高效液相色譜實驗

1、 化學與材料工程學院環(huán)境監(jiān)測分析實驗報告實驗名稱:高效液相色譜分析苯-甲苯混合物專業(yè)班級:應化13學號: 150313135 姓名:朱建南指導教師:翟春實驗地點:敬行樓A210實驗日期: 2016年 11月 28日高效液相色譜實驗一、實驗目的1.了解HPLC儀器的基本構造和工作原理,掌握HPLC的基本操作;2.學習苯-甲苯混合物的定性分析方法;3.評價色譜柱柱效;4.了解色譜定量操作的主要方法以及各自特點;5.學習未知樣品的定量分析方法。二、實驗原理不同組分因在互不相溶的流動相與固定相中的分配比不同,當兩相做相對運動時,組分在兩相之間反復進行多次分配,最終實現(xiàn)不同組分的分離。色譜儀器的構成:包

2、括高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng),檢測系統(tǒng)等1.色譜定性分析方法a保留時間定性 b 峰高增量定性2.色譜定量分析方法a 歸一化法,要求所有組分必須全部出峰。b 標準曲線法(外標法。簡單、方便, 結果受到操作技術因素以及具體色譜條件影響較大。三、儀器與試劑LC-1602A型高效液相色譜儀、甲醇(色譜純 、苯、甲苯、苯-甲苯四、高效液相色譜儀操作步驟1. 流動相的預處理甲醇溶液,用0.45m 有機濾膜過濾,超聲波清洗器脫氣1020 min,裝入流動相貯液瓶。2. 準備苯-甲苯混合試樣和苯、甲苯標樣3. 高效液相色譜儀操作a 依次高壓輸液泵和檢測器電源開關;b 打開色譜工作站,在儀器控制面板中,設

3、置波長,并開燈;c打開三通閥,在儀器控制面板中,設置流速為5ml/min, 啟動高壓泵,排除流路中的氣泡。排氣結束后,點擊停止按鈕,停止高壓泵。d 關閉三通閥,設置最小壓力(0.1和最大壓力(20,并設置實驗需要的流速(0.5ml/min,啟動高壓泵。e用平頭微量注射器洗滌進樣口后,取試液30 L,將進樣閥柄置于“Load”位置時注入樣品,轉動閥柄至“Inject ”位置,此時軟件自動進入“采集數(shù)據(jù)”模式。注意!平頭微量注射器用甲醇清洗3次后,再用試液清洗3次,避免氣泡。 f 待所有色譜峰流出完畢后,按“停止采集”鍵,保存數(shù)據(jù)。g 點擊譜圖處理中的定量結果,記錄組分的保留時間以及峰面積、峰高等

4、色譜信息。 注意!注射器進不同樣品前,使用專用清洗注射器在進樣閥的“Load ”和“Inject ”位置,用流動相清洗幾次。注意!注射器進不同樣品前,使用專用清洗注射器在進樣閥的“Load ”和“Inject ”位置,用流動相清洗幾次。4.結束工作所有樣品分析完畢后,流動相繼續(xù)流動1020 min ,至基線穩(wěn)定。關閉檢測器,按“Stop ”停泵。關閉泵電源。五、 實驗內(nèi)容1. 分別進樣苯、甲苯標樣和苯-甲苯混合試樣,保留時間定性,記錄苯-甲苯混合試樣色譜譜,計算分離度。2. a. 分別采集系列甲苯溶液以及未知試樣的色譜圖,根據(jù)保留時間定性,確定甲苯組分峰的位置,并測定各自的峰面積。b. 根據(jù)實

5、驗數(shù)據(jù),利用外標法繪制標準工作曲線,并計算待測溶液中甲苯的含量。六、實驗圖譜與數(shù)據(jù)處理1、0.001% 圖1:含量0.001%的液相色譜圖信號值(mAu時間(min2、0.01% 圖2:含量0.01%的液相色譜圖3、0.1% 圖3:含量0. 1%的液相色譜圖123456-202468101214信號值(mAu時間(min3.9483.7983.4152.391123456-20020406080100120140信號值(mAu時間(min3.9683.8203.4374、苯增0.1% 圖4:苯增0.1%的液相色譜圖5、1% 圖5:含量0.001%的液相色譜圖123456050100150200

6、250300信號值(mAU時間(min3.4283.8133.9622.402123456-200020040060080010001200140016001800信號值(mAU時間(min3.4383.8003.967序號 濃度% 苯 峰面積（mAu*s） 甲苯 峰面積（mAu*s） 1 0.001 1.485 9.435 2 0.01 86.339 91.255 3 0.1 578.256 618.367 4 1 13768.573 17818.787 5 待測 1436.477 709.341 20000 15000 峰 面 積 （ 10000 5000 ） 0 0.0 0.2 0.4

7、0.6 0.8 1.0 含 量 （ % 圖 6：含量與峰面積的標準曲線圖 已知待測樣中加入了 0.1%的標樣，其苯的峰面積為 1436.477（AU*s） ，甲苯的峰面積為 709.341（AU*s） 。從圖 6 中找出對應的苯含量為 0.123（%） ，甲苯為 0.0623（%） 。 七、 思考題： （1）若進樣之后，沒有樣品峰出現(xiàn)，有哪些可能的原因？ 答：儀器漏液；分析時間過短；進樣量少、樣品濃度低等 （2）與氣相色譜柱相比，為何液相色譜柱一般都很短？ 答：高效液相色譜柱采用的填料粒徑很小，常規(guī) 5-20um，填料還有涂層、鍵合物等， 這樣物質(zhì)在經(jīng)過色譜柱的時候分配的次數(shù)就相當多了。 氣相色譜柱的填料粒徑較大， 或是無 填料，與液相色譜柱比較起來的話，氣相的色譜柱單位長度的理論塔板數(shù)要遠遠低于液相， 為了達到比較理想的分離效果， 要求理論塔板數(shù)要達到一定的數(shù)量， 因此氣相的色譜柱一般 都比高效液相的色譜柱長得多。 （3）為了提高液相色譜的分離效果，可采取哪些有效措施？ ） 甲 苯 苯 mAU*s 答：1.增加色譜柱長