2.5KV、C=0。5 將轉(zhuǎn)化混合液重懸于1ml LB中.6 轉(zhuǎn)入15-50ml離心管中，37振蕩培養(yǎng)60分鐘。7 培養(yǎng)后用LB按一定梯度稀釋轉(zhuǎn)化的DH5（1:10、1:100和1：1000)8 取100ul轉(zhuǎn)化液鋪在LB/Kan（50ug/ml)板上，37培養(yǎng)24小時(shí).未用的轉(zhuǎn)化液可在4保存2周。9 每個(gè)重組子挑13個(gè)克隆轉(zhuǎn)入5ml LB擴(kuò)增,以備有足夠量質(zhì)粒。這時(shí)

30、,用內(nèi)切酶再次分析重組DNA，以確證含有插入基因，以及重組子的穩(wěn)定性.10 用柱純化試劑盒制備至少5ug高質(zhì)量的重組DNA。11 取5ug質(zhì)粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在無(wú)菌條件下溶于50ul 0.1×TE溶液。具體要求參見磷酸鈣技術(shù)一章中有關(guān)轉(zhuǎn)染前DNA制備的內(nèi)容。4.4 AdEasyTM重組子轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞注意：培養(yǎng)細(xì)胞前先參閱5.1章中有關(guān)QBI293A細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)容。磷酸鈣技術(shù)中的注意點(diǎn):無(wú)菌在整個(gè)過(guò)程中保持所有成分的無(wú)菌是至關(guān)重要的。昆騰公司提供的試劑盒中所有成分均是無(wú)菌的，但使用者還必須保證所用其它試劑也均為無(wú)菌.DNA純度磷酸鈣轉(zhuǎn)染中所用的D

31、NA必須是高純度的，一些DNA污染物對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性，那些成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞往往會(huì)被污染物殺死.沉淀時(shí)間以前的資料都建議磷酸鈣 DNA共沉淀顆粒在加入細(xì)胞和培養(yǎng)液之前至少應(yīng)反應(yīng)20分鐘。然而與此相反，最近的研究(Jordan等,1996)顯示長(zhǎng)時(shí)間共沉淀會(huì)形成聚合沉淀塊，從而降低轉(zhuǎn)染效率.因此，建議共沉淀成分混合后1分鐘即可將沉淀加入細(xì)胞培養(yǎng)板。這一時(shí)間上的調(diào)整可產(chǎn)生小而穩(wěn)定的沉淀，能更有效地被細(xì)胞攝入。4。4。1 細(xì)胞鋪板每塊板都用DMEM5%進(jìn)行培養(yǎng)，這樣細(xì)胞在鋪板后第二天即可達(dá)到70%匯合率。由于共轉(zhuǎn)染是通過(guò)細(xì)胞表面完成的，因此轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞必須是分離的，而不是匯合的.1 轉(zhuǎn)染前一天以

32、7。5×105 QBI293A細(xì)胞在60mm培養(yǎng)皿中鋪板,用DMEM5%培養(yǎng)，第二天的細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到1。01.5×106。37 CO2孵箱中培養(yǎng)。CO2孵箱有助于保持合適的PH，培養(yǎng)皿在不進(jìn)行操作時(shí)必須始終保存在CO2孵箱中。2 轉(zhuǎn)染前3-4小時(shí)換成新鮮培養(yǎng)液，以保證在轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞具有超常的生長(zhǎng)力。將培養(yǎng)皿放回CO2孵箱中。4.4。2 磷酸鈣轉(zhuǎn)化技術(shù)1 每個(gè)轉(zhuǎn)染都必須用5ug無(wú)菌的線性化重組腺病毒DNA.2 標(biāo)記一個(gè)1。5ml離心管為編號(hào)1.用微量移液槍加入169ul無(wú)菌水和5ul 2M氯化鈣溶液。上下吸打二次混勻,然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2

33、M氯化鈣，再用移液槍慢慢吹打混勻。此時(shí)緩沖液的體積為250ul，含有0.25M氯化鈣和5ug DNA。3 準(zhǔn)備第2管離心管(編號(hào)2），加入250ul 2×HBS緩沖液。4 用1ml移液槍吹打2號(hào)管中的溶液形成氣泡，在吹打的同時(shí)逐滴加入1號(hào)管的溶液。加完后繼續(xù)吹打5秒以使其完全混勻。這一步驟對(duì)于形成的共沉淀顆粒的大小至關(guān)重要,小顆粒轉(zhuǎn)染效率更高,而吹打可以形成較小的顆粒。等一分鐘后再加入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。5 在超凈臺(tái)內(nèi)將磷酸鈣-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培養(yǎng)皿中,覆蓋范圍盡可能廣.培養(yǎng)液稍后即會(huì)透明,十字形晃動(dòng)培養(yǎng)皿使沉淀均勻分布。6 培養(yǎng)皿放入孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。4小時(shí)后，沉淀顆粒在200&

34、#215;倒置顯微鏡下應(yīng)清晰可見，尤其在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)皿表面。7 第二天，去除含共沉淀顆粒的培養(yǎng)液，用PBS制備的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞都十分脆弱，容易脫壁。清洗時(shí)應(yīng)十分輕柔，將PBS沿培養(yǎng)皿壁加入，然后輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿.用移液槍反復(fù)將培養(yǎng)液直接加在細(xì)胞上，即可使細(xì)胞脫落，然后收集.由于這一時(shí)期細(xì)胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8 將細(xì)胞分裝入4個(gè)60mm培養(yǎng)皿（每個(gè)培養(yǎng)皿中加5ml DMEM5）或一塊6孔板中（每孔加3ml DMEM5%），靜置6小時(shí)使其貼壁。6小時(shí)后覆蓋瓊脂糖以供形成病毒空斑。第五章 常用技術(shù)5.1 QBI-293A細(xì)胞培養(yǎng)昆騰公司的293A細(xì)

35、胞來(lái)源于一個(gè)用作空斑測(cè)定的亞克隆，具有易使用和易轉(zhuǎn)染的特性.該細(xì)胞株對(duì)于高細(xì)胞密度很敏感，當(dāng)細(xì)胞超過(guò)70%匯合時(shí)，一些細(xì)胞可能會(huì)丟失它們的表型。若細(xì)胞密度持續(xù)在70%以下，QBI293A細(xì)胞則能連續(xù)培養(yǎng)34個(gè)月維持原有細(xì)胞特性。若以購(gòu)買得到的293作為第一代，則30代內(nèi)能得到最佳結(jié)果。一旦到了30代，最好復(fù)蘇一管細(xì)胞開始新的培養(yǎng)。所以,我們建議你在收到細(xì)胞后應(yīng)盡快建立自己的QBI293A細(xì)胞庫(kù)。QBI293A細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該培養(yǎng)液還含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清濃度為210，視實(shí)驗(yàn)需要來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)速度.為簡(jiǎn)化此操作說(shuō)明,培養(yǎng)

36、基描述為DMEM后加血清濃度（如：DMEM5表示:含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、終濃度為2mM的谷氨酰胺和終濃度為5的熱滅活胎牛血清）.QBI-293A細(xì)胞需按標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行操作，在健康狀態(tài)時(shí)，它們呈成纖維細(xì)胞樣并在培養(yǎng)瓶中貼壁形成單層細(xì)胞。被感染的細(xì)胞則變圓脫落，即所謂的細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE)。所有的細(xì)胞培養(yǎng)操作都應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則,這一點(diǎn)是至關(guān)重要的?？股乜捎每刹挥茫珶o(wú)抗生素條件對(duì)于操作質(zhì)量來(lái)說(shuō)通常是一個(gè)好的對(duì)照.QBI293A細(xì)胞生長(zhǎng)的相對(duì)密度見下表:表2：匯合率與細(xì)胞數(shù)量匯合率（) 60mm培養(yǎng)皿 100mm培養(yǎng)皿50 1。60×106 3

37、。5×10675 2。40×106 5.25×106100 3.20×106 7。00×1065.1。1 QBI-293A細(xì)胞初始培養(yǎng)1. 將凍存的一管QBI-293A細(xì)胞在37水浴輕輕晃動(dòng)融化.2。 融化后在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下用70乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。3. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15mL無(wú)菌離心管中，加入10mL DMEM 10%,600×g離心5分鐘使細(xì)胞沉淀.4. 棄去上清.5. 將細(xì)胞用10mL DMEM 10%重懸，輕輕打勻6。 轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶或100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。7。 在5 CO2孵箱中37培養(yǎng)過(guò)夜。8。 第二天觀察細(xì)

38、胞匯合率，若合適則可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則按5.1.2所述繼續(xù)培養(yǎng)。5.1.2 QBI293A細(xì)胞的維持培養(yǎng)和增殖QBI-293A細(xì)胞必須按1：10到1：20傳代1. 室溫下胰酶消化13分鐘使貼壁細(xì)胞脫落2. 拍打培養(yǎng)瓶邊緣使細(xì)胞脫落，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，是否已從培養(yǎng)瓶表面脫落.3. 按需要用新鮮培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。在5 FBS中,細(xì)胞倍增的時(shí)間是26小時(shí),在10% FBS中稍短一些。5.1.3 QBI-293A細(xì)胞的凍存建立細(xì)胞庫(kù)時(shí)必須使培養(yǎng)的細(xì)胞匯合率低于50，以保證亞克隆的特定表型.1. QBI-293A細(xì)胞必須在含10高質(zhì)量FBS的DMEM中培養(yǎng)。2。 將健康生長(zhǎng)

39、的QBI293A細(xì)胞離心沉淀。3. 以最小體積的DMEM 10%重懸細(xì)胞。4。 用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。5。 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重懸細(xì)胞,細(xì)胞終濃度為1×106/mL。6. 無(wú)菌操作將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2mL凍存管中。7。 將凍存管放入凍存盒中，-80儲(chǔ)存24小時(shí)。這一簡(jiǎn)便措施可保持約1/分鐘的降溫速率，適于凍存細(xì)胞.8。 第二天將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐或-150冰箱中長(zhǎng)期保存.QBI293A細(xì)胞若正確凍存，則可在液氮罐中保存數(shù)年。5。2 QBI-293A細(xì)胞的感染和病毒空斑的產(chǎn)生感染QBI293A細(xì)胞和產(chǎn)生病毒空斑在這本手冊(cè)的多種操作中都得到應(yīng)

40、用，其具體操作視不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩杂胁町?如滴度測(cè)定、大規(guī)模擴(kuò)增和純化）。這一節(jié)提供了一個(gè)基本的操作說(shuō)明,并詳細(xì)描述了QBI293A細(xì)胞感染后不同時(shí)間的具體變化。5。2。1 感染QBI293A細(xì)胞QBI293A細(xì)胞中腺病毒的感染周期表現(xiàn)為光鏡下可見的細(xì)胞表型的改變,此周期始于病毒和細(xì)胞接觸后。被感染細(xì)胞的表型變化與病毒接觸的時(shí)間以及病毒細(xì)胞比率相關(guān),這個(gè)比率稱為感染復(fù)數(shù)（MOI)。病毒控制細(xì)胞并阻止細(xì)胞的生長(zhǎng)需要幾個(gè)小時(shí)的時(shí)間.1020的MOI值通常用于需要同時(shí)感染所有細(xì)胞時(shí)，此時(shí)細(xì)胞匯合率應(yīng)該在9095%左右，因?yàn)榧?xì)胞在感染數(shù)小時(shí)內(nèi)將停止生長(zhǎng)。加入病毒的量可通過(guò)MOI值測(cè)定(見5.3）或病毒

41、滴度測(cè)定(見5。8）確定。在這個(gè)MOI值條件下，被感染細(xì)胞的形態(tài)在12天后就會(huì)完全改變：細(xì)胞變圓并逐漸從壁上脫落（見5。2.2）。隨著病毒的增殖，細(xì)胞核將占據(jù)細(xì)胞的大部分，這一表現(xiàn)稱為細(xì)胞病理效應(yīng)（CPE）。感染后3天，所有細(xì)胞都將呈現(xiàn)CPE。當(dāng)QBI-293A細(xì)胞在MOI值為1或更低的情況下被感染，則只有一部分細(xì)胞能被感染。此時(shí)感染所有的細(xì)胞必須產(chǎn)生完整的感染周期并釋放病毒，整個(gè)過(guò)程大概需要4天。在這個(gè)過(guò)程中，未被感染的細(xì)胞將繼續(xù)生長(zhǎng)，細(xì)胞可能在未被全部感染時(shí)達(dá)到100匯合率而停止生長(zhǎng)。感染后的表現(xiàn)是多種多樣的,但典型的表現(xiàn)是在感染后5天可見大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)CPE而其余的細(xì)胞表現(xiàn)為原來(lái)未被感染

42、的形態(tài)。感染的操作很簡(jiǎn)單,只要將病毒與細(xì)胞接觸.為增加感染的有效性,在最初2小時(shí)感染中最好將培養(yǎng)液的體積減到最小，這樣病毒與細(xì)胞接觸得會(huì)更緊密，然后再增加培養(yǎng)液。此外，緩慢而持續(xù)地晃動(dòng)培養(yǎng)板(Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均勻，從而使感染效果更好。注意:處理細(xì)胞和病毒時(shí)都必須使用消毒的槍頭.5。2。2 病毒空斑形成病毒空斑形成源于一個(gè)細(xì)胞被一個(gè)病毒感染后，經(jīng)過(guò)多次完整的感染周期釋放病毒再感染周圍的細(xì)胞。病毒空斑的形成是一個(gè)緩慢的過(guò)程，甚至在光鏡下能觀察到空斑之前，細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到100%匯合。為限制病毒的擴(kuò)散，通常在培養(yǎng)液中加入瓊脂糖，但在瓊脂糖覆蓋下觀察細(xì)胞形態(tài)的改

43、變則要稍微困難一些.感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑，表現(xiàn)為一定區(qū)域內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)CPE.第10天可以在光鏡下看到形態(tài)完整的空斑,有經(jīng)驗(yàn)的研究者則能憑肉眼觀察到培養(yǎng)板底部有小的空白斑點(diǎn)形成。到14天，空斑可非常容易地被挑選出來(lái)。5.2.3 瓊脂糖覆蓋被感染細(xì)胞將瓊脂糖覆蓋細(xì)胞不是一項(xiàng)容易的技術(shù)，你必須在瓊脂糖凝固之前迅速地將它在單層細(xì)胞上完全鋪勻.但是如果鋪得太快太重，那么細(xì)胞往往會(huì)脫壁.但通過(guò)幾次實(shí)驗(yàn)后，這一步應(yīng)該比較容易了。瓊脂糖/DMEM混合物制備：1. 用無(wú)菌PBS制備5 SeaPlaque瓊脂糖(FMC產(chǎn)品)儲(chǔ)存液,高壓消毒后每管10mL分裝在50mL塑料離心管中，4保存.2.

44、使用之前先在微波爐中融化5 SeaPlaque瓊脂糖（避免沸騰），然后冷至45。防止瓊脂糖沸騰最好的辦法是在沸水浴中加熱，如果沒(méi)有完全融化的話再在微波爐中加熱數(shù)秒。3。 加入30mL預(yù)平衡至37的DMEM5 后充分混勻，這樣瓊脂糖的終濃度為1。25。立即使用。覆蓋QBI293A細(xì)胞：在進(jìn)行下一步操作之前，請(qǐng)確認(rèn)細(xì)胞是否已貼壁完好。1。 移去培養(yǎng)液，用1.25%瓊脂糖/DMEM混合物覆蓋單層細(xì)胞。2。 沿著培養(yǎng)板的邊緣將瓊脂糖輕輕加入，加入的具體體積參考表3，然后放回CO2孵箱培養(yǎng).表3：不同培養(yǎng)器皿應(yīng)用的瓊脂糖體積培養(yǎng)皿大小 首次量 追加量100 mm 10 mL 5 mL60 mm 5 mL

45、 3 mL6孔板 3 mL 1。5 mL空斑應(yīng)在1021天內(nèi)形成，為保持細(xì)胞活力，每45天或培養(yǎng)基變黃時(shí)追加瓊脂糖/DMEM混合物。5.3 MOI測(cè)定這一實(shí)驗(yàn)用來(lái)粗略估計(jì)病毒上清中病毒顆粒的數(shù)量（精確測(cè)定病毒顆粒數(shù)量見5。8節(jié)的滴度測(cè)定）。MOI測(cè)定通常在擴(kuò)增病毒尤其是在大量擴(kuò)增的時(shí)候使用,以確定感染的最佳條件.這一實(shí)驗(yàn)可在含有1×106QBI-293A細(xì)胞/孔的6孔板中進(jìn)行.1。 移去培養(yǎng)液，每孔加入500L新鮮的培養(yǎng)液2. 一孔為對(duì)照,其余每孔分別加入2、5、10、25、50L病毒上清.3. 不斷緩慢晃動(dòng)培養(yǎng)板,培養(yǎng)約3小時(shí)。4。 加入1.5mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時(shí).觀察每孔細(xì)

46、胞是否出現(xiàn)CPE，根據(jù)預(yù)先的估計(jì)，感染后3天細(xì)胞完全出現(xiàn)CPE的病毒MOI值為1020。這樣,根據(jù)感染的細(xì)胞數(shù)量，你就可以估計(jì)出上清中的病毒量。5.4 腺病毒感染力測(cè)定這一實(shí)驗(yàn)的目的是確定腺病毒是否能將DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入293之外的某一細(xì)胞株.該實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，因?yàn)樗鼘⒋_定腺病毒是否可應(yīng)用于這個(gè)細(xì)胞株,以及如果能應(yīng)用則需要多少的病毒量（也就是需要大量擴(kuò)增的程度）來(lái)完成整個(gè)研究.這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，如果用的是Ad5-CMVLacZ則檢測(cè)-半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP則檢測(cè)GFP。這些高滴度的產(chǎn)品都可單獨(dú)向昆騰公司購(gòu)買.本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照（-半乳糖苷酶檢測(cè))亦可向昆騰公司購(gòu)買,但由于

47、病毒滴度太低而不適于直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通常需要擴(kuò)增以達(dá)到理想的病毒滴度（擴(kuò)增步驟見5.6）.腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率各個(gè)細(xì)胞株都不太一樣，其中尤以淋巴細(xì)胞株最難轉(zhuǎn)導(dǎo)。腺病毒感染力測(cè)定通常在多孔板中進(jìn)行，MOI為1200，當(dāng)測(cè)定淋巴細(xì)胞株時(shí)MOI可至1000。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞株來(lái)說(shuō)，150的MOI值可將報(bào)告基因轉(zhuǎn)入所有的細(xì)胞而不會(huì)出現(xiàn)任何的毒性。在高M(jìn)OI情況下，某些病毒蛋白的高表達(dá)可對(duì)某些細(xì)胞產(chǎn)生毒性.無(wú)論MOI為多少，感染時(shí)都必須用最小的培養(yǎng)液體積并不斷晃動(dòng)，以使感染效果達(dá)到最佳。1. 按5.2。1中所述方法在6孔板中用不同數(shù)量病毒感染細(xì)胞（合適的MOI范圍），培養(yǎng)48小時(shí)。2。 進(jìn)行Xgal染色（見下述）

48、。注意細(xì)胞與病毒培養(yǎng)后不必清洗細(xì)胞，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中讓病毒留在培養(yǎng)液中。5。4.1 X-gal染色1。 棄去培養(yǎng)液，用37預(yù)熱的PBS沖洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆蓋細(xì)胞，0。05戊二醛室溫孵育515分鐘或2多聚甲醛室溫孵育60分鐘。2。 棄去固定液，室溫下用PBS徹底洗3遍:第一遍將沖洗液立刻棄去,第二、第三遍則讓沖洗液保留5分鐘.3. 加入最小體積的Xgal溶液。4. 37孵育1至12小時(shí)（過(guò)夜）,陽(yáng)性細(xì)胞將被染成藍(lán)色。染色完成后可將培養(yǎng)板置于4保存。溶液：a） 戊二醛固定液使用前將戊二醛用PBS稀釋至終濃度為0.05。b） 多聚甲醛固定液1. 將2g多聚甲醛溶解在5

49、0mL預(yù)熱至55的水中.2。 加入2滴10 N NaOH，溶液將變澄清.3。 待多聚甲醛溶解后，加入10mL 0.2M 磷酸二氫鈉(2。76g/100mL）和40mL 0.2M 磷酸氫二鈉（無(wú)水，3g/100mL）。4. 固定液在37條件下加入，在室溫下固定.多聚甲醛固定液可在4最長(zhǎng)保存一個(gè)星期。c） Xgal溶液用PBS制備(PH7.4）:20 mM氰鐵酸鉀 （ K3Fe(CN)6 ）20 mM氰亞鐵酸鉀 （ K4Fe（CN)63H2O ）2 mM MgCl2或MgSO4使用前加入X-gal儲(chǔ)存液（20mg/mL溶于N,N二甲基甲酰胺），終濃度為1mg/mL。上述三種X-gal染色用的溶液可

50、在室溫下保存數(shù)月,溶于N，N二甲基甲酰胺的Xgal儲(chǔ)存液則可于20在玻璃容器中儲(chǔ)存，用箔包裹后避光保存。5.5重組腺病毒的篩選和純化腺病毒轉(zhuǎn)移載體和腺病毒DNA通過(guò)在體同源重組產(chǎn)生重組腺病毒，這涉及到復(fù)雜的反應(yīng)和基因重排或突變,導(dǎo)致病毒呈現(xiàn)不同的表型。雖然重組腺病毒DNA在細(xì)菌內(nèi)重組后已篩選到含有插入基因，但我們還是建議按照下面的操作步驟對(duì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的重組腺病毒進(jìn)行鑒定。5。5。1 挑選最佳重組腺病毒:表達(dá)和基因輸送重組腺病毒的挑選取決于病毒表達(dá)蛋白和增殖的能力.比如有兩個(gè)不同特性的克隆，第一個(gè)克隆蛋白表達(dá)很好而且病毒可增殖至5000VP/細(xì)胞，而第二個(gè)克隆雖然蛋白表達(dá)水平只達(dá)到第一個(gè)克隆的7

51、5,但是卻可以增殖到10000VP/細(xì)胞。擴(kuò)增的時(shí)候，第二個(gè)克隆10L產(chǎn)量中的病毒數(shù)量即可達(dá)到第一個(gè)克隆20L的產(chǎn)量，這樣當(dāng)需要大量擴(kuò)增病毒時(shí)第二個(gè)克隆是較好的選擇，而且產(chǎn)物足以產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，.篩選方法的選擇取決于病毒最終的應(yīng)用.如果用于蛋白表達(dá)，那么必須使用能監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)水平的方法;如果要挑選能有效擴(kuò)增的克隆,那么就用能定量檢測(cè)DNA產(chǎn)量的方法。簡(jiǎn)單的重組腺病毒篩選可用PCR方法，這一技術(shù)只檢測(cè)病毒中的重組DNA，而不能篩選特定的表型.其它技術(shù)不但能篩選重組病毒，同時(shí)也能挑選特定的表型?？寺〉奶暨x可根據(jù):1. 每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生病毒的數(shù)量。這可以用Southern雜交的方法,因?yàn)椴《綝NA量與每

52、個(gè)細(xì)胞的病毒含量有關(guān)。能產(chǎn)生高水平病毒量的克隆有利于生產(chǎn)高滴度的病毒儲(chǔ)存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表達(dá)蛋白。2。 每個(gè)細(xì)胞蛋白表達(dá)的水平。這可以用Western雜交或功能測(cè)定的方法.請(qǐng)注意有些最佳克隆可能會(huì)較難培養(yǎng)。因此篩選方法的選擇取決于用來(lái)觀察生物學(xué)效應(yīng)的蛋白表達(dá)水平和重組腺病毒的最終應(yīng)用。表4提供了選擇最佳篩選方法的向?qū)?報(bào)告基因、表達(dá)蛋白的抗體和功能測(cè)定的敏感性將影響操作方法的選擇.得到最初結(jié)果的時(shí)間對(duì)方法的選擇也很重要，但這一原則必須慎重考慮，因?yàn)槿绻罱K目的是生產(chǎn)大量病毒，那么一個(gè)10倍量高產(chǎn)的克隆只需擴(kuò)增1L即能達(dá)到原來(lái)10L的病毒量,這時(shí)使用快速篩選方法所節(jié)省的時(shí)間會(huì)

53、在大量擴(kuò)增過(guò)程中完全耗費(fèi)掉。表4:各種篩選方法的特性篩選方法 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)Western雜交顯示表達(dá)蛋白的完整性 顯示插入基因的蛋白表達(dá)水平需要表達(dá)蛋白的抗體 可以用與其它蛋白有交叉反應(yīng)的抗體，因?yàn)榈鞍讜?huì)在膠上得到分離 得到最終結(jié)果需兩個(gè)星期Southern雜交或點(diǎn)雜交使用克隆基因作為探針，無(wú)須特殊試劑 通過(guò)信號(hào)強(qiáng)弱間接測(cè)定每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的病毒數(shù)量需從病毒儲(chǔ)存液中額外擴(kuò)增,整個(gè)流程需要一周時(shí)間 僅能檢測(cè)克隆的基因PCR 迅速，使用擴(kuò)增病毒的儲(chǔ)存液只需1天時(shí)間 僅能檢測(cè)克隆的基因且無(wú)法定量 可能需要優(yōu)化克隆基因的PCR條件免疫測(cè)定相對(duì)快速,總共需要3天時(shí)間 需要與細(xì)胞蛋白無(wú)交叉反應(yīng)的特異性抗體 顯示插

54、入基因的蛋白表達(dá)水平 功能測(cè)定 直接顯示蛋白的完整性和功能 需從病毒儲(chǔ)存液中額外擴(kuò)增,整個(gè)流程需要一周時(shí)間 對(duì)于大多數(shù)方法來(lái)說(shuō),信號(hào)密度與蛋白的表達(dá)水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的純度有關(guān)?？瞻呖偭恐械年?yáng)性率提示克隆的純度高低。比較不同克隆間的信號(hào)密度水平時(shí)克隆的純度非常重要，也就是說(shuō)必須保證所有篩選出來(lái)的空斑必須100陽(yáng)性。5.5.2病毒空斑挑選和小量擴(kuò)增通過(guò)AdEasyTM系統(tǒng)純化得到的細(xì)菌克隆而產(chǎn)生的病毒空斑應(yīng)該幾乎都是（95）重組病毒。每個(gè)細(xì)菌克隆最好測(cè)定至少12個(gè)空斑的表型。操作步驟1. 從培養(yǎng)板上挑選612個(gè)空斑，標(biāo)上圓圈.2。 無(wú)菌條件下用200L槍頭挑出克隆并轉(zhuǎn)入含0

55、。5mL DMEM5/孔的24孔板。3。 37病毒24小時(shí)。4. 鋪一塊每孔含1×105 QBI293A細(xì)胞的24孔板.5。 移去培養(yǎng)液，輕輕加入100L步驟3中清洗的病毒（約103病毒顆粒）,切勿將細(xì)胞吹起,十字型輕輕晃動(dòng)3次，轉(zhuǎn)入CO2孵箱37培養(yǎng)90分鐘。6。 加入DMEM5，使總體積為1mL，輕輕混勻。7. 37 CO2孵箱培養(yǎng)直至完全出現(xiàn)CPE，在此MOI值下一般需要510天。如果10天后還沒(méi)出現(xiàn)CPE，說(shuō)明此克隆的病毒量太低，需要進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。8。 為從細(xì)胞中釋放病毒，在20和37中充分凍融細(xì)胞3次.9。 收集細(xì)胞，在15mL離心管中打碎。臺(tái)式離心機(jī)上以最大轉(zhuǎn)速離心10

56、分鐘，收集上清并儲(chǔ)存于-80。這一凍存液中大約有5×107VP/mL.如步驟7中所述,如果在第一次擴(kuò)增后CPE不完全,則進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于QBI-293A細(xì)胞含有腺病毒基因組的E1區(qū),因此E1區(qū)缺失的腺病毒與人染色體發(fā)生同源重組而產(chǎn)生有增殖能力的腺病毒(RCA）的機(jī)率很低。發(fā)生這種回復(fù)突變的機(jī)率大約為1/107，這種腺病毒的增殖速度比重組腺病毒快。首輪擴(kuò)增產(chǎn)生的腺病毒保存液是十分重要的，因?yàn)樗蠷CA 的可能性最低。這種保存液必須節(jié)約使用，并保存好所有低代病毒，以便進(jìn)行大量擴(kuò)增,不可用已傳過(guò)數(shù)代的病毒進(jìn)行大量擴(kuò)增。低代病毒DMEM5溶液可在80條件下保存數(shù)年。所以，保存好低代病毒

57、可避免進(jìn)行重復(fù)篩選和純化病毒克隆的工作。在這一期間可以選擇適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)篩選重組病毒，當(dāng)所有病毒空斑100%為正確的重組病毒時(shí)可以認(rèn)為這個(gè)克隆為純的。如果此時(shí)病毒仍然不純，則可以進(jìn)行第二輪空斑純化，然后再用適當(dāng)方法進(jìn)行篩選。5.5.3 Western 雜交以下內(nèi)容提供了進(jìn)行Western雜交的一般指導(dǎo)。按照本手冊(cè)制備的初次病毒擴(kuò)增保存液已足夠用來(lái)檢測(cè)大多數(shù)腺病毒蛋白，SDS-PAGE、抗體反應(yīng)和檢測(cè)系統(tǒng)的具體操作請(qǐng)參考標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)。1. 在5×105細(xì)胞/孔的24孔板中每孔加入500L DMEM5%培養(yǎng)液，然后再每孔加入200L初次病毒擴(kuò)增保存液感染48小時(shí)。2. 確證所有細(xì)胞均出現(xiàn)CPE，如果CPE不完全則再延長(zhǎng)感染24小時(shí)。3。 取出400L轉(zhuǎn)入1。5mL試管中，其余-80凍存。4。 800rpm離心5分鐘，棄上清后用20L PBS重懸細(xì)胞，用P20移液槍充分混勻重懸細(xì)胞。5. 加入20L 2 × Laemmli緩沖液(注意：對(duì)于某些蛋白和抗體，這一步使用不含巰基乙醇的緩沖液至關(guān)重要）.6. 煮沸5分鐘。7. SDS-PAGE上樣。不同克隆