含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯中佐使藥味的減毒作用觀察

1、含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯中佐使藥味的減毒作用觀察張娜,謝鳴(北京中醫(yī)藥大學(xué) 方劑學(xué)學(xué)科,北京 100029E-mail:xieming603摘要:目的:觀察單味關(guān)木通、龍膽瀉肝湯和去當(dāng)歸、生地、甘草的龍膽瀉肝湯給藥后,大鼠腎功能和組織形態(tài)學(xué)變化。方法:大鼠隨機(jī)分為正常對照組、單味關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯組和龍膽瀉肝湯去歸地草方組,正常對照組給予等量蒸餾水,后三組分別按6 gkg-1、17.5 gkg-1(其中含關(guān)木通6 gkg-1、14.5 gkg-1(其中含關(guān)木通6gkg-1給以相應(yīng)方藥水煎液灌胃,連續(xù)8周。給藥結(jié)束后,測定大鼠血、尿生化指標(biāo),觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果:三種方藥水煎液連續(xù)給大鼠灌

2、胃8周,均見有明顯腎損傷表現(xiàn),其中單味關(guān)木通組損傷最為嚴(yán)重;龍膽瀉肝湯組損傷較輕;去歸地草的龍膽瀉肝湯組較龍膽瀉肝湯組損傷嚴(yán)重,個(gè)別指標(biāo)甚至高于單味關(guān)木通組。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)劑量的關(guān)木通與配伍關(guān)木通的兩個(gè)復(fù)方均可引起腎損傷,龍膽瀉肝湯去當(dāng)歸、生地、甘草方的腎毒性較龍膽瀉肝湯強(qiáng)。提示含關(guān)木通配伍的復(fù)方的毒性作用不等于關(guān)木通,龍膽瀉肝湯方中當(dāng)歸、生地、甘草的配伍對關(guān)木通的腎損傷有一定的減毒作用。關(guān)鍵詞:關(guān)木通 龍膽瀉肝湯 配伍腎毒性先前我們觀察到單味關(guān)木通藥液(6 gkg-1和含等量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯(17.5 gkg-1連續(xù)給大鼠用藥,在給藥第4周均可出現(xiàn)腎臟損傷,同時(shí)隨著給藥時(shí)間的延長,損傷情況加重

3、,且龍膽瀉肝湯方較等量單味關(guān)木通的腎毒性低,提示龍膽瀉肝湯方中的其他藥味與關(guān)木通配伍可能存在一定的減毒作用?？紤]到方劑的中藥配伍特性,本文在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了龍膽瀉肝湯中可能存在的減毒藥味,及與關(guān)木通和全方腎毒性的關(guān)系。1.材料1.1 藥物(1關(guān)木通方:由單味關(guān)木通組成;(2龍膽瀉肝湯:由關(guān)木通36 g、龍膽草6 g、黃芩9 g、梔子9 g、澤瀉12 g、車前子9 g、當(dāng)歸3 g、生地黃9 g、柴胡6 g、生甘草6 g,共10味藥所組成;(3去歸地草的龍膽瀉肝湯:由關(guān)木通36 g、龍膽草6 g、黃芩9 g、梔子9 g、澤瀉12 g、車前子9 g、柴胡6 g,共7味中藥所組成。藥液制備

4、:分別用相當(dāng)于藥材量7倍體積的冷水浸泡藥材1 h,加熱至沸,煎煮30 min,傾出藥液,殘?jiān)偌尤?倍體積的水,煎煮20 min;合并兩次藥液,過濾;水浴濃縮,制成200%濃度的煎液(含2g 生藥/ml,4放置備用。1.2 動(dòng)物SD雄性大鼠40只,體重150±10g,SPF/VAF級,許可證號SCXK(京2002-0003,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3 試劑血肌苷(Scr、尿素氮(BUN測定試劑由北京利德曼試劑公司提供;N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG、-谷胺酰轉(zhuǎn)移酶(-GT、尿蛋白定量試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器- 1 -CX-4全自動(dòng)生化分析儀

5、(美國貝克曼庫爾特公司;WFZ800-D2型紫外可見分光光度計(jì)(北京第二光學(xué)儀器廠。2.方法2.1 分組及給藥大鼠按體重隨機(jī)分為正常對照組(N、關(guān)木通組(A、龍膽瀉肝湯組(B、龍膽瀉肝湯去歸地草組(C共四組,每組10只。A、B、C各組大鼠分別按6gkg-1、17.5gkg-1 (其中含關(guān)木通6gkg-1、14.5gkg-1(其中含關(guān)木通6gkg-1予以單味關(guān)木通、龍膽瀉肝湯、去歸地草的龍膽瀉肝湯煎液,正常對照組予以等量蒸餾水,每日灌胃1次,連續(xù)8周。給藥期間大鼠自由攝食飲水。2.2 指標(biāo)檢測于灌胃第8周后,代謝籠內(nèi)留取24小時(shí)尿液;腹主動(dòng)脈取血,離心取血清;取腎臟組織,4%多聚甲醛溶液中固定。

6、生化指標(biāo)測定: Scr(全自動(dòng)生化分析儀法、BUN(全自動(dòng)生化分析儀法、24小時(shí)尿蛋白定量(CBB法、尿NAG(比色法、尿-GT(比色法。組織病理學(xué)檢查:腎組織固定后,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后行HE染色,光鏡檢查。每組10個(gè)樣本,每樣本觀察2張切片,每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)皮質(zhì)區(qū)視野(×200,取平均值。腎小管間質(zhì)損傷(TI根據(jù)腎小管擴(kuò)張和(或萎縮,腎間質(zhì)纖維化,炎癥細(xì)胞浸潤累及小管及間質(zhì)的程度進(jìn)行評分1:腎小管無明顯改變.間質(zhì)中無或極少見炎癥細(xì)胞,無纖維化組織增生沒有腎皮質(zhì)損害,記0分;腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮,變性,壞死輕,呈灶性分布,間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織增生病變灶性,

7、范圍<25%,記1分;腎小管上皮細(xì)胞輕中度萎縮,變性,壞死輕,炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織中度增生病變范圍 26% 50%,記2分;腎小管上皮細(xì)胞萎縮,變性,壞死重,片狀分布,大量彌散或聚集成灶的炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織增生呈多灶或網(wǎng)狀成片,病變范圍>50%,記3分。2.3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S表示,采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),非正態(tài)分布資料用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析Kruskal-Waillis檢驗(yàn)。全部數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。3.結(jié)果3.1藥液對大鼠血清Scr、BUN的影響結(jié)果見表1。從中可以看出,與正常對照組(N比較,關(guān)木通組(

8、A、龍膽瀉肝湯組(B、龍膽瀉肝湯去歸地草組(C組大鼠血清Scr水平均明顯升高,有顯著或極顯著性差異(P<0.05和P<0.01;與A組比較,B組大鼠血清Scr水平明顯下降(P<0.05,而C組無明顯差異;與B組比較,C組大鼠血清Scr水平無明顯差異。與N組比較,A、C 組大鼠血清BUN水平均明顯升高,有顯著性差異(P<0.05;與A組比較,B組大鼠血清BUN水平明顯下降(P<0.05,而C組無明顯差異;與B組比較,C組大鼠血清BUN 水平明顯升高,有顯著性差異(P<0.05。- 2 -表1. 各組大鼠血清Scr與BUN水平比較(x±S,n=10組別

9、 Scr(mmol·L-1 BUN(mmol·L-1N 38.79±6.856.06±0.44A 57.91±11.81*7.58±2.61*B 48.68±12.03*&6.07±0.55&C 53.17±8.79*7.60±1.65*#*P<0.05,*P<0.01,與N組比較;& P<0.05,&&P<0.01,與A組比較;#P<0.05,#P<0.01,與B 組比較。3.2藥液對大鼠尿液NAG、-GT和尿蛋白的影

10、響結(jié)果見表2。從中可以看出,與N組比較,A、B、C組大鼠尿蛋白水平均明顯升高,有顯著或極顯著性差異(P<0.05和P<0.01;與A組比較,B組大鼠尿蛋白水平均明顯下降,有極顯著性差異(P<0.01;與B組比較,C組大鼠尿蛋白水平明顯升高,有極顯著性差異(P<0.01。與N組比較,A、B、C組大鼠尿NAG水平均明顯升高,有顯著或極顯著性差異(P<0.05和P<0.01;與A組比較,B組和C組大鼠尿NAG水平均明顯下降,有顯著或極顯著性差異(P<0.05和P<0.01;與B組比較,C組大鼠尿NAG水平無明顯差異。與N組比較,A、B、C組大鼠尿-GT

11、水平均明顯升高,具有極顯著性差異(P<0.01;與A組比較,B組大鼠尿-GT水平均明顯下降,有顯著性差異(P<0.05;與B組比較,C組大鼠尿-GT水平均無明顯差異。表2. 各組大鼠尿液NAG,-GT和尿蛋白比較(x±S,n=10組別 U Pro(mg·mL-1NAG(u·L-1-GT(u·L-1N 4.43±1.26 6.07±1.55 11.45±1.53A 9.10±1.70* 14.52±1.92* 19.28±3.79*B 6.15±2.07*&&

12、10.62±2.56*&&16.63±2.05*&C 9.72±2.29*#12.12±2.07*&16.73±3.48*P<0.05,*P<0.01,與N組比較;& P<0.05,&&P<0.01,與A組比較;#P<0.05,#P<0.01,與B 組比較。3.3各組大鼠腎組織病理學(xué)改變各組大鼠腎組織光鏡下變化見N組大鼠腎臟組織鏡下腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常,小管上皮細(xì)胞輕度空泡變性;A組大鼠腎小管間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤,近曲小管廣泛變性壞死,并見有腎小球壞死

13、的現(xiàn)象,小管上皮細(xì)胞增生活躍,可見雙核細(xì)胞,腎間質(zhì)可觀察到纖維細(xì)胞增生現(xiàn)象;B組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常,大鼠腎小管輕度擴(kuò)張,呈條帶狀分布,腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,纖維細(xì)胞輕度增生現(xiàn)象,損傷較輕;C組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)基本正常,腎小管明顯擴(kuò)張,呈條帶狀分布,伴腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,腎間質(zhì)可觀察到纖維細(xì)胞增生現(xiàn)- 3 -象。腎小管間質(zhì)病理損害(TI定量評分結(jié)果見表3。從中可以看出,與N組比較,A、B、C組大鼠腎病理損害積分均見升高,且有非常顯著性差異(P<0.01;與A組比較,B組大鼠腎病理積分降低,有顯著性差異(P<0.05,而C組積分無顯著性差異;與B組比較,C組大鼠病理積分無顯著性差異

14、。x±S,n=10表3.各組大鼠腎小管間質(zhì)病理損害(TI定量分析(score 組別 lesionN 0.14±0.097A 1.64±0.412*B 0.77±0.231*&&C 1.49±0.321 *#*P<0.05,*P<0.01,與N組比較;& P<0.05,&&P<0.01,與A組比較;#P<0.05,#P<0.01,與B 組比較。4、討論對含有關(guān)木通的多個(gè)復(fù)方,如導(dǎo)赤散、龍膽瀉肝丸、當(dāng)歸四逆湯等的腎毒性研究結(jié)果表明中藥復(fù)方的腎毒性低于單味關(guān)木通25,提示方劑

15、合理配伍是降低關(guān)木通腎毒性的重要途徑。我們在之前所觀察到的配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯的腎毒劑量和給藥時(shí)程條件的基礎(chǔ)上,本次比較觀察了單味關(guān)木通、龍膽瀉肝湯和去歸地草的龍膽瀉肝湯的腎毒性大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單味關(guān)木通藥液(6g·kg-1、含等量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯(17.5 g·kg-1大鼠給藥第8周時(shí)尿中NAG、-GT活性、蛋白含量、血清Scr水平、腎小管間質(zhì)病理損害評分雖均見顯著升高,但龍膽瀉肝湯組的多個(gè)指標(biāo)的水平顯著低于等量的單味關(guān)木通組,表明含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯的腎毒性作用較單味關(guān)木通小,提示有毒性的單味藥與含其藥味的配方在毒性上是有差異的,而僅依據(jù)單味藥物的毒性推測有關(guān)復(fù)方的安

16、全性則可能與實(shí)際不符。值得注意的是,實(shí)驗(yàn)中的去歸、地、草的龍膽瀉肝湯組(14.5 g·kg-1大鼠不僅多項(xiàng)指標(biāo)較正常組顯著升高,且其血清BUN與尿蛋白的水平還顯著高于龍膽瀉肝湯組,甚至高于單味關(guān)木通組,表明去歸、地、草的龍膽瀉肝湯組有較大的腎毒性。而聯(lián)系龍膽瀉肝湯腎毒性作用較單味關(guān)木通小,去歸、地、草的龍膽瀉肝湯的腎毒性較龍膽瀉肝湯大的事實(shí),推測含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯方中存在關(guān)木通的減毒配伍,而這一減毒效應(yīng)可能與方中歸、地、草的配伍有關(guān)。依照中醫(yī)方劑學(xué)理,龍膽瀉肝湯為瀉火祛濕之方,方中在重用大隊(duì)苦寒燥濕藥味的同時(shí),佐用當(dāng)歸、生地滋陰養(yǎng)血以防滲利太過,甘草甘溫補(bǔ)中以防苦寒?dāng)∥?當(dāng)歸、生地

17、、甘草在方中主要配伍意義是監(jiān)制方中苦寒藥之毒副作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為該方佐制配伍意義的認(rèn)識提供了一定的現(xiàn)代理解。- 4 -參考文獻(xiàn)1 Pham K, Smoyer WE, Archer DC, etal .Oral feeding of renal tubular antigen abrogates interstitial nephritis and renal failure in Brown Norway rats J.Kindney Int,1997,52(3:725-732.2李春香,趙玉庸,陳志強(qiáng),等.導(dǎo)赤散與單味關(guān)木通對動(dòng)物腎毒性的比較研究J.中醫(yī)雜志.2003,44(3:219-

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19、omZhang Na,Xie Ming(Department of formulaology ,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing, China .100029AbstractObjective : To observe the renal function, histology in rats administered with Aristolochia Manshriensis Kom (AMK, Long Dan Xie Gan decoction(LDXGD and Long Dan Xie Gan de

20、coction removed Angelica sinensis,Rehmannia glutinosa Libosch and Glycyrrhizae uralensis(LDXGDRALG. Method : Divided SD rats into control, AMK and LDXGD groups (n = 10 per group at random and administrated orally for 8 weeks with distilled water, AMK (6 gkg-1, LDXGD(17.5 gkg-1, containing AMK 6 gkg-1and LDXGDRALG(14.5 gkg-1, containing AMK 6 gkg-1, respectively. Measured renal functional parameters in serum, urine and observe renal histologic lesions at the end of 8 weeks. Result : Three kinds of water abstract induced significantly rena