低密度脂蛋白對胰島細胞功能的影響

1、低密度脂蛋白對胰島細胞功能的影響【摘要】nbsp;目的：研究低密度脂蛋白對體外培養(yǎng)的胰島細胞功能的影響.nbsp;nbsp;方法：體外分離培養(yǎng)Wistar大鼠胰島細胞，并在低糖（2.8nbsp;mmol/L）和高糖（16.7nbsp;mmol/L）條件下與低密度脂蛋白(LDL)（從8nbsp;mg/L開始）培養(yǎng)48nbsp;h，應用放射免疫法 田利民,劉靜,高翠霞 第四軍醫(yī)大學學報 2005 年 7 月 第 25 卷 第 13 期 Effect of low density lipoprotein on islet cell functionTIAN LiMin, LIU Jing, GAO

2、CuiXiaDepartment of Endocrine Secretion, Gansu Provincial Peoples Hospital, Lanzhou 730000, China【Abstract】 AIM: To study the effect of low density lipoprptein (LDL) on the function of islet cell in vitro. METHODS: Wistar rat islet cells were isolated for cell culture and treated with LDL (from 8 mg

3、/L on) for 48 h. The cells were cultured with low glucose (2.8 mmol/L) and high glucose (16.7 mmol/L). Insulin secretion of rat islet cells stimulated by high glucose was measured by radioemmunoassay. RESULTS: No obvious effect was observed of the islet cells with LDL at low glucose level, while the

4、 insulin levels decreased in rat islet cells cultured with high glucose. Compared with LDL, the insulin levels of glucose stimulating insulin secretion (GSIS) increased in rat islet cells cultured with LDL combined with vitamins E and C for 48 h. CONCLUSION: Uptake of LDL by islet cells and subseque

5、nt oxidative reactions can damage the cells. This process can be counteracted by antioxidants.【Keywords】 islet cells; LDL; vitamins E,C【摘要】 目的：研究低密度脂蛋白對體外培養(yǎng)的胰島細胞功能的影響. 方法：體外分離培養(yǎng)Wistar大鼠胰島細胞，并在低糖（2.8 mmol/L）和高糖（16.7 mmol/L）條件下與低密度脂蛋白(LDL)（從8 mg/L開始）培養(yǎng)48 h，應用放射免疫法測定葡萄糖刺激的大鼠胰島細胞胰島素分泌量. 結果：低糖刺激下，LDL對胰島細

6、胞的胰島素分泌無明顯影響，但在高糖刺激下，胰島素分泌水平降低. LDL和抗氧化劑維生素E, C共同培養(yǎng)48 h，與LDL組比較，高糖刺激下胰島素分泌水平增加. 結論：胰島細胞攝入LDL后發(fā)生氧化反應，損傷胰島細胞功能，這一過程可被抗氧化劑抑制.【關鍵詞】 胰島細胞；低密度脂蛋白；維生素E,C0引言2型糖尿病患者常伴有脂代謝紊亂，以三酰甘油和低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）升高，高密度脂蛋白降低為主要特征. 近年來，國內外一些前瞻性研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的血脂代謝異常往往出現(xiàn)在糖代謝異常之前. 已有資料表明，在糖尿病大鼠體內，高三酰甘油血癥可引起三酰甘油在

7、胰腺內的沉積增加1-3，胰腺組織的病理切片顯示三酰甘油在胰腺的沉積增加可導致細胞減少至少50%以上4. 那么，LDL能否影響胰島細胞功能，是否為2型糖尿病發(fā)生的一個獨立危險因素？我們通過體外培養(yǎng)大鼠胰島細胞，探討LDL對胰島細胞功能的影響.1材料和方法11材料RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清、Hepes購自北京華美公司;膠原酶V，F(xiàn)icoll400, 雙硫腙、維生素E,C和BSA為Sigma公司產品. LDL購自北京協(xié)和醫(yī)科大學生化教研室. 胰島素放射免疫試劑盒購自北京原子能研究院. Wistar大鼠，雄性，體質量200250 g，由蘭州大學動物實驗中心提供.12方法1.2.1胰島細胞分離、

8、純化和鑒定取Wistar大鼠，水合氯醛按7.5 mL/kg大腿肌肉注射麻醉，750 mL/L乙醇浸泡5 min,無菌間超凈工作臺常規(guī)皮膚消毒，沿腹正中線剪開皮膚，充分暴露腹腔，尋找膽總管，并結扎其十二指腸入口處，逆行膽總管插管，注入膠原酶V（1 g/L）約810 mL，可見胰腺膨脹，順序分離胰腺，置預冷的DHanks液（5 mL）中，用DHanks液洗兩遍并用眼科鑷剪碎胰腺組織. 37水浴靜置消化20 min后，加入4DHanks液終止消化，吹散后過80目網(wǎng)篩，將濾過物800 r/min離心5 min，棄上清后沉淀物中加入Ficoll400梯度離心液（比重1.108,1.096,1.069,1

9、.037），1000 r/min離心10 min，對光亮，用裸眼在1.037與1.069，1.069與1.096層面提取白色粒狀懸浮物，用含血清的培養(yǎng)液離心洗兩遍，棄去上清夜，雙硫腙染色后倒置顯微鏡下細胞計數(shù)，臺盼藍染色觀察細胞活性.122胰島細胞培養(yǎng)將純化的胰島細胞置于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含150 mL/L胎牛血清，10萬u/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，10 mmol/L Hepes）, 37,含50 mL/L CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d后通過轉皿去除成纖維細胞，接種于24孔板（1105細胞/孔）中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每2 d換1次培養(yǎng)液，并于第7日開始加入處理因素.

10、取一24孔板中生長狀態(tài)良好的胰島細胞按實驗需要分成5組，每組設4個平行孔，分別加入100 L濃度為0, 8, 16.5, 33和66 mg/L的LDL. 同步取另一24孔板分為4組，每組同樣設4個平行孔，第1組不加處理因素，設為對照組；第2組加入33 mg/L的LDL;第3組加入維生素E（1 mol/L）和維生素C（50 mol/L）;第4組依次加入LDL和維生素E,C，濃度同上. 37,50 mL/L CO2孵育48 h.123葡萄糖刺激的胰島素釋放棄去每孔中原有培養(yǎng)液，用含葡萄糖2.8 mmol/L的KRB液（KrebsRinger buffer,主要含有以下成分：143.5 mmol/L

11、 Na+, 5.8 mmol/L K+, 2.5 mmol/L Ca2+, 1.2 mmol/L Mg2+, 124.1 mmol/L Cl-, 1.2 mmol/L PO4H2-, 25 mmol/L CO3H-, 1.2 mmol/L SO4H-, 3 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L Hepes和5 g/L BSA）處理胰島細胞1 h（饑餓試驗），吸取上層培養(yǎng)液待測；再用含16.7 mmol/L葡萄糖的KRB液行高糖刺激實驗，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后分別收集上清液. 采用放射免疫雙抗體法檢測以上留取液中的胰島素分泌量.統(tǒng)計學處理：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理. 計量資料采用x

12、s做描述，多組均數(shù)比較采用方差分析，方差不齊的采用KruskalWallis秩和檢驗. P0.05）;在高糖（16.7 mmol/L）刺激下，各處理組胰島素分泌量與對照組比較有顯著性差異（P0.05）,隨著LDL濃度增加，高糖刺激下胰島素分泌量逐漸下降. 高濃度（33 mg/L）與較低濃度（8，16.5 mg/L）組間比較，胰島素分泌量顯著降低（P0.05).表1不同濃度低密度脂蛋白作用下胰島素釋放量測定（略）23維生素E,C對LDL介導的胰島細胞損傷的保護作用（Tab 2）各處理組在低糖（2.8 mmol/L）刺激下，胰島素分泌量無顯著性差異（P0.05）；在高糖（16.7 mmol/L）刺

13、激下，LDL（33 mg/L）組胰島素分泌量顯著降低（P0.01）,LDL+維生素E,C組與LDL組比較，胰島素分泌量明顯增高（P0.05）.表2維生素E,C與LDL共同作用下胰島素釋放量測定（略）3討論我們的實驗結果表明，LDL作用于體外培養(yǎng)的大鼠胰島細胞，可引起葡萄糖刺激的胰島素釋放水平下降，說明LDL可以影響胰島細胞的功能. Grupping等5通過研究描述了在大鼠和人胰腺細胞上表達高親和性LDL受體（LDLR），它可以識別和結合所有脂蛋白. LDL可以被胰島細胞上LDLR結合并攝入. 可見，LDL對胰島細胞的作用主要發(fā)生在胰島細胞內，并對胰島細胞具有直接損傷的作用.Roehrich等6

14、研究報道，LDL在較低濃度（3.1 mg/L）作用于體外培養(yǎng)的大鼠胰島細胞時，可降低胰島素mRNA的表達，但并不引起細胞的死亡. 而Cnop等7研究認為，當LDL濃度達到25 mg/L時，70%的胰島細胞死亡. 本研究提示，在高糖負荷下，隨著LDL濃度增加，胰島素分泌量明顯下降，但在達到一定濃度（33 mg/L）后，胰島素分泌量極少. 這說明，在LDL達到一定濃度后，可大大降低胰島素mRNA的表達，同時損傷了大部分胰島細胞的功能.我們的實驗結果還表明，當LDL（濃度為33 mg/L）與維生素E,C混合物共同與胰島細胞培養(yǎng)48 h后，行葡萄糖刺激實驗，發(fā)現(xiàn)在高糖負荷下胰島素分泌量較LDL單獨作用

15、時明顯增加，說明維生素E,C可對LDL介導的胰島細胞損傷具有保護作用. 而維生素E的主要生理功能為抗氧化作用，它保護細胞膜中的多不飽和脂肪酸、細胞骨架及其他蛋白質的巰基和細胞內的核酸免受自由基攻擊8. 維生素C可通過增強內源性抗氧化劑作用和抑制Cu2+等氧化劑結合到載脂蛋白B上來阻止LDL過氧化作用9，10. 體外其他組織細胞研究表明，LDL的細胞毒作用與細胞膜攝取脂蛋白有關，所以與LDL相關的氧化反應出現(xiàn)在細胞內，同樣抗氧化劑的保護作用也存在于細胞內. 細胞內LDL氧化形成具有活性的膽固醇和脂肪酸超氧化物，并產生自由基反應11. 而與其他組織細胞相比，胰腺細胞內存在較低水平的抗氧化酶，如過氧

16、化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶，因此容易受到活性氧族（ROS）和脂質過氧化損傷12，13. 這就說明LDL對胰島細胞的毒性作用是由LDL對胰島細胞的氧化損傷造成的. 而在人體內血漿中含有許多抗氧化物質，其中一些可以在胰島細胞內被活化，保護胰島細胞；同時，由于高密度脂蛋白（HDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）的存在，在一定程度上可以阻止LDL的毒性作用. VLDL的保護作用在于它可以和LDL競爭性結合受體，而HDL可以使LDL氧化過程中產生的脂肪?；甘Щ?，使脂肪酸超氧化物生成減少14.已有研究證明，人類和大鼠胰島細胞上存在相似的LDL受體，胰島細胞結合并攝取LDL，最終形成細胞內脂

17、質積聚5. 當脂代謝紊亂，尤其是LDL升高，機體處于應激狀態(tài)，或體內抗氧化能力降低，LDL氧化產生胰島細胞毒作用，引起胰島素分泌水平下降，導致糖代謝紊亂. 這種胰島細胞的“脂毒性”目前已引起學術界的廣泛重視.【參考文獻】1 Man ZW, Zhu M, Noma Y, et al. Impaired cell function of fat droplets in the pancreas as a consequence of hypertriglyceridemia in OLETF rat,a model of spontaneous NIDDMJ. Diabetes, 1997;46(

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