α雙炔失碳酯對激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP生長的影響

1、?雙炔失碳酯對激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP生長的影響    【摘要】  目的 探討雙炔失碳酯單體（?anordrin, ?ANO）對激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP生長的影響。 方法 采用氧化鋁柱層析分離純化雙炔失碳酯(ANO)的和差向異構體，SRB細胞染色法檢測?ANO對LNCaP細胞生長的影響及對抗雄激素擬似劑R 1881促細胞生長的作用；觀察?ANO作用下細胞形態(tài)學變化；ELISA法檢測?ANO對LNCaP細胞分泌前列腺特異性抗原（PSA）的影響。結果 常規(guī)培養(yǎng)液中?ANO（8,12,16,24,32 mol/L）作用LNCaP細胞后

2、，細胞存活率分別為85.8%，51.5%，40.8%，29.2%，1.0%；在去除激素培養(yǎng)液中，?ANO抑制細胞生長作用更強，能對抗R1881的促細胞生長作用，經(jīng)?ANO處理的LNCaP細胞分泌PSA能力降低。 結論 ?ANO抑制激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP的增殖，具有抗雄激素促細胞生長的作用。【關鍵詞】  前列腺腫瘤; 去甲雄烷類； 選擇性雌激素受體調節(jié)劑； 前列腺特異抗原； 細胞系，腫瘤ABSTRACT:  Objective  To investigate the effects of ?anordrin（?ANO）on the growth of an

3、drogen?dependent human prostate cancer cell line LNCaP.  Methods  The monomers of ?ANO and ?ANO were purified through alumina column chromatographic separation.  SRB staining method was used to detect the effects of ?ANO on the growth of LNCaP cells and on antagonizing R1881(a kind of

4、 androgen stimulant) in inducing LNCaP cells proliferation.  Cell morphology was examined under microscope.  ELISA was used to examine the effect of ?ANO on PSA secretion by LNCaP cells.  Results  In normal medium，after LNCaP cells were treated with ?ANO at 8,12,16,24 and 32 mol/

5、L，cell survival rates were 85.8%, 51.5%, 40.8%, 29.2%, 1.0% respectively.  In the androgen?depleted medium, ?ANO could antagonize LNCaP cell proliferation induced by R1881.  The PSA secretion of LNCaP cells was also decreased.  Conclusion  ?ANO inhibits the proliferation of andro

6、gen?dependent human prostate cancer cell line LNCaP.  In the presence of androgen, ?ANO antagonizes the LNCaP cell proliferation induced by androgen.   KEY WORDS:  prostatic neoplasms; noranotrostanes; selective estrogen receptor modulators; prostate specific antigen; cell line,

7、tumor選擇性雌激素受體調節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators,SERM）是指能與雌激素受體相互作用，依據(jù)靶組織和激素內(nèi)環(huán)境的不同而產(chǎn)生特異作用的-類化合物。它們對雌激素有雙相作用，即能抗雌激素又具有擬雌激素樣作用。SERM已被證實可治療乳癌、骨質疏松和心血管疾病；并可能預防前列腺癌（prostate cancer, Pca）1?2。尋找新的理想的SERM是目前研究熱點。   雙炔失碳酯（2，17?雙乙炔基A環(huán)?失碳雄烷?2，17雙羥基雙丙酸酯,anordrin,ANO）是甾體A環(huán)失碳雄甾烷衍生物3，臨床上用于抗著床、抗早孕。

8、藥理活性研究表明ANO具有強的抗雌激素作用和弱的雌激素樣活性4，與SERM類藥物特點相似。文獻報道，ANO在合成過程中，同時生成2個炔基構型不同的異構體: ?ANO和?ANO。?ANO對多種腫瘤細胞包括HL?60、人卵巢癌細胞等有直接殺傷作用5。筆者觀察?ANO對激素依賴人前列腺癌細胞LNCaP生長的影響，報道如下。1  材料和方法1.1  材料1.1.1  試劑與儀器  ANO（上海信誼醫(yī)藥集團），純度均>99%；R1881（Methyltrienolone，美國加洲大學洛杉磯分校癌癥中心陳德桂博士惠贈）；RPMI 1640培養(yǎng)基，IMDM，無酚

9、紅IMDM，胎牛血清，活性炭處理的血清(CS?FBS)，含0.02%EDTA胰酶（美國Gibco公司）；前列腺特異抗原（prostate specific antign,PSA)ELISA試劑盒（美國DSL公司）；羅丹明B(SRB)（美國Sigma公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；酶標儀550型（美國Bio?Rad公司）。1.1.2  細胞株與細胞培養(yǎng)  人前列腺癌細胞LNCaP（美國加洲大學洛杉磯分校癌癥中心陳德桂博士惠贈）。LNCaP培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100

10、 IU/mL的IMDM培養(yǎng)液中，細胞貼壁成簇生長，與底物貼附力弱，增殖慢，倍增時間為72 h，細胞間粘連緊密，需用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化。每5天換液1次，每8天傳代1次。細胞培養(yǎng)于37 恒溫，體積分數(shù)為0.05的CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中。1.2  方法1.2.1  氧化鋁柱層析法分離純化藥物  取，?ANO混合物1 g，以150氧化鋁低壓柱（E.Merck氧化鋁G）分離，柱壓0.5 kg/cm2，苯石油醚=21洗脫，每流分20 mL，各流分用上述流動相薄層條件檢查，單一斑點流分合并。第611流分合并蒸干，用正已烷重結晶，得純體120 mg，熔

11、點136137 ，第1822流分合并蒸干，得純單體560 mg，熔點155156 。單體以無水乙醇配制成12.8 mmol/L的貯存液，臨用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，乙醇在培養(yǎng)液的最終體積分數(shù)不超過0.2%。1.2.2  SRB法檢測?ANO對細胞生長的作用  取在常規(guī)培養(yǎng)液中生長的對數(shù)生長期的LNCaP細胞經(jīng)充分消化后，接種于96孔板，細胞接種量約每孔8 000個，每孔100 L，24 h后細胞貼壁達到80%，?ANO組每孔加含不同終濃度?ANO（8,12,16,24,32 mol/L）的培養(yǎng)液100 L，對照組加等量培養(yǎng)液，設3個復孔，藥物與細胞共孵育5 d，作用時間結

12、束時，用SRB染色法檢測藥物對細胞生長的抑制作用：每孔加入預冷的30三氯醋酸50 L，放置5 min后置4 固定1 h，吸棄固定液，去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥，每孔加入SRB液100 L，室溫放置10 min，未與蛋白結合的SRB用1醋酸洗5遍，空氣干燥，加入10 mmol/L的非緩沖Tris堿液150 L溶解，震蕩15 min，515 nm波長處讀取D值。計算各濃度組的存活率。   存活率=D加藥組/D對照組×100%1.2.3  SRB法檢測?ANO對抗雄激素的作用  參照文獻6 用無酚紅的IMDM與活性炭處理過的血清配制成特殊的去除激

13、素的培養(yǎng)液。細胞在加藥物干預前在無激素培養(yǎng)液中預培養(yǎng)24 h以消除常規(guī)培養(yǎng)液中的激素對實驗結果的干擾，在去除激素的培養(yǎng)液中細胞生長較為緩慢，細胞接種量提高至每孔10 000個。實驗設:對照組(加等量培養(yǎng)液),?ANO（3,6,12,24 mol/L）與1 nmol/L R1881的單獨與聯(lián)合組，給藥后各組終體積相同，每個加藥組設3個復孔，與細胞共孵育5 d，SRB法染色，酶標儀測D值，計算各濃度組的存活率。1.2.4  細胞形態(tài)學觀察  取常規(guī)培養(yǎng)液中生長的對數(shù)生長期的LNCaP細胞消化后，常規(guī)培養(yǎng)液稀釋，接種于6孔板，細胞量每孔50 000個，加入含不同終濃度?ANO（3

14、,6,12,24 mol/L），對照組加等量培養(yǎng)液，藥物作用48 h后，于相差顯微鏡下觀察LNCaP細胞形態(tài)的變化。1.2.5  ELISA法測藥物對細胞分泌PSA的影響  取對數(shù)生長期細胞，在去除激素的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，以含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液充分消化成單細胞懸液，接種于96孔板，細胞量約為每孔10 000個，每個濃度設3個復孔，每孔100 L，置培養(yǎng)箱孵育24 h，細胞貼壁后每孔加含不同濃度藥液的培養(yǎng)液100 L，藥物作用24 h后，吸取每孔上清，離心以去除上清中的少許細胞碎片。用收集到的上清液測PSA含量。為了消除由于細胞數(shù)量的變化而

15、造成的對PSA變化的影響，將每個濃度組的細胞數(shù)量用對照組細胞數(shù)量校正，計算抑制率。檢測步驟按ELISA試劑盒說明書。1.3  統(tǒng)計學處理  計量資料以x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包分析，組間比較采用t檢驗。2  結果2.1  ?ANO對LNCaP細胞生長的影響  在常規(guī)培養(yǎng)液中，?ANO(8,12,16,24,32 mol/L)作用LNCaP細胞5 d后，細胞存活率分別為85.8%,51.5%,40.8%,29.2%,1.0%,低濃度表現(xiàn)為抑制生長,高濃度表現(xiàn)為細胞毒作用,呈劑量依賴性(圖 1)。?ANO:雙炔失碳酯單體

16、.圖1  不同濃度?ANO對人前列腺癌LNCaP細胞增殖的影響（略）Fig 1  Proliferation of LNCaP cells treated with different dose of ?ANO2.2  ?ANO對抗雄激素的促生長作用  在無激素培養(yǎng)液中預培養(yǎng)24 h，LNCaP細胞經(jīng)不同濃度?ANO和1 nmol/L R1881處理5 d后,呈現(xiàn)不同的增殖抑制情況。單獨給予1 nmol/L R1881具有促細胞生長的作用，細胞存活率為120.8%；單獨給予?ANO（3,6,12,24 mol/L）細胞存活率分別為92.9%,80.1%,

17、44.8%,22.1%。兩者聯(lián)合應用,R1881促細胞生長作用被完全抵消,存活率分別為77.9%,67.9%,37.2%,19.5%,與相同濃度無R1881組比較呈下降的趨勢(圖2)，與單獨給予R1881組比較，差別有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。2.3  細胞形態(tài)學變化  12 mol/L ?ANO作用于LNCaP細胞48 h,細胞數(shù)量減少,部分細胞發(fā)生變形,細胞變圓,體積變小;24 mol/L?ANO作用下LNCaP細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化, 細胞形狀變圓,體積變小,部分細胞碎裂,細胞質空泡化,細胞表面變粗糙,呈現(xiàn)顆粒狀,胞間粘連減少,細胞大部分為分散的個體。

18、60;   2.4  ?ANO對LNCaP細胞分泌PSA的影響  ?ANO能抑制LNCaP細胞分泌PSA，在1 nmol/L R1881存在下，?ANO抑制PSA分泌的作用更強。R1881本身可使LNCaP細胞分泌PSA增長近10倍，?ANO作用細胞24 h后，細胞數(shù)量變化不大，最高給藥劑量15 mol/L，細胞數(shù)量相當于對照的90%，而細胞分泌的PSA量只有對照的35%左右，降低幅度遠遠大于細胞數(shù)量的變化。有R1881組，在?ANO 濃度為1 mol/L和5 mol/L時，抑制率均高于無R1881組（P0.01）（圖3）。?ANO:雙炔失碳酯

19、單體.  n=3.  與對照組比較,:P<0.05, :P<0.01； 與R1881比較,#:P<0.01.圖2  ?ANO在有和無R1881存在下對人前列腺癌LNCaP細胞生存率的影響（略）Fig 2  Survival of LNCaP cells treated by ?ANO in the presence or absence of R1881?ANO:雙炔失碳酯單體.圖3  ?ANO對人前列腺癌LNCaP細胞分泌PSA的影響（略）Fig 3  Effect of ?ANO on PSA secretion

20、 in LNCaP cells3  討論   Pca是與激素密切相關的惡性腫瘤，其發(fā)病與體內(nèi)雄激素與雌激素之間的平衡紊亂有關，雄激素及其受體(androgen receptor,AR)在前列腺癌變過程中起主導作用；雌激素及其受體(estrogen receptor,ER)在前列腺癌作用尚不清楚，有學者認為雌二醇（estradiol,E2）導致老年動物高分級的前列腺上皮內(nèi)瘤，E2的增加可能上調AR對睪酮的敏感性7。   ANO在我國于20世紀60年代首次合成，早期作為避孕藥應用于臨床，效果良好。ANO的抗生育作用主要是因其具有較強的抗雌激素作用，

21、但藥理研究表明ANO也有弱雌激素活性，具有與SERM類藥物相似特點。目前國外已有多種SERM類藥物用于Pca預防和治療的實驗研究1?2。   本實驗結果顯示，常規(guī)培養(yǎng)液中?ANO作用LNCaP細胞5 d，對細胞生長呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用。LNCaP是典型的激素依賴性細胞，含有突變型AR，可表達AR和ER，并能產(chǎn)生人類前列腺酸性磷酸酶和 PSA，在雄激素刺激下，LNCaP細胞生長增快8。本實驗中1 nmol/L R1881與LNCaP細胞共孵育5 d，促生長作用可達1.2倍左右，R1881是一種合成的雄激素受體激動劑9，是目前國外常用的替代雄激素的實驗試劑。1 nmol/L

22、 R1881刺激LNCaP細胞的生長，但在同時含有?ANO和R1881組,這部分促生長作用被完全抵消,存活率與相同濃度無R1881組比較反而下降，表明?ANO在雄激素存在時，對細胞抑制作用增強，能對抗雄激素引起的細胞增殖。   PSA由前列腺上皮細胞產(chǎn)生，在腺體的腺泡和上皮細胞內(nèi)合成，其合成分泌由雄激素受體調控，與雄激素成正相關，是目前Pca治療的敏感的指標之一。ELISA檢測結果表明，雄激素能使 LNCaP分泌PSA升高近10倍，而?ANO能顯著對抗由雄激素引起的PSA增加。這個結果再次證實了?ANO具有對抗雄激素的作用。由于早期 Pca是激素依賴性，體內(nèi)的細胞增殖主要由

23、于雄激素水平的升高引起10，?ANO對抗雄激素的特點在Pca早期治療中具有一定的潛在價值。但是，?ANO抗雄激素作用與其抗雌激素和弱雌激素樣作用有何聯(lián)系，通過何種機制實現(xiàn)，?ANO抗Pca的活性與AR及ER之間有何關系,均有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】  1 Neubauer B L, McNulty A N, Chedid M, et al. The selective estrogen receptor modulator trioxifene (LY133314) inhibits metastasis and extends survival in the PA rat pro

24、static carcinoma modelJ. Cancer Res , 2003, 63(18) :6056?6062.2 Price D, Stein B, Golubbff E, et alToremifene for the prevention of prostate cancer in men with high grade prostatic intraepithelial neoplasia：results of double?blind, placebo?controlled phase B clinical trial JUrol, 2006,176(3):965?971

25、.3 劉 靜,鄭 偉,陳海林,等 新型A環(huán)失碳甾體化合物的合成及其抑制黃體細胞的生物活性J生殖與避孕, 2005,25(5):272?2764 曹 霖,吳師龍,顧芝萍雙炔失碳醇酯和雙炔失碳酯的雌激素活性與抗生育作用關系的探討J生殖與避孕, 1993,13(5):336?3415 樓麗君,胥 彬?雙炔失碳酯誘導人早幼粒白血病HL?60細胞分化J中國腫瘤臨床, 1999,26 (10):739?7426 Fukuchi J, Hiipakka R A, Kokontis J M, et alAndrogenic suppression of ATP?binding cassette transporter A1 expression in LNCaP human prostate cance