氟尼康的高效液相色譜分析

1、氟尼康的高效液相色譜分析李志偉收稿日期作者簡(jiǎn)介：李志偉（1977-），男，漢族，河北唐縣人，主要從事藥物分析和分離材料的研究。 劉佳 霍云霞 劉方方河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院 河北 石家莊 050018摘 要：目的 建立了同時(shí)檢測(cè)藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考的高效液相色譜檢測(cè)法。方法 采用Hypersil-ODS2 （250mm×4.6mm,5m）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈：甲醇：磷酸二氫銨（0.1mol·L-1）=10:11:29，pH=3.50，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為1mL·min-1。結(jié)果 實(shí)現(xiàn)了氟尼康中鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考的較好分離；鹽酸多西

2、環(huán)素在6.25g·mL-1200g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9994,平均回收率為99.29%，RSD為0.51%（n=3）；氟苯尼考在6.25g·mL-1250g·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999，平均回收率為98.87% ，RSD為0.32%（n=3）。結(jié)論 該方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可作為藥物氟尼康質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法關(guān)鍵詞：高效液相色譜，鹽酸多西環(huán)素，氟苯尼考，氟尼康Determination of funicon By High-Performance Liquid ChromatographyLI Zhi-we

3、i1, LIU Jia, HUO Yun-xia, LIU Fang-fang(1.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology ,Shijiazhuang 050018 ,China）ABSTRACT : AIM A method for determination of doxycycline hydrochloride and florfenicol in funicon was established. METHODS The liquid C

4、hromatography was carried out by a Hypersil-ODS2（4.6mm×250mm,5m）.The mobile phase was acetonitrile,methanol and 0.1mol·L-1 ammonium phosphate monobasic of pH 3.5(10:11:29) and the flow rate was 1mL·min-1. Funicon samples were measured with UV detector at 254 nm. RESULTS This experimen

5、t can get a better result of separation between doxycycline hydrochloride and florfenicol in funicon.The linear range of doxycycline hydrochloride was 6.25g·mL-1200g·mL-1 and florfenicol was 6.25g·mL-1250g·mL-1 (r=0.9999).The average recovery of doxycycline hydrochloride was 99.2

6、9%,relative standard was 0.51% (n=3). The average recovery of florfenicol was 98.87%,relative standard was 0.32% (n=3). CONCLUTION The method is simple,rapid and sensitive with good repeatability，can be used for content determination of funicon.KEY WORDS: HPLC doxycycline hydrochloride florfenicol f

7、unicon鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考為我國(guó)獸藥標(biāo)準(zhǔn)獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 第一冊(cè)中批準(zhǔn)的內(nèi)服藥。鹽酸多西環(huán)素（doxycycline hydrochloride）為四環(huán)素類光譜抗生素，主要用于革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌感染1。氟苯尼考（florfenicol）為氯霉素類廣譜抗生素，主要用于治療魚(yú)、豬、牛及家禽類的細(xì)菌性感染2。我國(guó)及歐盟、日本等國(guó)對(duì)鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)含量有嚴(yán)格要求，因此對(duì)于有治療作用的氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的含量的測(cè)定，需有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)定量測(cè)定。藥典中包含兩種物質(zhì)各自的檢測(cè)方法，而對(duì)于兩種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)沒(méi)有相應(yīng)的規(guī)定。因此，建立鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的同

8、時(shí)檢測(cè)的方法，在藥物生產(chǎn)和藥品檢驗(yàn)過(guò)程中極為重要。鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的檢測(cè)方法多采用薄層檢測(cè)法、氣相色譜法、液相色譜36等。本論文采用較為簡(jiǎn)單的溶劑作為流動(dòng)相，建立了同時(shí)檢測(cè)兩種物質(zhì)的高效液相色譜法，方法簡(jiǎn)便、精確、檢測(cè)靈敏度高，分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的依據(jù)和參考。1 材料與方法1.1 儀器與試劑儀器：高效液相色譜儀（LC-10ATvp日本島津公司）配SPD-10Avp紫外檢測(cè)器；TOP色譜工作站；針筒式微孔濾膜過(guò)濾器0.45m(天津市騰達(dá)過(guò)濾器件廠)； AL-204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；PHS-3CPH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），KQ32

9、00B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。試劑：鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、氟尼康（河北遠(yuǎn)征藥業(yè)提供）；甲醇 （色譜純，天津康科德公司）；乙腈（色譜純，天津康科德公司）；磷酸二氫銨（天津市博迪化工有限公司）；磷酸（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；三次蒸餾水。1.2 色譜條件色譜柱：大連依利特公司，Hypersil-ODS2 （4.6mm×250mm 5m i.d），流動(dòng)相為乙腈：甲醇：磷酸二氫銨（0.1mol·L-1）=10:11:29，pH=3.50，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為1mL·min-1，柱溫：30，進(jìn)樣量10L，靈敏度0.01AUFS。1.3 儲(chǔ)

10、備溶液配制分別精密稱取鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品各50mg，置于50mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，4冰箱冷藏待用。1.4 供試液的制備用研缽將氟尼康研碎后，稱取50mg，置于50mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相溶解后并定容，作為供試液，4冰箱冷藏待用。2 結(jié)果與討論2.1 流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)中考察了乙腈-水、甲醇-水的不同比例的流動(dòng)相對(duì)兩者的分離效果，鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的出峰時(shí)間相同，不能夠達(dá)到分離。因此將乙腈、甲醇以一定比例混合加入磷酸二氫銨的鹽溶液，對(duì)三種溶液比例進(jìn)行了調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)中隨著乙腈和甲醇比例的增加，兩種物質(zhì)出峰時(shí)間同時(shí)前移，分離效果漸差；當(dāng)乙腈比例逐漸

11、增大時(shí)，氟苯尼考的色譜峰型漸差；當(dāng)甲醇比例逐漸增大時(shí)，鹽酸多西環(huán)素的色譜峰型托尾嚴(yán)重；磷酸二氫銨鹽溶液比例增加時(shí)，兩種物質(zhì)出峰時(shí)間向后推移，且分離效果逐漸變優(yōu)，但鹽溶液加入過(guò)多時(shí)二者保留時(shí)間較長(zhǎng)，且分離不佳。此外pH值的確定也會(huì)同時(shí)影響二者的分離效果，適當(dāng)減小pH值，可以達(dá)到較優(yōu)的分離效果。實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)得到乙腈：甲醇：磷酸氫二銨溶液=10：11：29 ，pH=3.50，為最佳比例。2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇鹽酸多西環(huán)素的紫外吸收的最大波長(zhǎng)為269nm，氟苯尼考的紫外吸收的最大波長(zhǎng)為220nm，鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考結(jié)構(gòu)式中均含有苯環(huán)，因此為了使得兩者都能更好的檢測(cè)，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。藥品氟

12、尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖分別如圖1、2所示：鹽酸多西環(huán)素氟苯尼考圖1 藥品氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖Fig.1 Chromatograms of separation between doxycycline hydrochloride and florfenicol in funicon鹽酸多西環(huán)素氟苯尼考圖1 標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖Fig.2 Chromatograms of separation between doxycycline hydrochloride and florfenicol2.3

13、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確移取儲(chǔ)備液適量，并將儲(chǔ)備液置于容量瓶中，用流動(dòng)相定容，由此逐級(jí)稀釋得一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用孔徑0.45µm的有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)。在1.2條件下，進(jìn)樣分析，以其色譜峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，以分析樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。鹽酸多西環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y = -10611+3.5332×106C，r = 0.9994在6.25g·mL-1200g·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好；氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y =-292.97+1.99×105C，r = 0.9999在6.25g·mL-1250g·

14、mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好。2.4 回收率試驗(yàn)分別精密稱量0.080g、0.100g、0.120g的鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考置于10mL容量瓶，加入適當(dāng)流動(dòng)相定容，并定量稀釋成約80、100、120g·mL-1的溶液（每個(gè)濃度n=3），超聲溶解，用孔徑0.45µm的有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)。精密吸取上述溶液10L，注入液相色譜進(jìn)行分析，用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果如表1、2所示。表1 鹽酸多西環(huán)素的回收率試驗(yàn)Tab 1 Percent recovery of determination of doxycycline hydrochloride加入量g測(cè)得量g回收率%各組平均回

15、收率%各組RSD%平均回收率%0.0800.08020.080099.7599.210.5799.29±0.510.07990.078898.620.08030.079799.250.1000.10040.1005100.199.430.650.10040.099899.400.10030.099198.800.1200.11950.118499.0899.220.320.12030.119899.580,12010.118999.00表2 氟苯尼考的回收率試驗(yàn)Tab 2 Percent recovery of determination of florfenicol加入量g測(cè)得量g

16、回收率%各組平均回收率%各組RSD%平均回收率%0.0800.08030.079198.5198.290.2098.87±0.320.07970.078298.120.08000.078698.250.1000.10010.099199.0098.870.150.10020.099198.900.10050.099298.710.1200.12050.1207100.1799.470.610.12010.119199.170,12010.119099.082.5 精密度試驗(yàn)將鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考儲(chǔ)備液稀釋10倍，分別量取兩種溶液各25mL，均勻混合后，注入液相色譜進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣

17、七次，計(jì)算該方法的精密度，得到鹽酸多西環(huán)素的精密度為RSD=0.87%；氟苯尼考的精密度為RSD=0.72%。2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品溶液在自然光照射的條件下，在0、2、4、6、10、12h、24 h時(shí)測(cè)定其主成分峰面積，鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考二者峰面積基本不變，RSD分別為0.94%和0.83%，結(jié)果表明供試品氟尼康溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。3 小結(jié)經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，對(duì)檢測(cè)方法中使用的溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相等分析條件進(jìn)行了多次摸索，找到了一種在同一色譜條件下，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的同時(shí)檢測(cè)。本方法簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果可靠準(zhǔn)確。該方法亦可用做藥物氟尼康的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法，靈敏度高，顯示出較好的分離效果， 參考文獻(xiàn)1 徐群.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸多西環(huán)素原料藥中的有關(guān)物質(zhì).齊魯藥事.2006，25（3）：159-1602 郭霞，張素霞，沈建忠等.魚(yú)肌肉中氟苯尼考和氟苯