免疫印跡試驗診斷兒童幽門螺旋桿菌感染評價

1、免疫印跡試驗診斷兒童幽門螺旋桿菌感染評價 作者：陳運生，周少明，劉彬，孫玲玲 【關(guān)鍵詞】 免疫印跡試驗 摘 要 目的：評價免疫印跡試驗(Western Blotting)在診斷不同年齡組及不同病理表現(xiàn)兒童幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,HP)感染中的應(yīng)用價值。方法：對450例有消化道癥狀的患兒，進行胃鏡檢查并取病變處胃黏膜組織行病理學(xué)檢查，以及13C尿素呼氣試驗(13Curea breath test,13CUBT)、血清免疫印跡試驗及胃液HPDNA PCR檢查。結(jié)果：在4歲6歲和6歲12歲組患兒中，13CUBT HP檢出率明顯高于免疫印跡試驗(P0.01)；在12歲18

2、歲組患兒中，13CUBT HP檢出率與免疫印跡試驗比較差異無顯著性(P0.05)。細(xì)胞毒性基因相關(guān)蛋白(Cytotoxinassociated gene protein)陽性的HP感染在潰瘍病組明顯高于慢性胃炎組和正常組(P0.05)，慢性胃炎組CagA(Cytotoxinassociated gene protein，CagA) 陽性 HP顯著高與正常組(P0.05)。結(jié)論：在12歲以上的少年患兒中，免疫印跡試驗可作為快速診斷HP感染的可靠手段，并且能判斷出是否為產(chǎn)毒菌株感染。在12歲以下的兒童中，免疫印跡試驗最好與13CUBT聯(lián)合使用。 關(guān)鍵詞 免疫印跡試驗；13C尿素呼氣試驗；幽門螺旋桿

3、菌；細(xì)胞毒性基因相關(guān)蛋白；兒童 The Evaluation of Western Blotting Method for the Diagnosis of Helicobacter Pylori Infection in Children Abstract：Objective To evaluate the accuracy of the Western Blotting test in the diagnosis of Helicobacter pylori(HP) in different age groups with various gastric illnesses in chil

4、dren.Methods 450 children with digestive tract symptoms were tested for HP using pathological histology,13CUBT,serum western blotting and HPDNAPCR.Results In the groups with ages from 4 to 6 and 6 to12 years the detection frequency using13CUBT were significantly higher than Western blotting (P0.01).

5、In the group with ages from 12 to 18 years,there was no difference between13CUBT and Western Blotting in detection(P0.05).Positive rate of Cag A antibody in peptic ulcer group was significantly higher than that of chronic gastritis group (P0.05),Positive rate of Cag A antibody in chronic gastritis g

6、roup was significantly higher than that of normal control group (P0.05).Conclusion It is rapid and dependable that the Western Blotting can be used to examine the HP antibodies in children with ages above twelve years and to determine the type of HP. Key words：Western Blotting;13Curea breath test;He

7、licobacter pylori;Cytotoxinassociated gene protein;Children 幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,HP)與胃腸疾病的發(fā)病關(guān)系目前正在被廣泛研究。HP的致病因素包括CagA、VacA、菌毛、尿素酶、鞭毛等，其中以CagA、VacA最為重要，它們是HP毒力的標(biāo)志1。免疫印跡試驗判斷出有無HP感染，并可區(qū)分HP感染的類型，在成人HP感染性疾病的診斷中已得到越來越多的重視。但在診斷兒童HP感染中的價值國內(nèi)鮮見報道。本研究以2002年10月至2004年9月在我院消化科就診的部分患兒為研究對象，探討免疫印跡試驗在診斷兒童HP感染及

8、判斷其致病性中的作用。 1 資料與方法 1.1 臨床資料 450例病例均為我院2002年10月至2004年9月消化科患兒，年齡4歲18歲，全部病例均有腹痛、惡心、厭食、嘔吐等消化道癥狀，病程均在3個月以上。檢查前4周內(nèi)均未使用抗生素。其中4歲6歲患兒56例，確診HP感染18例；6歲12歲患兒202例，確診HP感染123例；12歲18歲患兒192例，確診HP感染146例。根據(jù)胃鏡及病理檢查結(jié)果分為：正常64例，確診HP感染21例；慢性胃炎及十二指腸球炎248例，確診有HP感染161例；胃十二指腸潰瘍138例，確診HP感染105例。 1.2 方法 1.2.1 應(yīng)用Pentax FC 24纖維胃鏡，

9、由同一人操作。小兒慢性胃炎及胃潰瘍的診斷按照小兒慢性胃炎、消化性潰瘍胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)進行2。取病變處組織2塊，應(yīng)用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，常規(guī)病理檢查。 1.2.2 HPDNA檢測(PCR法) 留取胃液2 ml，使用PE5700基因擴增儀，試劑由達(dá)安基因診斷中心提供。 1.2.3 免疫印跡檢查 空腹抽取靜脈血2 ml，立即分離血清，-70 凍存待查。采用深圳市伯勞特生物制品有限公司生產(chǎn)的HP免疫印跡試劑盒進行檢測，嚴(yán)格按照操作說明書進行。顯色后比對試劑盒所附的標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量卡，即可測得血清樣本中是否存在CagA的相應(yīng)抗體。 1.2.4 13CUBT 受檢患兒空腹4 h以上，先口

10、服一杯實驗餐，收集零時的呼氣作為空白對照。后飲用溶有13C標(biāo)記的尿素溶液50 ml，飲用后30 min收集呼氣，密封待查。使用Isodiagnostika公司生產(chǎn)的ISOMAX2000設(shè)備，試劑由同一公司提供。 1.2.5 HP陽性結(jié)果判斷 以三項試驗(HPDNAPCR法、免疫印跡檢查、13CUBT)中任兩項陽性為確診HP感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。 1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 不同組別之間HP檢出率的比較采用2檢驗。2 結(jié)果 在4歲6歲和6歲12歲組患兒中，13CUBT HP檢出率明顯高于免疫印跡試驗(P0.01)；在12歲18歲組患兒中，13CUBT HP檢出率與免疫印跡試驗比較差異無顯著性(P0.05)。見

11、表1。表1 不同年齡組13CUBT與免疫印跡試驗檢出率的比較（略） 細(xì)胞毒性基因相關(guān)蛋白陽性(CagA+)的HP感染在潰瘍病組明顯高于慢性胃炎組和正常組(P0.05)，慢性胃炎組CagA+HP顯著高與正常組(P0.05)。見表2。表2 不同組別CagA陽性HP感染率的比較（略）注：*表示正常組與潰瘍組比較P0.01；*表示胃炎組與正常組比較P0.05；*表示潰瘍組與胃炎組比較P0.05。 3 討論 HP于1983年由Warren和Marshall兩位學(xué)者從胃黏膜中培養(yǎng)分離出以來，大量研究認(rèn)為，HP是消化性潰瘍、慢性活動性胃炎等上消化道疾病的主要致病因素。HP毒素按其分子質(zhì)量可分為兩種：一種為相

12、對分子量為128 000的細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)，另一種為相對分子質(zhì)量為87 000的空泡細(xì)胞毒素(VacA)。根據(jù)HP分泌毒素的情況不同可以將其分為產(chǎn)毒菌Tox+和非產(chǎn)毒菌Tox-，而研究表明Tox+菌其CagA蛋白幾乎均為陽性，因此臨床上將有CagA表達(dá)的HP稱為型HP，其致病力強，國內(nèi)李庭贊等3研究證明在成人慢性性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病發(fā)生中型HP是重要的致病因素，型為無CagA表達(dá)的HP菌株，其毒性很弱。感染后可能發(fā)病較輕或不發(fā)病。免疫印跡試驗?zāi)軈^(qū)分HP的類型。其工作原理是：先將HP的混合抗原用聚丙烯酰胺凝膠電泳，按分子量大小不同分開，再將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，應(yīng)用酶聯(lián)免疫

13、吸附反應(yīng)，受檢者的血清相關(guān)抗體會與抗原結(jié)合，在相應(yīng)分子量的位置上出現(xiàn)顯色區(qū)帶，據(jù)此可判斷HP的存在并區(qū)分感染的類型。 目前檢測HP感染的方法很多，13CUBT被認(rèn)為是一種測定小兒HP感染可靠的診斷方法，具有較高的敏感性和特異性4。本文將免疫印跡試驗的HP檢出率與13CUBT的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)在12歲以下組13CUBT法 HP檢出率明顯高于免疫印跡試驗；在12歲18歲組患兒中，13CUBT法HP檢出率與免疫印跡試驗比較差異無顯著性。這可能與年齡較小的患兒免疫功能較低，不能產(chǎn)生足夠的抗體有關(guān)。證明免疫印跡試驗不能單獨檢驗?zāi)暧變和腍P感染。此觀點與Oliverira等關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA

14、)測定12歲以下患兒血清HPIgG敏感性太低的結(jié)論一致5。 進一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性基因相關(guān)蛋白陽性(CagA+)的HP感染在消化道潰瘍病組明顯高于慢性胃炎組和正常組，慢性淺表胃炎組CagA+HP顯著高于正常組。說明I型HP感染與兒童胃炎及消化道潰瘍也有密切關(guān)系，細(xì)胞毒素可能是消化道潰瘍形成的主要原因。 顯然，對于12歲以上的患兒，免疫印跡試驗試驗可作為快速診斷HP感染的方法之一，其優(yōu)點在于在檢出細(xì)菌的同時能作出分類，因此能有效指導(dǎo)臨床用藥。此檢查特點為：非侵入性，易為患兒接受；用血少,方法簡單，實驗條件要求低；檢測時間短，能快速出結(jié)果。但對于12歲以下的患兒由于其檢出率有限，建議與13CUBT聯(lián)合應(yīng)用。 參考文獻(xiàn)： 1陳敏章，胡伏蓮，周殿元,等.幽門螺旋桿菌感染的基礎(chǔ)與臨床M.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社,1997：106107. 2陳潔，吳秀英.小兒慢性胃炎、消化性潰瘍胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)J.中華兒科雜志，1996,34(5)：296297. 3李贊庭，陳志坦，孫丹莉,等.HP和CagA+HP與中國人慢性胃炎、胃腺癌、消化性潰瘍的關(guān)系J.臨床內(nèi)科雜志，2001,18(1)：2830. 4樓金吐，陳肖肖，曲一平,等.13C尿素呼氣試驗診斷兒童幽門螺旋桿菌感染的臨床評估J.檢驗醫(yī)學(xué)，2005,20(2)119120. 5De Oliveira AM，Rocha GA