卵黃抗體在水產中的應用

1、卵黃抗體在水產上的使用狀況卵黃抗體又稱卵黃免疫球蛋白（IgY）,一般以雞作為供體，經(jīng)一種或多種特定抗原免疫誘導后在卵黃中蓄積，機體所產生的特異性抗體，具有類似哺乳動物IgG的免疫活性，可有效防治特定疾病。近年來，在畜禽疾病的診斷與防治方面卵黃抗體的運用已非常廣泛，可將其作為抗生素替代品或飼料添加劑等進行使用， 在動物養(yǎng)殖業(yè)中具有廣闊的應用前景。目前，用卵黃抗體防治水產動物疾病的研究報道較少，但因其具有療效確切、使用安全、無毒副作用、制備工藝簡單、生產成本低等優(yōu)點，使得以其防治水產動物疾病逐漸受到重視。1.IgY的發(fā)展以及研究狀況1893年，著名德國醫(yī)生萊比錫通過免疫蛋雞的試驗發(fā)現(xiàn)其所產雞蛋的蛋

2、黃中具有能中和免疫原的特異性蛋白質，即卵黃抗體IgY。自此，各國學者相繼對其分子結構、理化性質、制備工藝、檢測方法及應用等領域進行了廣泛而深入的研究。20世紀80年代以來，歸因于商品試劑的推廣，IgY抗體開始進入商品應用。1996年，IgY抗體的生產和應用被定義為IgY技術。如今，它己是一個世界性的標準化技術。1996年，歐洲實驗方法替換確認中心推薦使用IgY來代替哺乳動物IgG,以減少由于抗體采集而造成對動物的傷害。1999年，基于對動物權益的保護，IgY技術被瑞士聯(lián)邦政府獸醫(yī)辦公室接受為可行的替代辦法。美國的FDA己將特異性卵黃免疫球蛋白視為替代抗生素的首要候選藥物，日本政府投入巨資扶持禽

3、源抗體產業(yè)美國、韓國、臺灣等發(fā)達國家和地區(qū)利用卵黃抗體成功研制了各種功能性食品、飼料添加劑和防制動物疫病的生物制品。目前，在人類醫(yī)學、動物醫(yī)學、動物科學和其他諸多生命科學領域，有關卵黃抗體產品的研發(fā)與應用呈逐年上升趨勢，尤其是卵黃抗體代替抗生素在動物生產中的應用被廣泛認可。2.IgY的理化性質IgY是一種7s免疫球蛋白，分子量約180kD,由兩條重鏈（分子量67-70kDa）和兩條輕鏈（分子量22-30kDa即成，含氮量為14.8%。IgY的結構與哺乳動物的IgG相似，具有典型的免疫球蛋白的空間構象，也可與抗原結合。IgY的pH穩(wěn)定性較好，在pH4.0-11.0時比較穩(wěn)定，pH3.0-3.5時

4、活性迅速下降，pH12.0時活性亦有所下降，在pH12.0時迅速失活。止匕外，IgY也具有良好的耐熱能力。在低于75c條件下，具有良好的熱穩(wěn)定性，高于80c大部分IgY將失去活性。IgY制劑在4c存貯5年或在室溫貯存6個月其活性仍無明顯變化或下降，IgY對胃蛋白酶有較好的抵抗力，但對胰蛋白酶十分敏感。IgY具有耐巴氏消毒，而且耐反復凍融的特性。3.IgY的分離純化雞卵黃提供了一個大量的、廉價的、易純化的抗體來源。一只蛋雞每年可產200-300枚蛋，從一枚雞蛋中可獲得100-200mgIgY如何將大量的卵黃抗體提取出來，是決定IgY能否被廣泛應用的一個重要前提。雞卵黃中含有水48.0%蛋白質17

5、.8麻口脂肪30.5%,其中幾乎所有脂肪都與蛋白質相結合而以脂蛋白的形式存在。卵黃中不與脂肪結合的蛋白為水溶性蛋白，IgY則為水溶性蛋白，它以Y活性蛋白的形式與另外兩種水溶性蛋白-%活性蛋白（雞血清蛋白卜B活性蛋白以及其他各種脂蛋白一起存在于卵黃中。從卵黃中獲得IgY的過程包括分離、提取、純化。IgY分離純化的原則是簡便、高效、經(jīng)濟。目前常用的分離方法主要有：有機物沉淀法、 有機溶劑抽提法、 水稀釋法、 超臨界氣體提取法、 去污劑分離法等（表1）。為了將IgY提取出來，主要通過超濾法或沉淀法來完成。沉淀法所用的沉淀劑可以是無機物、有機物或有機溶劑，也可以采用多種方法聯(lián)合沉淀，或沉淀法和超濾法相

6、結合提取。其中水稀釋法最為簡單和經(jīng)濟，利用卵黃抗體可溶于水的特性，除去不溶的脂蛋白。Akita等使用此法，每毫升卵黃中獲得9.8mg的抗體，回收率達到了91%。有機物沉淀法使用的有機溶劑主要有PEG6000、硫酸葡聚糖等，有機溶劑如氯仿，生物制劑如角叉藻膠等也都能夠較好地去除脂蛋白，獲得卵黃抗體。為滿足不同的使用目的，多數(shù)情況下需對提取得到的卵黃抗體進一步純化，純化時常用的方法有：凝膠層析、離子交換層析以及親和層析。目前使用的提取、純化方法各有優(yōu)缺點：沉淀法簡單、經(jīng)濟，但其提取的物質純度低；親和層析能得到高純度的特異性卵黃抗體，但因產率低、費用高而不能得到大規(guī)模應用，僅適用于科研。從工藝路線上

7、看，水稀釋法具有工藝簡便、生產成本較低、采用適當?shù)姆椒ㄟM行純化，產品純度和回收率高等優(yōu)點，比較適合大規(guī)模工業(yè)化生產。4.IgY的穩(wěn)定性的保護對于幼齡動物，消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，IgY可抵抗其消化酶的消化，故可將一定量的針對某些疾病的IgY添加到飼料或飲用水中，使幼齡動物獲得被動免疫保護。對于成年動物，為了減少添加的IgY的損失，可采用一定的措施，如IgY的優(yōu)化和設計。Shimizu等(1992)用蛋黃中提取的卵磷脂和膽固醇為壁材，用脫水-復水法對IgY進行包埋制成脂質體，試驗發(fā)現(xiàn)脂質體包埋的IgY在酸性條件下穩(wěn)定性顯著提高！在pH2.8條件下處理1h后，穩(wěn)定性變化不大。止匕外，檸檬酸鹽、磷酸鹽

8、、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖等對IgY的熱穩(wěn)定性均有一定保護作用。Li等(2009)研究了以殼聚糖-海藻酸鈉微囊為載體對卵黃抗體的口服保護效果。5.IgY在水產上的應用5.1IgY在細菌性水產疾病中的應用在126種病害中，細菌性疾病有61種，約占48%。水產養(yǎng)殖細菌性疾病主要有弧菌病、愛德華氏菌病、出血病、爛鯉病、赤皮病、腐皮病、腹水病、細菌性敗血癥和細菌性腎病等。引起這些疾病的病原主要有：鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、燦爛弧菌、遲緩愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、鰻敗血假單胞菌和處魚腎桿菌等。目前，使用卵黃抗體技術防治水產動物細菌性疾病已有諸多研究報道且防治效果良好（見表1）。表1卵黃抗體在細菌性

9、水產疾病中的應用物種xx對蝦虹蹲虹蹲大菱鰥鰻鯽鰻鯽銀鯽銀鯽錦鯉香魚中華鱉中華鱉棘胸蛀疾病弧菌病弧菌病魯氏耶爾森氏菌病弧菌病遲緩愛德華氏菌病遲緩愛德華氏菌病嗜水氣單胞菌病嗜水氣單胞菌病敗血癥潰爛病鰻利斯頓氏菌病嗜水氣單胞菌病出血性敗血癥紅腿病病原菌溶藻弧菌鰻弧菌魯氏耶爾森氏菌鰻弧菌遲緩愛德華氏菌遲緩愛德華氏菌嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌殺處氣單胞菌鰻利斯頓氏菌嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌嗜水氣單胞菌效果飼喂提高存活率75%口服后死亡率15%,低于對照組的60%飼喂后死亡率13%,低于對照組的40%注射后死亡率最低11%,低于對照組的71%口服后免疫保護率100%口服后死亡率顯著降低投喂后存活

10、率77.8%,高于對照組的44.4%注射組的保護率為60%,對照組全部死亡浸浴治療組死亡率僅30%,低于對照組的80%W黃抗體組預防了潰爛病發(fā)作， 保護率100%灌胃后存活率80%,高于對照組的15%浸泡組存活率75%,口服組65%,對口組30%司喂組死亡率比對照組降低66.7%黃抗體組保護率達100%5.2IgY在病毒性水產疾病中的應用白斑綜合癥病毒是一種傳播速度快，傳染范圍廣的強感染力病毒，使對蝦養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟受損嚴重。雷勇等用提純的白斑綜合征病毒（WSS哪種蛋雞后制備卵黃干粉，將其按照0.1好口0.2%比例添加到螯蝦的基礎飼料中，連續(xù)投喂7d后進行攻毒試驗，攻毒后恢復相應的飼料投喂。結果表明

11、：低劑量組在攻毒后螯蝦死亡率雖然達到100%,但死亡時間得到延遲；而高劑量對螯蝦有明顯的保護作用，使其死亡率不到30%5.3IgY在水產品保鮮中的應用Xu等制備冷藏牙鰥的特定腐敗菌一腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的特異性卵黃抗體。在4c條件下，將試驗組魚片浸于100mg/mL的特異性卵黃抗體溶液中后無菌包裝，4c冷藏，每3d取樣進行微生物分析、化學分析和感官評定。結果表明，特異性卵黃抗體處理后，試驗組魚片的細菌總數(shù)明顯降低；貨架期從89d延長至1215d;化學分析結果證明，揮發(fā)性鹽基氮值和硫代巴比妥酸值均明顯低于對照組；感官評定中，評分低于4分（判定為不新鮮）的時間！也延長了3-6do微生物、化學

12、及感官指標保持很好的一致性。5.4IgY在水產寄生蟲診斷中的應用Young等制備了抗太平洋處魚微抱子蟲的特異性卵黃抗體。間接免疫熒光抗體試驗結果顯示，檢測固定化的Lomasalmonae抱子，有特異性熒光反應。免疫組化試驗結果顯示L.salmonae抱子在鞋魚各組織中染色程度強，最早可在接觸感染4周后，在鯉和心臟感染組織切片中，檢測出生長階段的寄生蟲寄主復合體。交叉反應試驗中，卵黃抗體與其他微抱子蟲如Pseudolomaneurophilia和Glugeaanomala無交叉反應，表明其具有良好的特異性，適于其他水產動物的病原診斷。6.IgY在水產上的應用方式用卵黃抗體控制水產動物疾病的方式主

13、要有注射、口服和浸浴。理論上認為，注射方式效果最為直接，血清中的抗體水平更高。用腹腔注射、口服和加入飼料中等方式研究抗鰻弧菌特異性卵黃抗體對虹醇的被動免疫保護作用發(fā)現(xiàn)，這3種方式均能明顯提高虹醇的抗病能力，其中注射效果最好，死亡率明顯低于口服組和飼喂組。卵黃抗體的使用方式不同，保護效果也不同。飼喂方式延長了卵黃抗體在胃酸和消化酶環(huán)境中的時間使卵黃抗體極容易被破壞，影響了其免疫保護效果。但是，注射對魚體刺激較大，腹腔注射卵黃抗體很容易引起魚體的免疫應答，使其產生相應抗體與之結合，調動其他免疫機制清除進入魚體的卵黃抗體。口服特異性卵黃抗體，能夠直接有效地抑制腸道病原菌的黏附、聚集和增殖，調節(jié)腸道菌群平衡。卵黃抗體使用方式不同、保護效果不同，其原因可能是不同病原菌對魚的感染方式不同。7.問題與展望卵黃抗體高效、低成本、收集抗體無需采血符合動物權益，且對環(huán)境友好，無毒副作用，無殘留，作為抗生素類藥物和化學保鮮劑的替代品，在水產疾病防治、水產