畢赤酵母表達載體及宿主菌介紹

1、由于甲醇營養(yǎng)型酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒， 所以攜帶外源基因的重組體必須整合于染色體中才 能實現(xiàn)外源基因的表達。 整合表達的優(yōu)點在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產(chǎn)生多拷貝基因。 典 型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構(gòu)包括：5' AOX啟動子片段、多克隆位點（MCS）、轉(zhuǎn)錄終止和polyA形成基因序列（TT）、篩選標記（His4或Zeocin）、 3' AOX基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)?；?COLE1 序列。如果是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5'端和啟動子的 3'端之間插人了分泌作用

2、的信號肽序列。 在這個分泌信號的引導(dǎo)下， 外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細胞外。 為方便于操作，通常表達載體都是穿梭質(zhì)粒。表達載體與酵母染色體有單交換和雙交換整合 2 種方式，單交換整合時， 或插入 A0X1 位點， 或插入 his 位點。有文獻報道，以 his4 作為整合位點時，染色體突變株與表達盒間存在基 因轉(zhuǎn)換，偶而可使 Laz 表達盒丟失， 故 AOX1 位點更好。一般認為，單交換轉(zhuǎn)化效率比雙交 換效率高，且易得到多拷貝整合，其發(fā)生機制可能是重復(fù)單交換引起的。攜帶外源基因的表達載體可通過電穿孔、 原生質(zhì)體生成法或全細胞法轉(zhuǎn)化酵母細

3、胞。 甲醇酵 母轉(zhuǎn)化和大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)化不同之處是前者較為復(fù)雜。 對于大腸埃希氏菌而言， 只要把重組 表達載體導(dǎo)入細胞體內(nèi)即可。 因其載體上攜帶有自身復(fù)制原點， 可隨染色體復(fù)制而復(fù)制， 重 組表達載體能夠穩(wěn)定存在。 在甲醇酵母系統(tǒng)中， 所有的表達載體均不含酵母復(fù)制原點。 這就 是說， 導(dǎo)入酵母體內(nèi)的重組表達載體只有和酵母染色體上的同源區(qū)發(fā)生重組，整合到染色體上，外源基因才能夠穩(wěn)定存在， 外源蛋白才能得到穩(wěn)定表達， 這種整合的轉(zhuǎn)化子一旦形成就 非常穩(wěn)定。如果轉(zhuǎn)化后的重組表達載體未能整合到染色體上， 而是以游離的附加體形式存在， 這種轉(zhuǎn)化子就不穩(wěn)定， 重組表達載體極易丟失。 所以， 載體必須整合入酵

4、母基因組中才能實 現(xiàn)異源蛋白的穩(wěn)定表達。多數(shù)情況下，外源基因多拷貝整合可提高表達水平。一般可采用如下3 種方法建立多拷貝表達株： 在表達載體中插入首尾相連的多拷貝表達盒； 在表達載體中插入細菌 Tn903Kan 基因，因 G418 抗性水平與載體拷貝數(shù)呈正相關(guān)； 應(yīng)用含細菌 Shble 基因的表達載體， 如 pPICZ 系列，該載體較小，易擴增，具有真光霉素 抗性。1、啟動子最常用的啟動子是 AOX1 啟動子 (AOXl， promoter ，PA0X) ，它的甲醇誘導(dǎo)性很強，因而它 控制下的外源基因能得到較高的表達。 A0X1 基因是從用 RNA 構(gòu)建的 cDNA 文庫中分離的， RNA 來

5、自克隆篩選能在甲醇培養(yǎng)基上生長的PPasotris 細胞。P. Pasotris基因組包含2個基因：A0X1和A0X2，編碼乙醇氧化酶。在序列上這2種AOX蛋白同源性97%,并有相似特殊活性，但A0X1表達水平明顯高于 A0X2,即啟動能力A0X1 大大強于A0X2。細胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶的活力是由A0X1提供的。當(dāng)以甲醇為唯一的生長碳源時, A0X1 基因的表達被甲醇嚴格調(diào)控,并被誘導(dǎo)到相當(dāng)高的水平,可占整個細胞 可溶蛋白的30 %以上。A0X1和A0X2同源性雖然高達 97%，但A0X2只承擔(dān)很少一部分 活力。當(dāng) A0X1 基因缺乏而只存在 A0X2 時,大部分乙醇氧化酶的活力喪失,細胞

6、利用甲醇 能力降低。因此細胞在甲醇介質(zhì)上生長很慢,這種菌株被稱為Muts；A0X1 基因存在時,細胞利用甲醇能力正常,在甲醇介質(zhì)上生長較快,這種菌株表型被稱為Mut+。A0X1基因的表達為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。以甲醇為碳源時，生長細胞中約5 % mRNA來自于A0X1基因。 A0X1 基因的調(diào)控是兩步過程：抑制機制加上誘導(dǎo)機制。即在以葡萄糖或甘油為碳源 的培養(yǎng)基上生長時抑制轉(zhuǎn) 錄；而在以甲醇為唯一生長碳源時,誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄,蛋白表達。最近在P. Pasotris中克隆到一個組成型啟動子：PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子 )，在它控制下的 p.Lacz 基因表達 率比甲醇誘導(dǎo)下的以 PA0X1 為啟動子

7、的產(chǎn)量更高。由于該組成 型啟動子不需甲醇誘導(dǎo),發(fā)酵工藝更為簡單,產(chǎn)量高,所以它是一個很有潛力的啟動子。2 、選擇標記選擇標記一般為對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因,常用 HIs4 。由于 PPasotris 不利用 蔗糖，所以也可用啤酒酵母的蔗糖酶基因suC2作為標記。AMP :氨芐抗性基因，可在大腸桿菌中篩選。 G418和Zeoci nr(ln vitroge n , san diego , CA)也是篩選標記，使得到高拷貝的 轉(zhuǎn) 化子,這是因為表達載體上外源基因和卡那基因相偶聯(lián)。Zeocinr 在 E.coli 和 P.Pastoris宿主中都表達,因此縮短了穿梭載體的長度,但 Zeoci

8、n 是一種強誘變劑,可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子3、信號肽序列表達蛋白的分泌需要信號肽引導(dǎo)并沿一定途徑才能分泌至細胞外。 P.Pastoris 自身分泌的蛋白質(zhì)很少， 分泌表達是一種理想的表達方式， 胞外表達有利于蛋白質(zhì)的提取和純化， 同時有助于不分泌型的蛋白質(zhì)使其分泌，而像人血清蛋白(HSA) 和牛凝乳酶 (Rennin) ，用自身信號肽序列即可在 PPastoris 中成功表達。 然而， 對于有些蛋白的自身信號肽， P.Pastoris 不能 有效利用，如反轉(zhuǎn)錄酶。甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)一般利用 2 種來源的信號肽序列：一是外源基因本身攜帶的信號 肽序列；二是來源于酵母的信號肽序列，如a- 因子、 PH

9、O1 信號肽序列。 P.Pastoris 信號肽主要包括磷酸酶(PHO)、轉(zhuǎn)化酶(inertase)和a因子，其中 a因子信號肽(MF)使用最廣。a因子信號序列是由 87個氨基酸組成，來自于S.cerevsiae的a性成熟因子前導(dǎo)序列，并且已將這段序列編碼的信號肽插入到幾個P.Pastoris的表達載體中(Invitrogen)。在構(gòu)建a-因子信號肽融合基因時，需保留KeX2蛋白酶切位點附近的谷氨酸一丙氨酸(Glu-Ala)間隔區(qū)，GluAla 的存在會避免錯誤切割的發(fā)生。 研究證明： 信號肽引導(dǎo)的外源蛋白在 P.Pastoris 中均 能被有效切割。a-MF 是在高爾基體中被 KeX2 蛋白

10、酶識別并切割，而 PHO1 一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被切割。酵母細胞對信號肽序列的識別有一定的靈活性， 在一定程度上可以識別外源蛋白的信號肽進 行蛋白輸送，但利用外源基因自身信號肽序列不能得到高表達量和高分泌效率。來源于P.pastoris酵母酸性磷酸酶(PHO1)基因的信號肽序列也常用于甲醇營養(yǎng)型酵母表達載體，由該信號肽引導(dǎo)的蛋白一般僅能分泌至膜周質(zhì)，分泌效應(yīng)不如a-因子信號肽強。4 、載體( 1 )表達載體種類有幾種甲醇酵母是用于表達外源蛋白的受體菌，如GS115， KM71 和 SMD1168 等，它們都是組氨酸缺陷型。 如表達載體上攜帶有組氨酸基因， 可補償宿主的組氫酸缺陷， 因此可以在 不含組氨

11、酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。這些受體菌自發(fā)突變?yōu)榻M氨酸野生型的概率一般低于10-8 ，通常不予考慮。 GS115 表型為 Mut+ 。重組表達載體轉(zhuǎn)化 GS115 后，長出的轉(zhuǎn)化子既有可能是 Mut+，又有可能是 Muts，可以在 MM和MD培養(yǎng)基上鑒定表型。SMDI168和Gsll5 類似，不同的是它是蛋白酶缺陷型，可減弱蛋白酶對外源蛋白的降解作用。KM71 沒有 AOX1 基因，本身就是 Muts ，因此轉(zhuǎn)化后所有的轉(zhuǎn)化子都是 Muts ，不必鑒定表型。Invitrogen 公司構(gòu)建的多種 P.Pastoris 表達載體，既有胞內(nèi)表達的，又有分泌表達的。這些載體都包括一個表達盒 (casset

12、te)，它是由0.9 kb的5 A0X序列片斷和約0.3 kb的轉(zhuǎn)錄終 止基 因的 3'序列組成。 分泌型表達載體主要有 pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcza，pYAM75P6； 胞內(nèi)表達的載體主要有： pHIL-D2 ， pA0815 ， pPIC3K， pPICZ， pHWO1 0 ， pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen) 等。這些載體在結(jié)構(gòu)上有共同點：AOX1 ：含有 AOX1 啟動子，可調(diào)控異源蛋白表達，同時也是載體和受體菌染色體發(fā)生重組的位點；McS:多克隆位點，允許外源基因插入；Sig：編碼N末端信號肽序列，可引導(dǎo)蛋白分泌；1vr :轉(zhuǎn)錄終止和

13、多聚腺苷酸化序列，允許 mRNA 有救轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化3' AOx：1 TT 序列下游區(qū)域，同源重組位點之一；His :編碼組氨酸，提供轉(zhuǎn)化子的篩選標記，也是重組位點之一；Amp ：氨芐抗性基因，允許在大腸桿菌中篩選。按 Invitrogen 公司推出的 Kit 可分為 3 類。第一類屬高拷貝型：如 pPIC3K 和 pPIC9k 都攜 帶有卡那基因， 可通過提高 G418 濃度， 很容易得到高拷貝的轉(zhuǎn)化子。 PA0815 是先在體外 構(gòu)建串聯(lián)的外源基因多拷貝 (可連接 8 個拷貝子 )，轉(zhuǎn)化后可得到已知的多拷貝轉(zhuǎn)化子。 第二 類為易篩選型： pPIczA ， pPIcza ，不

14、需要營養(yǎng)缺陷篩選、不需要氨芐抗 性篩選，且載體小， 易操作。但是篩選標記為Zeocin，它是很強的誘變劑，可使外源蛋白突變。第三類為原始型： pPIc9 等操作繁瑣，是單一拷貝，有高水平表達外源蛋白的時候，但不多見。酵母表達載體有多種， 采用較多的是整合型表達載體， 可通過整合型載體將外源基因整合到酵母染色體上，獲得遺傳性穩(wěn)定重組子，而且能通過前導(dǎo)信號肽引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達。 并能識別及有效地切割這些信號肽。外源基因在酵母中的表達一般是采用酵母基因的啟動 子。目前， 利用最多的是美國 Invitrogen 公司出售的畢赤酵母表達載體和相應(yīng)的試劑盒。 該 公司構(gòu)建了多種甲醇酵母表達載體， 既有

15、胞內(nèi)表達的， 又有分泌表達的， 該種表達載體表達 外源蛋白時，需要加人甲醇進行誘導(dǎo)，不利條件是在表達產(chǎn)物中引人了有毒的甲醇。典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構(gòu)包括：5' AOX啟動子片段、多克隆位點（MCS卜轉(zhuǎn)錄終止和polyA形成基因序列（TT）、篩選標記（His4或Zeocin）、 3' AOX基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)?；?COLE1 序列。如果是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5'端和啟動子的 3'端之間插人了分泌作用的信號肽序列。在這個分泌信號的引導(dǎo)下， 外源蛋

16、白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細胞外。pGAP 系列表達載體美國Invitrogen公司的產(chǎn)品 pGAeZ和pGAPza，是一種無需甲醇誘導(dǎo)而能表達外源蛋白的畢赤酵母載體。 pGAP 系列是典型的組成型酵母表達載體，為穿梭型表達載體，能在大腸 桿菌和酵母中進行遺傳復(fù)制。是以畢赤酵母中磷酸甘油酸脫氫酶（GAP）基因啟動子作為外源基因啟動子， 該啟動子是組成型表達的， 所以不存在誘導(dǎo)的問題， 在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng) 基上就可以表達。通過利用美洲小長尾猴重組a-1,3半乳糖轉(zhuǎn)移酶，來表達a-半乳糖抗原，在 Pcha pastor s 酵母中獲得了表達。是在PGAP 啟動子的啟動下，分泌到培養(yǎng)基中，并且表達產(chǎn)物與 6X His尾巴相融合，以利于純化。同時，由于不用加人甲醇進行誘導(dǎo)，所以在表達產(chǎn)物中不會引人有毒物質(zhì)，有利于表達產(chǎn)物的商品化。（ 2 ）表達載體的整合方式整合載體轉(zhuǎn)化受體菌時， 可以和染色體上的相應(yīng)位點發(fā)生互換， 從而整合到酵母菌染色體上。 通常有以下幾種整合方式： 雙位點互換