生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

1、9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則 1. 范圍 準(zhǔn)確測定生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿）中的藥物濃度，對于藥物和 制劑研發(fā)非常重要。這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動 學(xué)、藥動學(xué)和生物等效性試驗(yàn)的結(jié)果做出關(guān)鍵性決定。因此，必須完整地驗(yàn)證和 記錄應(yīng)用的生物分析方法，以獲得可靠的結(jié)果。 本指導(dǎo)原則提供生物分析方法驗(yàn)證的要求， 也涉及非臨床或臨床試驗(yàn)樣品實(shí) 際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗(yàn)證或交叉驗(yàn)證，來替代完整驗(yàn)證。 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證和試驗(yàn)樣品分析應(yīng)符合本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求。 應(yīng)該在相應(yīng)的生物樣品分析中遵守 GLP 原則或 GCP 原則。 2. 生物分析

2、方法驗(yàn)證 2.1 分析方法的完整驗(yàn)證 分析方法驗(yàn)證的主要目的是， 證明特定方法對于測定在某種生物基質(zhì)中分析 物濃度的可靠性。此外，方法驗(yàn)證應(yīng)采用與試驗(yàn)樣品相同的抗凝劑。一般應(yīng)對每 個物種和每種基質(zhì)進(jìn)行完整驗(yàn)證。當(dāng)難于獲得相同的基質(zhì)時，可以采用適當(dāng)基質(zhì) 替代，但要說明理由。 一個生物分析方法的主要特征包括：選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范 圍（標(biāo)準(zhǔn)曲線性能） 、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液 中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性。 有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的藥物，也可能涉及一 個母體藥物及其代謝物，或一個藥物的對映體或異構(gòu)體。在這些情況下，驗(yàn)證和 分析的原則適

3、用于所有涉及的分析物。 對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 在方法驗(yàn)證中，含有分析物對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶液將被加入到空白生物基質(zhì) 中。此外，色譜方法通常使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)。 應(yīng)該從可追溯的來源獲得對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 應(yīng)該科學(xué)論證對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用 性。 分析證書應(yīng)該確認(rèn)對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度， 并提供儲存條件、 失效日期和批號。 對于內(nèi)標(biāo)，只要能證明其適用性即可，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì) 不產(chǎn)生干擾。 當(dāng)在生物分析方法中使用質(zhì)譜檢測時， 推薦盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi) 標(biāo)。它們必須具有足夠高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)，以避免結(jié) 果的偏差。 1 2.1.1 選擇性 該分析方法應(yīng)該能夠區(qū)分目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)與基

4、質(zhì)的內(nèi)源性組分或樣品中 其他組分。應(yīng)該使用至少 6 個來源的適宜的空白基質(zhì)來證明選擇性，它們被分別 分析并評價干擾。 當(dāng)干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的 20%， 并低于內(nèi) 標(biāo)響應(yīng)的 5%時，通常即可以接受。 應(yīng)該考察藥物代謝物經(jīng)樣品預(yù)處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引 起干擾的程度。應(yīng)該考慮通常用于受試者群體試驗(yàn)的同服藥物。在適當(dāng)情況下， 也應(yīng)該評價代謝物在分析過程中回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體分析物的可能性。 2.1.2 殘留 應(yīng)該在方法建立中考察殘留并使之最小。殘留可能不影響準(zhǔn)確度和精密度。 應(yīng)通過在注射高濃度樣品或校正標(biāo)樣后，注射空白樣品來估計(jì)殘留。高濃度樣品 之后在空白樣品中的殘留應(yīng)不超

5、過定量下限的 20%，并且不超過內(nèi)標(biāo)的 5%。應(yīng) 考慮特殊措施，在方法驗(yàn)證時檢驗(yàn)并在試驗(yàn)樣品分析時應(yīng)用這些措施，以確保不 影響準(zhǔn)確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品后注射空白樣品，然后分析下一 個試驗(yàn)樣品。 2.1.3 定量下限 定量下限是能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度， 具有可接受的準(zhǔn)確 度和精密度。定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，應(yīng)適用于預(yù)期的濃度和試驗(yàn)?zāi)康摹?2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 應(yīng)該在指定的濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過加 入已知濃度的分析物（和內(nèi)標(biāo)）到空白基質(zhì)中，制備各濃度的校正標(biāo)樣，其基質(zhì) 應(yīng)該與目標(biāo)試驗(yàn)樣品基質(zhì)相同。方法驗(yàn)證中研究的每種分析物和每一分析批

6、，都 應(yīng)該有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證之前，最好應(yīng)該了解預(yù)期的濃度范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍應(yīng) 該盡量覆蓋預(yù)期濃度范圍，由定量下限和定量上限（校正標(biāo)樣的最高濃度）來決 定。該范圍應(yīng)該足夠描述分析物的藥動學(xué)。 應(yīng)該使用至少 6 個校正濃度水平，不包括空白樣品（不含分析物和內(nèi)標(biāo)的處 理過的基質(zhì)樣品）和零濃度樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理過的基質(zhì)） 。每個校正標(biāo)樣可以 被重復(fù)分析。 應(yīng)該使用簡單且足夠描述儀器對分析物濃度響應(yīng)的關(guān)系式。 空白和零濃度樣 品結(jié)果不應(yīng)參與計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。 應(yīng)該提交標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)，測定校正標(biāo)樣后回算得出的濃度應(yīng)一并提交。在方 法驗(yàn)證中，至少應(yīng)該評價 3 條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2 校正標(biāo)樣回算的

7、濃度一般應(yīng)該在標(biāo)示值的 ±15% 以內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在 ±20%內(nèi)。至少 75%校正標(biāo)樣，含最少 6 個有效濃度，應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。如果某 個校正標(biāo)樣結(jié)果不符合這些標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該拒絕這一標(biāo)樣，不含這一標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線 應(yīng)被重新評價，包括回歸分析。 最好使用新鮮配制的樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但如果有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持，也可以 使用預(yù)先配制并儲存的校正標(biāo)樣。 2.1.5 準(zhǔn)確度 分析方法的準(zhǔn)確度描述該方法測得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度，表示 為： （測得值/真實(shí)值）× 100%。應(yīng)采用加入已知量分析物的樣品來評估準(zhǔn)確度， 即質(zhì)控樣品。 質(zhì)控樣品的配制應(yīng)該與校正標(biāo)樣分開進(jìn)行， 使用另

8、行配制的儲備液。 應(yīng)該根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將獲得的濃度與標(biāo)示濃度對比。準(zhǔn)確度應(yīng) 報告為標(biāo)示值的百分比。應(yīng)通過單一分析批（批內(nèi)準(zhǔn)確度）和不同分析批（批間 準(zhǔn)確度）獲得質(zhì)控樣品值來評價準(zhǔn)確度。 為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢， 推薦以質(zhì)控樣品分析批來證明準(zhǔn) 確度，其樣品數(shù)不少于一個分析批預(yù)期的樣品數(shù)。 批內(nèi)準(zhǔn)確度 為了驗(yàn)證批內(nèi)準(zhǔn)確度，應(yīng)取一個分析批的定量下限及低、中、高濃度質(zhì)控樣 品，每個濃度至少用 5 個樣品。濃度水平覆蓋標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：定量下限，在不高 于定量下限濃度 3 倍的低濃度質(zhì)控樣品， 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣 品， 以及標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍上限約 75%處的高濃度質(zhì)控樣品

9、。 準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì) 控樣品標(biāo)示值的±15%之內(nèi)，定量下限準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。 批間準(zhǔn)確度 通過至少 3 個分析批，且至少兩天進(jìn)行，每批用定量下限以及低、中、高濃 度質(zhì)控樣品，每個濃度至少 5 個測定值來評價。準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo) 示值的±15%范圍內(nèi)，對于定量下限，應(yīng)在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。 報告的準(zhǔn)確度和精密度的驗(yàn)證數(shù)據(jù)應(yīng)該包括所有獲得的測定結(jié)果， 但是已經(jīng) 記錄明顯失誤的情況除外。 2.1.6 精密度 分析方法的精密度描述分析物重復(fù)測定的接近程度， 定義為測量值的相對標(biāo) 準(zhǔn)差（變異系數(shù)） 。應(yīng)使用與證明準(zhǔn)確度相同分析批樣

10、品的結(jié)果，獲得在同一批 內(nèi)和不同批間定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品的精密度。 對于驗(yàn)證批內(nèi)精密度， 至少需要一個分析批的 4 個濃度， 即定量下限以及低、 中、高濃度，每個濃度至少 5 個樣品。對于質(zhì)控樣品，批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超 過 15%，定量下限的變異系數(shù)不得超過 20%。 3 對于驗(yàn)證批間精密度， 至少需要 3 個分析批 （至少 2 天） 的定量下限以及低、 中、高濃度，每個濃度至少 5 個樣品。對于質(zhì)控樣品，批間變異系數(shù)一般不得超 過 15%，定量下限的變異系數(shù)不得超過 20%。 2.1.7 稀釋可靠性 樣品稀釋不應(yīng)影響準(zhǔn)確度和精密度。 應(yīng)該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定 量上限

11、濃度，并用空白基質(zhì)稀釋該樣品（每個稀釋因子至少 5 個測定值） ，來證 明稀釋的可靠性。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在±15%之內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗(yàn) 樣品所用的稀釋倍數(shù)。 可以通過部分方法驗(yàn)證來評價稀釋可靠性。 如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精 密度和準(zhǔn)確度，也可以接受其使用。 2.1.8 基質(zhì)效應(yīng) 當(dāng)采用質(zhì)譜方法時，應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。使用至少 6 批來自不同供體的空白 基質(zhì)，不應(yīng)使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得，則使用少于 6 批基質(zhì)，但應(yīng)該 說明理由。 對于每批基質(zhì)，應(yīng)該通過計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入 分析物和內(nèi)標(biāo)測得） ，與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積（分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海?/p>

12、比值， 計(jì)算每一分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。 進(jìn)一步通過分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基 質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。從 6 批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因 子的變異系數(shù)不得大于 15%。該測定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進(jìn)行。 如果不能適用上述方式，例如采用在線樣品預(yù)處理的情況，則應(yīng)該通過分析 至少 6 批基質(zhì)，分別加入高濃度和低濃度（定量下限濃度 3 倍以內(nèi)以及接近定量 上限） ，來獲得批間響應(yīng)的變異。其驗(yàn)證報告應(yīng)包括分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以 及每一樣品的計(jì)算濃度。這些濃度計(jì)算值的總體變異系數(shù)不得大于 15%。 除正?；|(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血的或高血脂的血漿 樣品等。 2.

13、1.9 穩(wěn)定性 必須在分析方法的每一步驟確保穩(wěn)定性，用于檢查穩(wěn)定性的條件，例如樣品 基質(zhì)、 抗凝劑、 容器材料、 儲存和分析條件， 都應(yīng)該與實(shí)際試驗(yàn)樣品的條件相似。 用文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。 采用低和高濃度質(zhì)控樣品 （空白基質(zhì)加入分析物至定量下限濃度 3 倍以內(nèi)以 及接近定量上限） ，在預(yù)處理后以及在所評價的條件儲存后立即分析。由新鮮制 備的校正標(biāo)樣獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將測得濃度與標(biāo)示濃 度相比較，每一濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)。 4 應(yīng)通過適當(dāng)稀釋，考慮到檢測器的線性和測定范圍，檢驗(yàn)儲備液和工作溶液 的穩(wěn)定性。 穩(wěn)定性檢查應(yīng)考察不同

14、儲存條件，時間尺度應(yīng)不小于試驗(yàn)樣品儲存的時間。 通常應(yīng)該進(jìn)行下列穩(wěn)定性考察： z z z z z 分析物和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性； 從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度，基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn) 定性； 基質(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性； 處理過的樣品在室溫下或在試驗(yàn)過程儲存條件下的穩(wěn)定性； 處理過的樣品在自動進(jìn)樣器溫度下的穩(wěn)定性。 此外，如果適用，也應(yīng)該進(jìn)行下列考察： 在多個分析物試驗(yàn)中，特別是對于生物等效性試驗(yàn)，應(yīng)該關(guān)注每個分析物在 含所有分析物基質(zhì)中的穩(wěn)定性。 應(yīng)特別關(guān)注受試者采血時，以及在儲存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性， 以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時刻的分析

15、物濃度。 可能需要根據(jù) 分析物的結(jié)構(gòu)，按具體情況證明其穩(wěn)定性。 2.2 部分驗(yàn)證 在對已被驗(yàn)證的分析方法進(jìn)行小幅改變情況下，根據(jù)改變的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，可能 需要部分方法驗(yàn)證。可能的改變包括：生物分析方法轉(zhuǎn)移到另一個實(shí)驗(yàn)室，改變 儀器、校正濃度范圍、樣品體積，其他基質(zhì)或物種，改變抗凝劑、樣品處理步驟、 儲存條件等。應(yīng)報告所有的改變，并對重新驗(yàn)證或部分驗(yàn)證的范圍說明理由。 2.3 交叉驗(yàn)證 應(yīng)用不同方法從一項(xiàng)或多項(xiàng)試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)， 或者應(yīng)用同一方法從不同試驗(yàn)地 點(diǎn)獲得數(shù)據(jù)時，需要互相比較這些數(shù)據(jù)時，需要進(jìn)行分析方法的交叉驗(yàn)證。如果 可能，應(yīng)在試驗(yàn)樣品被分析之前進(jìn)行交叉驗(yàn)證，同一系列質(zhì)控樣品或試驗(yàn)樣品應(yīng) 被

16、兩種分析方法測定。對于質(zhì)控樣品，不同方法獲得的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在±15%范 圍內(nèi)，如果放寬，應(yīng)該說明理由。對于試驗(yàn)樣品，至少 67%樣品測得的兩組數(shù)值 差異應(yīng)在兩者均值的±20%范圍內(nèi)。 3. 試驗(yàn)樣品分析 在分析方法驗(yàn)證后，可以進(jìn)行試驗(yàn)樣品或受試者樣品分析。需要在試驗(yàn)樣品 分析開始前證實(shí)生物分析方法的效能。 應(yīng)根據(jù)已驗(yàn)證的分析方法處理試驗(yàn)樣品以及質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣， 以保證分 析批被接受。 5 3.1 分析批 一個分析批包括空白樣品和零濃度樣品，包括至少 6 個濃度水平的校正標(biāo) 樣，至少 3 個濃度水平質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗(yàn)樣品總 數(shù)的 5%， 兩者中取

17、數(shù)目更多者） ， 以及被分析的試驗(yàn)樣品。 所有樣品 （校正標(biāo)樣、 質(zhì)控和試驗(yàn)樣品）應(yīng)按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。 一個分析批包括的樣品在同一時間處理，即沒有時間間隔，由同一分析者相繼處 理，使用相同的試劑，保持一致的條件。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個批中，以此保 證整個分析批的準(zhǔn)確度和精密度。 對于生物等效性試驗(yàn)，建議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以 減少結(jié)果的變異。 3.2 分析批的接受標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)在分析試驗(yàn)計(jì)劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中，規(guī)定接受或拒絕一個分析批的標(biāo)準(zhǔn)。 在整個分析批包含多個部分批次的情況，應(yīng)該針對整個分析批，也應(yīng)該針對分析 批中每一部分批次樣品定義接受標(biāo)準(zhǔn)。

18、應(yīng)該使用下列接受標(biāo)準(zhǔn)： 校正標(biāo)樣測定回算濃度一般應(yīng)在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在±20% 范圍內(nèi)。不少于 6 個校正標(biāo)樣，至少 75%標(biāo)樣應(yīng)符合這些標(biāo)準(zhǔn)。如果校正標(biāo)樣中 有一個不符合標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)該拒絕這個標(biāo)樣，重新計(jì)算不含該標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并 進(jìn)行回歸分析。 質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)。至少 67%質(zhì)控樣品，且 每一濃度水平至少 50%樣品應(yīng)符合這一標(biāo)準(zhǔn)。 在不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的情況下， 應(yīng)該 拒絕該分析批，相應(yīng)的試驗(yàn)樣品應(yīng)該重新提取和分析。 在同時測定幾個分析物的情況下，對每個分析物都要有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果 一個分析批對于一個分析物可以接受

19、，而對于另一個分析物不能接受，則接受的 分析物數(shù)據(jù)可以被使用，但應(yīng)該重新提取和分析樣品，測定被拒絕的分析物。 如果使用多重校正標(biāo)樣，其中僅一個定量下限或定量上限標(biāo)樣不合格，則校 正范圍不變。 所有接受的分析批，每個濃度質(zhì)控樣品的平均準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)該列表，并 在分析報告中給出。 如果總平均準(zhǔn)確度和精密度超過 15%， 則需要進(jìn)行額外的考 察，說明該偏差的理由。在生物等效性試驗(yàn)情況下，這可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)被拒絕。 3.3 校正范圍 如果在試驗(yàn)樣品分析開始前，已知或預(yù)期試驗(yàn)樣品中的分析物濃度范圍窄， 則推薦縮窄標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍， 調(diào)整質(zhì)控樣品濃度， 或者適當(dāng)加入質(zhì)控樣品新的濃度， 以充分反映試驗(yàn)樣品的濃度。

20、 6 如果看起來很多試驗(yàn)樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的情況下，應(yīng) 該延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度。 至少 2 個質(zhì)控樣品濃度應(yīng)該落在試驗(yàn)樣品的濃度范圍內(nèi)。 如果標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 被改變，則生物分析方法應(yīng)被重新驗(yàn)證（部分驗(yàn)證） ，以確認(rèn)響應(yīng)函數(shù)并保證準(zhǔn) 確度和精密度。 3.4 試驗(yàn)樣品的重新分析和報告值選擇 應(yīng)該在試驗(yàn)計(jì)劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中預(yù)先確定重新分析試驗(yàn)樣品的理由以及 選擇報告值的標(biāo)準(zhǔn)。 在試驗(yàn)報告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù) 的比例。 重新分析試驗(yàn)樣品可能基于下列理由： z z z z z z 由于校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度或精密度不符合接受標(biāo)準(zhǔn)

21、，導(dǎo)致一個 分析批被拒絕； 內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著； 進(jìn)樣不當(dāng)或儀器功能異常； 測得的濃度高于定量上限，或低于該分析批的定量下限，且該批的最低 濃度標(biāo)樣從標(biāo)準(zhǔn)曲線中被拒絕，導(dǎo)致比其他分析批的定量下限高； 在給藥前樣品或安慰劑樣品中測得可定量的分析物； 色譜不佳。 對于生物等效性試驗(yàn)，通常不能接受由于藥動學(xué)理由重新分析試驗(yàn)樣品。 在由于給藥前樣品陽性結(jié)果或者由于藥動學(xué)原因進(jìn)行重新分析的情況下， 應(yīng) 該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終 接受值以及接受理由。 在儀器故障的情況下， 如果已經(jīng)在方法驗(yàn)證時證明了重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性和進(jìn) 樣器內(nèi)穩(wěn)定

22、性，則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進(jìn)樣。但對于拒絕的分析批，則需 要重新處理樣品。 3.5 完整性 應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中描述色譜的完整性以及重新積分。 任何對該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī) 程的偏離都應(yīng)在分析報告中討論。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該記錄色譜完整性參數(shù)，在重新積分 的情況下，記錄原始和最終的積分?jǐn)?shù)據(jù)，并在要求時提交。 3.6 用于評價方法重現(xiàn)性的試驗(yàn)樣品再分析 在方法驗(yàn)證中使用校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品可能無法模擬實(shí)際試驗(yàn)樣品。例如， 蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥物引起的差異， 可能影響這些樣品在處理和儲存過程中分析物的準(zhǔn)確度和精密度。因此，推薦通 7 過在不同天后，在另外一個分析批中重新分析試驗(yàn)樣品

23、，來評價實(shí)際樣品測定的 準(zhǔn)確度。檢驗(yàn)的范圍由分析物和試驗(yàn)樣品決定，并應(yīng)該基于對分析方法和分析物 的深入理解。建議獲得 Cmax 附近和消除相樣品的結(jié)果，一般應(yīng)該重新分析 10% 樣品，如果樣品總數(shù)超過 1000，則超出部分重新分析 5%樣品。 對于至少 67%的重復(fù)測試， 原始分析測得的濃度和重新分析測得的濃度之間 的差異應(yīng)在兩者均值的±20%范圍內(nèi)。 試驗(yàn)樣品再分析顯示偏差結(jié)果的情況下，應(yīng)該進(jìn)行考察，采取足夠的步驟優(yōu) 化分析方法。 至少在下列情形下，應(yīng)該進(jìn)行試驗(yàn)樣品的再分析： z z z z z 毒動學(xué)試驗(yàn)，每個物種一次 所有關(guān)鍵性的生物等效性試驗(yàn) 首次用于人體的藥物試驗(yàn) 首次用于

24、患者的藥物試驗(yàn) 首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗(yàn) 對于動物試驗(yàn)，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗(yàn)中進(jìn)行實(shí)際樣品的再分析，例 如涉及給藥劑量和測得濃度關(guān)系的試驗(yàn)。 4. 配體結(jié)合分析 配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。 前述的驗(yàn)證原則以及對試驗(yàn)樣品分析的 考慮一般也適用。但是由于大分子固有的特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使其難以被提取， 所以常常在無預(yù)先分離的情況下測定分析物。此外，方法的檢測終點(diǎn)并不直接來 自分析物的響應(yīng)，而來自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號。配體結(jié)合分析中，每 個校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品以及待測樣品一般都采用復(fù)孔分析。如無特殊說明，本節(jié) 以雙孔分析為原則。 4.1 方法驗(yàn)證前的考量 4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)

25、品選擇 生物大分子具有不均一性，其中成分的效價與免疫反應(yīng)可能存在差異。因此 應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行充分表征。應(yīng)盡量使用純度最高的標(biāo)準(zhǔn)品。用于配制校正標(biāo)樣和 質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量與臨床和非臨床試驗(yàn)使用的受試品批號相同。 標(biāo)準(zhǔn)品批 號變更時，應(yīng)盡量對其進(jìn)行表征和生物分析評價，以確保方法性能不變。 4.1.2 基質(zhì)選擇 一般不推薦使用經(jīng)碳吸附、免疫吸附等方法提取過的基質(zhì)，或透析血清、蛋 白緩沖液等替代實(shí)際樣品基質(zhì)建立分析方法。但在某些情況下，復(fù)雜生物基質(zhì)中 可能存在高濃度與分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)， 其高度干擾導(dǎo)致根本無法測定 8 分析物。在無其它可選定量策略的前提下，可允許使用替代基質(zhì)建立分析方法。

26、但應(yīng)對使用替代基質(zhì)建立方法的必要性加以證明。 可采用替代基質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但質(zhì)控樣品必須用實(shí)際樣品基質(zhì)配制，應(yīng)通 過計(jì)算準(zhǔn)確度來證明基質(zhì)效應(yīng)的消除。 4.1.3 最低需求稀釋度的確定 分析方法建立與驗(yàn)證過程中，可能需要對基質(zhì)進(jìn)行必要的稀釋，以降低其產(chǎn) 生的高背景信號。在此情況下，應(yīng)考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提 高信噪比、減少基質(zhì)干擾、優(yōu)化準(zhǔn)確度與精密度而必須使用緩沖液對生物樣品進(jìn) 行稀釋的最小倍數(shù)。 應(yīng)使用與試驗(yàn)樣品相同的基質(zhì)來配制加藥樣品來確定最低需 求稀釋度。 4.1.4 試劑 方法的關(guān)鍵試劑，如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體、酶等，對分析結(jié) 果會產(chǎn)生直接影響，因此須確保質(zhì)量

27、。如果在方法驗(yàn)證或樣品分析過程中，關(guān)鍵 試劑批次發(fā)生改變，須確認(rèn)方法性能不因此改變，從而確保不同批次結(jié)果的一致 性。 無論是關(guān)鍵試劑，還是緩沖液、稀釋液、酸化劑等非關(guān)鍵試劑，都應(yīng)對維持 其穩(wěn)定性的保障條件進(jìn)行記錄，以確保方法性能長期不變。 4.2 方法驗(yàn)證 4.2.1 完整驗(yàn)證 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線反映了分析物濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系。 在配體結(jié)合分析方法 中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的響應(yīng)函數(shù)是間接測得的，一般呈非線性，常為 S 型曲線。 應(yīng)使用至少 6 個有效校正標(biāo)樣濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 校正標(biāo)樣應(yīng)在預(yù)期定量 范圍對數(shù)坐標(biāo)上近似等距離分布。除校正標(biāo)樣外，可使用錨定點(diǎn)輔助曲線擬合。 驗(yàn)證過程中

28、，須至少對 6 個獨(dú)立的分析批進(jìn)行測定，結(jié)果以列表形式報告， 以確定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸模型整體的穩(wěn)健性。擬合時，一條標(biāo)曲允許排除由于明確或 不明原因產(chǎn)生失誤的濃度點(diǎn)。 排除后應(yīng)至少有 75%的校正標(biāo)樣回算濃度在標(biāo)示值 的±20%（定量下限與定量上限在±25%）范圍內(nèi)。定量下限與定量上限之間的濃 度范圍為標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍。錨定點(diǎn)校正樣品是處于定量范圍之外的標(biāo)樣點(diǎn)， 用于輔助擬合配體結(jié)合分析的非線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，因其在定量范圍之外，可不 遵循上述接受標(biāo)準(zhǔn)。 9 （2）特異性 特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確、專一 地測定分析物的能力。 結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預(yù)期

29、合用藥物應(yīng)不影響方法對分析物的測 定。如在方法建立與驗(yàn)證階段無法獲取結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)，特異性評價可在最初方法 驗(yàn)證完成后補(bǔ)充進(jìn)行。 應(yīng)采用未曾暴露于分析物的基質(zhì)配制高濃度與低濃度質(zhì)控 樣品，加入遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)或預(yù)期合用藥物進(jìn)行特異性考察。未加入分 析物的基質(zhì)也應(yīng)同時被測量。要求至少 80%以上的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度在±20%范圍 內(nèi)（如果在定量下限水平，則在±25%范圍內(nèi)） ，且未加入分析物的基質(zhì)的測量值 應(yīng)低于定量下限。 （3）選擇性 方法的選擇性是指基質(zhì)中存在非相關(guān)物質(zhì)的情況下，準(zhǔn)確測定分析物的能 力。由于生物大分子樣品一般不經(jīng)提取，基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)可能會干擾分 析

30、物的測定。應(yīng)通過向至少 10 個不同來源的基質(zhì)加入定量下限和定量上限水平 的分析物來考察選擇性，也應(yīng)同時測量未加入分析物的基質(zhì)。選擇性考察要求至 少 80%以上的樣品準(zhǔn)確度在±20%范圍內(nèi)（如果在定量下限水平，則在±25%范圍 內(nèi)） ， 且未加入分析物的基質(zhì)的測量值應(yīng)低于定量下限。如果干擾具有濃度依賴 性，則須測定發(fā)生干擾的最低濃度。在此情況下，可能需要在方法驗(yàn)證之前調(diào)整 定量下限。根據(jù)項(xiàng)目需要，可能需要針對病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì)（如溶血基質(zhì) 或高血脂基質(zhì)）考察選擇性。 （4）精密度與準(zhǔn)確度 應(yīng)選擇至少 5 個濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度以及方法總誤差考察。 包括定量下

31、限濃度、低濃度質(zhì)控（定量下限濃度的 3 倍以內(nèi)） 、中濃度質(zhì)控（標(biāo) 準(zhǔn)曲線中段） 、高濃度質(zhì)控（定量上限濃度 75%以上）以及定量上限濃度質(zhì)控。 低、中、高濃度質(zhì)控標(biāo)示值不得與校正標(biāo)樣濃度標(biāo)示值相同。質(zhì)控樣品應(yīng)經(jīng)過冷 凍，并與試驗(yàn)樣品采用相同的方法進(jìn)行處理。不建議采用新鮮配制的質(zhì)控樣品進(jìn) 行精密度與準(zhǔn)確度考察。批間考察應(yīng)在數(shù)日內(nèi)進(jìn)行至少 6 個獨(dú)立的分析批測定。 每批內(nèi)應(yīng)包含至少 3 套質(zhì)控樣品（每套含至少 5 個濃度的質(zhì)控樣品） 。對于批內(nèi) 和批間準(zhǔn)確度，各濃度質(zhì)控樣品的平均濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±20%（定量下限和定 量上限為±25%）范圍內(nèi)。批內(nèi)和批間精密度均不應(yīng)超過 20

32、%（定量下限和定量 上限為 25%） 。此外，方法總誤差（即%相對偏差絕對值與%變異系數(shù)之和）不 應(yīng)超過 30%（定量下限和定量上限為 40%） 。 （5）稀釋線性 在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量范圍不能覆蓋預(yù)期樣品濃度的情況下， 應(yīng)使用質(zhì)控樣品進(jìn)行 10 方法的稀釋線性考察，即評價樣品濃度超過分析方法的定量上限時，用空白基質(zhì) 將樣品濃度稀釋至定量范圍內(nèi)后，方法能否準(zhǔn)確測定。進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)的另一目的 是考察方法是否存在“前帶”或“鉤狀”效應(yīng)，即高濃度分析物引起的信號抑制。 稀釋線性考察中， 稀釋至定量范圍內(nèi)的每個 QC 樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算 濃度應(yīng)在標(biāo)示值的±20% 范圍內(nèi)，且所有 QC 樣品回算

33、終濃度的精密度不超過 20%。 （6）平行性 為發(fā)現(xiàn)可能存在的基質(zhì)效應(yīng)，或代謝物的親和性差異，在可獲得真實(shí)試驗(yàn)樣 品的情況下，應(yīng)考慮對標(biāo)準(zhǔn)曲線和系列稀釋的試驗(yàn)樣品之間進(jìn)行平行性考察。應(yīng) ，用空白基質(zhì)將其稀釋到至少 選取高濃度真實(shí)樣品（最好采用 Cmax 附近的樣品） 3 個不同濃度后進(jìn)行測定，系列稀釋樣品間的精密度不應(yīng)超過 30%。如果存在樣 品稀釋非線性的情況（即非平行性） ，則應(yīng)按事先的規(guī)定予以報告。如果在方法 驗(yàn)證期間無法獲取真實(shí)試驗(yàn)樣品， 則應(yīng)在獲得真實(shí)試驗(yàn)樣品后盡快進(jìn)行平行性考 察。 （7）樣品穩(wěn)定性 應(yīng)使用低、高濃度質(zhì)控樣品考察分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察應(yīng)包括室溫或 樣品處理溫度下

34、的短期穩(wěn)定性，以及凍-融穩(wěn)定性。此外，如果試驗(yàn)樣品需要長 期凍存，則應(yīng)在可能凍存樣品的每個溫度下進(jìn)行長期穩(wěn)定性考察。每一濃度質(zhì)控 樣品應(yīng)有 67%以上的樣品濃度在標(biāo)示值的±20%范圍內(nèi)。 （8）商品化試劑盒 商品化試劑盒可以用來進(jìn)行試驗(yàn)樣品分析， 但使用前必須按本指導(dǎo)原則的要 求對其進(jìn)行驗(yàn)證。 4.2.2 部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證 在 2.2 節(jié)和 2.3 節(jié)中敘述的關(guān)于驗(yàn)證的各項(xiàng)內(nèi)容都適用于配體結(jié)合分析。 4.3 試驗(yàn)樣品分析 4.3.1 分析批 配體結(jié)合分析中最常使用微孔板，一個微孔板通常為一個分析批。每個微孔 板應(yīng)包含一套獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品， 以校準(zhǔn)板間差異。 在使用某些平臺時， 單個樣品載體的通量可能有限，此時允許一個分析批包含多個載體。可在該分析 批的首個與末個載體各設(shè)置一套標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時在每一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所 有樣品均應(yīng)復(fù)孔測定。 11 4.3.2 試驗(yàn)樣品分析的接受標(biāo)準(zhǔn) 對于每個分析批，除錨定點(diǎn)外，標(biāo)準(zhǔn)曲線須有 75%以上的校正標(biāo)樣（至少 6 個）回算濃度在標(biāo)示值的±20%（定量下限和定量上限為±25%）范圍內(nèi)。 每塊板應(yīng)含有至少 2 套 3 水平（低、中、高濃