糖皮質(zhì)激素致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的快速升高

1、糖皮質(zhì)激素致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的快速升高         07-08-24 15:15:00     編輯：studa20         作者：李茂全，王艷艷，楊書，陳朝瓊，楊曉虹，余爭平 【關(guān)鍵詞】  應(yīng)激；糖皮質(zhì)激素；星形細(xì)胞；鈣      Rapid elevation of intracellular free ca

2、lcium concentration in astrocytes after treated by glucocorticoid    【Abstract】 AIM: To explore the mechanisms of glucocorticoid (GC) leading to the elevation of intracellular free calcium concentration (Ca2+i) in astrocytes in early effect phase.  METHODS: A cell culture model o

3、f neonatal Wistar rat hippocampal astrocytes was used. After exposed to corticosterone (CORT) (1 mol/L), NmethylDaspartate (NMDA), MK801 and BSACORT, respectively, changes of Ca2+i in astrocytes were observed by laser confocal microscope.  RESULTS: CORT induced rapid elevation of intracellular

4、Ca2+ fluorescence intensity within 10 min （177.1±3.8， P<0.01) compared with controls (141.2±4.7), but induced no significant change when there was no Ca2+ out of the cell （148.5±6.3). NMDA caused further increase of intracellular Ca2+ after pretreatment with CORT (195.3±7.2， P

5、<0.01).  MK801 partially suppressed the prolonged intracellular Ca2+ elevation (186.4±1.8). BSACORT had almost the same effect as the CORT treatment （200.7±12.2, P<0.01). CONCLUSION: The rapid effect of GC induces significant Ca2+i elevation in astrocytes during stress, and mayb

6、e NMDA receptor involves in this process.    【Keywords】 stress; glucocorticoid; astrocytes; calcium    【摘要】 目的：研究應(yīng)激水平的糖皮質(zhì)激素（GC）在早期快速效應(yīng)中對星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度（Ca2+i）的影響及作用機(jī)制. 方法：原代培養(yǎng)新生Wistar大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，用1 mol/L的皮質(zhì)酮(CORT)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察CORT快速作用致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+i的變化，并設(shè)立N甲基D天冬氨酸

7、(NMDA)，受體拮抗劑5甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(MK801)，牛血清白蛋白偶聯(lián)CORT （BSACORT）及無細(xì)胞外鈣等干預(yù)組,進(jìn)一步檢測Ca2+i變化. 結(jié)果：與未處理對照細(xì)胞（141.2±4.7）相比，CORT可快速介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加（177.1±3.8， P<0.01)，但細(xì)胞外鈣為零時無明顯變化（148.5±6.3）；NMDA受體激活可使熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)(195.3±7.2，P<0.01)，NMDA受體拮抗劑MK801可部分拮抗熒光強(qiáng)度升高(186.4±1.8)；BSACORT可產(chǎn)生與CORT類似的效應(yīng)（

8、200.7±12.2，P<0.01). 結(jié)論：應(yīng)激水平的GC在早期可快速增加星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+i，激活NMDA受體是其中的重要機(jī)制之一.    【關(guān)鍵詞】 應(yīng)激；糖皮質(zhì)激素；星形細(xì)胞；鈣    星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，廣泛參與CNS內(nèi)信息的處理與傳導(dǎo)，并在神經(jīng)退行性疾病、腦老化及外傷、炎癥等病變的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色1. 糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）發(fā)揮作用可通過早期（30 min以內(nèi)）的非基因組效應(yīng)和后期的基因

9、組效應(yīng)2. 有文獻(xiàn)報(bào)道，GC的基因組效應(yīng)可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)游離Ca2+濃度（Ca2+i3，Ca2+作為重要的胞內(nèi)信使，對細(xì)胞功能、信號傳遞及神經(jīng)遞質(zhì)釋放具有重要意義. 目前關(guān)于應(yīng)激時GC對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)理，尤其是GC的非基因組效應(yīng)對星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+i的影響少見報(bào)道. 本實(shí)驗(yàn)選用應(yīng)激濃度的皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)早期Ca2+水平的變化，初步探討應(yīng)激情況下GC非基因組作用階段對Ca2+的影響及機(jī)制.    1材料和方法    1.1材料出生2 d以內(nèi)的新生近交

10、系Wistar大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供; IMDM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(天津TBD公司）；胰蛋白酶和EDTA(美國Amresco公司)；生物素標(biāo)記抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)mAb(北京中山生物技術(shù)公司）；藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)標(biāo)記鏈霉親和素（美國eBioscience公司）；CORT，N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate, NMDA)和其受體拮抗劑5甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(MK801)，牛血清白蛋白偶聯(lián)CORT(BSACORT)(美國Sigma公司)；

11、Fluo3/AM和pluronic F127(美國Molecular Probes公司)；XTL3A型解剖顯微鏡（江蘇鎮(zhèn)江電子儀器廠）；DM IRB型熒光顯微鏡和TCSNT激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司).    1.2方法    1.2.1大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定無菌條件下取出大鼠雙側(cè)海馬，置于4的0.01 mol/L PBS緩沖液中，在解剖顯微鏡下剝除腦膜及血管，剪碎后用2.5 g/L的胰酶和等體積1 mmol/L的EDTA在37消化20 min，終止消化后吸管吹打，100目篩網(wǎng)機(jī)械過濾，制備為混合細(xì)胞懸液，離心收集

12、沉淀，將細(xì)胞密度調(diào)至5×107個/mL，加至鋪被了多聚賴氨酸的塑料培養(yǎng)瓶中. 第2日換液去除死亡細(xì)胞碎片，不換液繼續(xù)培養(yǎng)56 d，置于37恒溫?fù)u床中180 r/min振搖1215 h，去除上清中的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，余下貼壁的為星形膠質(zhì)細(xì)胞. 將細(xì)胞接種在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，24 h后采用間接免疫熒光法進(jìn)行單層細(xì)胞染色，GFAP呈陽性確定為星形膠質(zhì)細(xì)胞. 用熒光顯微鏡在200倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率.    1.2.2CORT對星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+i的影響當(dāng)接種于蓋玻片上的細(xì)胞融合至80%時換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，

13、實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為五組：未處理對照組；1 mol/L CORT處理10 min組；外鈣為零時1 mol/L CORT處理10 min組；1 mol/L CORT 10 min+100 mol/L NMDA 12 min10 mol/L MK801 8 min處理組；1 mol/L BSACORT處理10 min組. 其中第組用無Ca2+和Mg2+的DHanks液清洗細(xì)胞3次，再用DHanks液配制Fluo3/AM(1 mol/L)和20 % (W/V)的F127加于細(xì)胞上, 使熒光探針均勻分布于細(xì)胞，在37的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光負(fù)載30 min. 然后用DHanks液輕洗細(xì)胞3次去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針, 其他4組中的DHanks液均用無Mg2+但含Ca2+的平衡鹽溶液(130 mmol/L NaCl, 5.4 mmol/L KCl, 2.0 mmol/L CaCl2, 5.5 mmol/L glucose, 10 mol/L glycine, 10 mmol/L Hepes, pH=7.3)代替. 在激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm），以間隔12 s的速度掃描，記錄不同時間細(xì)胞內(nèi)Ca2+i濃度變化某一層面的熒光圖像. 待細(xì)胞內(nèi)Ca2+i達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，按以上的干預(yù)因素進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn). 由Leica TCS圖像分析系統(tǒng)對所選取細(xì)胞的平均