夏至草醇提物對(duì)休克大鼠自由基損傷的影響

1、夏至草醇提物對(duì)休克大鼠自由基損傷的影響                      作者：張有成 韓瑞，侯亞利，李寶亮，牛發(fā)良，趙自剛 牛春雨【摘要】  目的觀察夏至草醇提物對(duì)失血性休克大鼠多器官自由基損傷的影響。方法Wistar雄性大鼠18只，隨機(jī)分為夏至草組、模型組和對(duì)照組（均n=6）。夏至草組和模型組復(fù)制失血性休克模型，維持90 min，對(duì)照組僅手術(shù)。夏至草組自頸靜脈緩慢推

2、注夏至草醇提物（5 g/ml，6 g/kg·bw），其它兩組以等量生理鹽水代替。40 min后，制備肝、腎、心肌、肺組織勻漿，觀察組織勻漿自由基指標(biāo)的變化。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿MDA含量顯著升高，SOD活性降低；夏至草組各器官組織勻漿MDA含量顯著低于模型組，SOD活性升高，除心肌組織勻漿SOD活性低于對(duì)照組外，其它各指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論夏至草醇提物能明顯減輕大鼠重癥失血性休克后各器官的自由基損傷。 【關(guān)鍵詞】  夏至草 失血性休克 器官 自由基Abstract:ObjectiveTo observe the effects of e

3、thanol extract from Mrrubium incisum on free radical injury of organs in hemorrhagic shock rats. Methods18 male wistar rats were randomly divided into three groups: Mrrubium incisum group (n=6), model group (n=6) and control group (n=6). The hemorrhagic shock was established in Mrrubium incisum grou

4、p and model group for 90 min. Ethanol extract from Mrrubium incisum was venous injected in Mrrubium incisum group (5g/ml, 6g/kg·bw); in other groups ethanol extract from Mrrubium incisum was replaced by normal saline. After 40 min, the liver, kidney, cardiac muscle and lung were taken out for m

5、aking 10% homogenate, and the free radical indexes were determined in homogenate.ResultsThe MDA content of liver, kidney, cardiac muscle and lung homogenate in model group significantly increased, and SOD activity was significantly lowered as compared with control group. The MDA contents of liver, k

6、idney, cardiac muscle and lung homogenate in Mrrubium incisum group were significantly decreased, and SOD activities were significantly increased as compared with model group,and the indexes of Mrrubium incisum group were not statistical different as compared with control group, except the SOD activ

7、ity of cardiac muscle homogenate.ConclusionEthanol extract from Mrrubium incisum could markedly alleviate the free radical injury of organs in hemorrhagic shock rats.Key words:Mnubium incisum;  Hemorrhagic shock;  Organ;  Free radicals淋巴循環(huán)是循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，近年來(lái)，淋巴循環(huán)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和疾病中的作用逐漸受到重視1。失血性休

8、克（hemorrhagic shock）致組織微循環(huán)低灌注是引起肺、心、腎、肝等多個(gè)器官的功能障礙、誘發(fā)多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的主要因素之一。我室研究表明，淋巴微循環(huán)與休克的發(fā)生、及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切2，良好的淋巴微循環(huán)有利于休克的代償，淋巴微循環(huán)障礙可促進(jìn)休克的惡化3。夏至草具有利水消腫、活血化淤作用4，夏至草醇提物可明顯改善大鼠的淋巴微循環(huán)障礙5。本研究觀察了夏至草醇提物對(duì)失血性休克大鼠多器官自由基損傷的影響，旨在闡明夏至草對(duì)失血性休克以及淋巴微循環(huán)的藥作用。1  材料與儀器1.1  動(dòng)物與分

9、組18只健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠（醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供），體質(zhì)量220300 g。隨機(jī)均分為3組（均n=6）：對(duì)照組（僅行手術(shù)）、模型組（復(fù)制失血性休克模型，輸血加生理鹽水進(jìn)行）、夏至草組（復(fù)制失血性休克模型，輸血加夏至草醇提物進(jìn)行治療，MI）。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。1.2  藥品與儀器唇形科夏至草屬植物夏至草 Mrrubium incisum Benth 的全草（內(nèi)蒙古駐張家口醫(yī)藥站提供，經(jīng)河北北方學(xué)院中醫(yī)系姜希強(qiáng)教授鑒定），按6報(bào)道方法，制備夏至草醇提物，經(jīng)水煎醇沉，再經(jīng)活性炭脫色、滅菌制成原生藥含量為5 g·ml-1的注射液（pH、澄清度、溶血

10、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均為合格）；戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)20000919）；肝素鈉（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司生產(chǎn)，批號(hào)001218），F(xiàn)J-200型高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模具廠），自動(dòng)抽注機(jī)（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）。2  方法2.1  失血性休克模型的復(fù)制及液體復(fù)蘇所有大鼠肌注質(zhì)量分?jǐn)?shù)2的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）全身麻醉，無(wú)菌手術(shù)，行右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸靜脈插管，備放血及輸液用。舌靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%肝素（1 ml/kg，700 U/ml），全身抗凝。穩(wěn)定10 min后，經(jīng)自動(dòng)抽注機(jī)自頸總動(dòng)脈緩慢放血（失血量以全血量的1/5計(jì)，全血量以體重1/13計(jì)），3

11、min完成，保留備回輸用。以無(wú)菌林格式液瓶作為L(zhǎng)amson瓶，連接無(wú)菌輸液器，將液面調(diào)整至固定高度，維持低血壓（40 mmHg）90 min，復(fù)制大鼠重癥失血性休克模型7。然后，模型組、夏至草組以自動(dòng)推注機(jī)自左側(cè)頸靜脈緩慢回輸放出之血液；輸血完畢后，夏至草組輸入6 g·kg-1劑量（生藥）的夏至草醇提物（輸前用生理鹽水等倍稀釋），模型組輸入等量的生理鹽水。對(duì)照組僅麻醉及頸部手術(shù)，不放血及輸液復(fù)蘇。2.2  組織勻漿標(biāo)本的制備行液體復(fù)蘇后（或相當(dāng)）3 h，分別處死動(dòng)物。選擇固定的肝、腎、心、肺組織各0.81.0 g，加9倍的4無(wú)菌生理鹽水，應(yīng)用FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī)低溫

12、制備10%組織勻漿，應(yīng)用高速低溫離心機(jī)以2 500 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），取上清液置于-26冰箱內(nèi)。2.3  組織勻漿MDA,SOD測(cè)定應(yīng)用改良硫代巴比妥酸（TBA）微量法測(cè)定各臟器組織勻漿MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行操作。組織勻漿蛋白以考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量。2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以±s表示，經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，兩組間比較用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P<0.05為具有顯著性差異。1     

13、;    3  結(jié)果3.1  夏至草醇提物對(duì)失血性休克大鼠各器官組織勻漿MDA含量的影響模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿MDA含量均顯著高于夏至草組和對(duì)照組（P<0.01），而夏至草組肝、肺組織勻漿MDA含量與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。3.2  夏至草醇提物對(duì)失血性休克大鼠各器官組織勻漿SOD活性的影響模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿SOD活性均顯著低于對(duì)照組（P<0.01）；夏至草組除腎勻漿SOD活性低于對(duì)照組外（P<0.05），肝、心肌、肺組織勻漿SOD活性與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

14、（P>0.05），且各器官組織勻漿SOD活性高于模型組（P<0.01）。見表2。表1  夏至草醇提物對(duì)休克大鼠各器官組織勻漿MDA含量的影響（略）表2  夏至草醇提物對(duì)休克大鼠各器官組織勻漿SOD活性的影響（略）4  討論失血性休克是臨床急癥，微循環(huán)障礙以及凝血功能紊亂是引起大鼠肺、腎、肝等多個(gè)器官的功能障礙、誘發(fā)多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的主要因素之一1。因此，從改善微循環(huán)障礙以及血液流變性異常來(lái)尋找藥物和其他有效措施正成為醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。夏至草具有利水消腫、活血

15、化淤作用6，前期工作研究表明5，靜脈推注不同劑量的夏至草醇提物可改善大鼠的淋巴微循環(huán)障礙，增強(qiáng)腸系膜淋巴管收縮頻率及幅度，腸淋巴流量、蛋白輸出量明顯升高，該作用在6 g/kg劑量時(shí)最顯著，1 g/kg劑量則對(duì)淋巴循環(huán)未發(fā)生影響，在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。為此，本研究選擇了應(yīng)用6 g/kg的劑量，從自由基損傷角度觀察夏至草醇提物對(duì)急性微循環(huán)障礙大鼠器官損傷的影響，闡明夏至草的藥作用，并為器官損傷的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。自由基損傷在細(xì)胞損傷乃至器官功能障礙的發(fā)病學(xué)中具有重要作用8。研究結(jié)果表明，大鼠重癥失血性休克后，模型組肝、腎、心肌、肺組織勻漿自由基的代謝產(chǎn)物MDA含量均顯著升高，具有清除自由基功

16、能的SOD活性降低，結(jié)果提示失血性休克在引起大鼠急性微循環(huán)障礙的同時(shí)，加重了組織細(xì)胞的缺氧以及酸性產(chǎn)物潴留，加速了自由基的生成，這是引起自由基產(chǎn)生和釋放的重要原因9，表現(xiàn)在各臟器組織勻漿的自由基產(chǎn)物MDA含量增多，也加速了SOD的消耗；而過(guò)多的氧自由基進(jìn)一步激活補(bǔ)體，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，補(bǔ)體活化產(chǎn)物（C3a，C3b，C5a等）可以刺激巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和氧自由基，后者進(jìn)一步通過(guò)膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用攻擊內(nèi)皮細(xì)胞而加重?fù)p傷，形成細(xì)胞損傷的惡性循環(huán)。輸入夏至草醇提物后，各臟器組織勻漿MDA的含量均顯著低于模型組，SOD活性升高，結(jié)果提示輸入夏至草醇提物有效地減輕了失血性休克大鼠各重要器官的自由

17、基損傷，這主要是由于夏至草醇提物具有良好的改善微循環(huán)作用，減輕了休克時(shí)大鼠的急性微循環(huán)障礙，從而緩解了細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，抑制了自由基釋放，使機(jī)體自由基的產(chǎn)生與清除趨于平衡，減輕自由基對(duì)組織細(xì)胞的損傷作用，最終達(dá)到了保護(hù)器官功能的作用。綜上所述，夏至草醇提物對(duì)失血性休克障礙大鼠具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制與夏至草醇提物有效改善微循環(huán)流態(tài)10，11、改善細(xì)胞缺氧狀態(tài)，從而減輕組織細(xì)胞的自由基損傷有關(guān)，這為深入研究夏至草醇提物的藥理學(xué)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以活血化淤類中藥為靶標(biāo)，可為微循環(huán)障礙類疾病的治療開辟新途徑?！尽?#160; 1Fldi M. Lymphology in the second Mi

18、llenniumJ. Lymphology, 2001, 34(1):12.2張靜,姜 華,薄愛華.失血性休克時(shí)淋巴微循環(huán)的變化J.中華醫(yī)學(xué)雜志, 1991, 71(1): 24.3牛春雨,張 靜,穆 錚,等.不同轉(zhuǎn)歸的過(guò)敏性休克大鼠淋巴微循環(huán)的變化J.病理生理雜志, 1997,13 (6): 620.4李佳, 陳玉婷. 夏至草文獻(xiàn)考證J.中華醫(yī)史雜志, 2001,31(2):113.5牛春雨,李繼承,劉艷凱,等. 夏至草醇提物對(duì)大鼠淋巴循環(huán)作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)藥學(xué)雜志, 2006, 41(12): 914.6顧學(xué)裘. 藥物制劑注解M.北京:人民衛(wèi)生出版社,1988:238.7牛春雨,李繼承,趙自剛,等. 腸系膜淋巴管結(jié)扎對(duì)失血性休克大鼠肺組織一氧化氮及其表達(dá)的影響J.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué), 2006, 18(9): 527.8王萬(wàn)鐵,林麗娜,王 衛(wèi),等. 異丙酚對(duì)家兔肝缺血/再灌注后抗氧化能力改變的影響J.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2005, 21(1