丙型肝炎病毒核心蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及人胎肝cDNA

1、丙型肝炎病毒核心蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及人胎肝cDNA文庫的擴增、純化和鑒定         08-01-13 13:43:00     編輯：studa20         作者：劉敏，張偉，陳天艷，藺淑梅，趙良，劉錦鋒，趙英仁，張樹林【關(guān)鍵詞】  丙型肝炎病毒核心蛋白    摘要：目的  用含丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的cD

2、NA片段構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體，并進行人胎肝cDNA文庫的擴增、純化和鑒定。方法  PCR擴增含HCV core蛋白不同大小的cDNA片段，分別克隆入pUC19質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后，再亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中。擴增人胎肝cDNA文庫并純化、鑒定。結(jié)果  獲得含HCV core蛋白的cDNA片段，并成功克隆入pGBKT7中。待轉(zhuǎn)化的人肝cDNA文庫滴度在5×108左右，純化后的質(zhì)粒 DNA質(zhì)量濃度約1g/L。用EcoR、Xho雙酶切顯示插入片段大小不一。結(jié)論  成功構(gòu)建了核心蛋白的酵母雙雜交誘餌載體；擴增、純化的人胎肝cDNA文庫的多樣性很好

3、，適合于篩選。為用酵母雙雜交技術(shù)研究與HCV core蛋白相互作用的蛋白打下堅實基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒核心蛋白；酵母雙雜交；cDNA文庫ABSTRACT: Objective  To construct the bait vector of HCV core region in yeast twohybrid system, and to amplify, purify and evaluate the cDNA gene bank of human fetal liver. Methods  The cDNA fragments encoding HCV core r

4、egion were amplified by PCR, and then were cloned into pUC19. After being verified by sequencing, they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system, subsequently amplified and purified. And then the cDNA gene bank of human fetal liver was evaluated. Results  The cDNA fra

5、gments of HCV core region were amplified successfully.The cDNA gene bank of human fetal fetal liver was about 5×108; the purified DNA was about 1g/L; and the built in fragments were different in size after digested with EcoR and Xho. Conclusion  The bait vector HCV core in yeast twohybrid

6、system 3 is constructed successfully. The diversity of cDNA of human fetal liver after amplified and purified is suitable for screening. These lay a rigid basis for further study of the HCV core protein and may help us in understanding how HCV works.KEY WORDS:HCV core protein; yeast twohybrid system

7、; cDNA gene bank丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的主要原因，全球超過1.7億人口血清HCV抗體陽性。目前對于HCV感染尚無有效的預(yù)防疫苗，病毒蛋白對HCV感染細胞的功能影響還很不明確，利巴韋林和干擾素聯(lián)合治療僅對部分病例有效。這就迫切要求我們進一步了解病毒與細胞間的相互作用及免疫逃避機制。缺乏HCV感染和復(fù)制的組織培養(yǎng)系統(tǒng)、缺乏合適的HCV感染動物模型是我們進行HCV發(fā)病機制研究所面臨的主要障礙1。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為我們的研究提供了新的思路。蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)2。酵母雙雜交系統(tǒng)是近年來新發(fā)展起來的一種分析真核細胞中蛋白蛋白

8、、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的一種有效的基因分析方法。酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3是在系統(tǒng)1和系統(tǒng)2基礎(chǔ)上的改進，具有轉(zhuǎn)化效率高，假陽性率低等優(yōu)點，我們利用它來克隆與HCV 核心(core)蛋白相互作用蛋白的基因，以期為HCV core蛋白功能的研究提供新依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料  含HCV全長cDNA質(zhì)粒pCDNA3.0HCV由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室尹文博士惠贈；表達載體pGBKT7酵母菌種(美國Clontech公司)；質(zhì)粒pUC19菌種(本研究室保存)；PCR試劑盒、DNA重組所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶(Gibco公司)；人肝酵

9、母雙雜交cDNA文庫購自Clontech公司。1.2  方法  1.2.1  PCR擴增  克隆編碼核心蛋白的引物：引物P1：5GCCGAATTCATGAGCA CGAATCCTAAACCT3；引物P2：5GCGTCGACTTAGGCTGAAGC GGGCACAGT3。PCR反應(yīng)條件為：94 30s, 55 60s，72 60s，30個循環(huán) 。1.2.2  PCR產(chǎn)物克隆及鑒定  純化的PCR產(chǎn)物用EcoR和Sal雙酶切，定向克隆入pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，進行藍白篩選。酶切鑒定出含插入片段的陽性克隆命名為pUC19core

10、蛋白，進行序列分析。1.2.3  構(gòu)建及鑒定誘餌載體  用EcoR、Sal酶切pUC19core蛋白和表達載體pGBKT7, 回收core蛋白及pGBKT7載體片段，載體片段與插入片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5。經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析，含正確插入片段的克隆命名為pGBKT7core蛋白。1.2.4  人胎肝cDNA文庫的擴增、純化與鑒定  按Clontech公司的說明書對文庫進行擴增，用QIAGEN公司的操作手冊對文庫進行純化。取純化的文庫質(zhì)粒1L轉(zhuǎn)化E.coli DH5感受態(tài)細胞，隨機挑取10個單克隆提取質(zhì)粒，EcoR、Xho雙酶切鑒定cDNA文庫的多樣性。

11、2  結(jié)果2.1  Core蛋白基因片段編碼區(qū)的擴增  可見擴增出與預(yù)期大小一致的cDNA片段(圖1)。Core蛋白大小為588bp。圖1  核心蛋白基因片段編碼區(qū)擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳（略）Fig.1 AGE analysis of PCR products encoding cDNA fragments of HCV core region geneM: DNA PCR marker; 1-6: HCV core2.2  重組pUC19core蛋白質(zhì)粒的酶切鑒定及序列分析  鑒定正確的pUC19core蛋白重組質(zhì)粒分別做正反向測

12、序，序列分析表明所擴增的core蛋白基因序列與登錄的HCV core蛋白基因序列完全一致(圖2)。圖2  重組pUC19core蛋白質(zhì)粒的EcoR、Sal雙酶切鑒定（略）Fig.2 AGE analysis of recombinant plasmid pUC19core digested with EcoR, SalM: DNA PCR marker ; 1-2: pUC19core recombinant plasmid2.3  重組pGBKT7core蛋白質(zhì)粒的酶切分析  重組質(zhì)粒pGBKT7core蛋白的酶切鑒定結(jié)果見圖3。圖3  重組pGBKT7core蛋白質(zhì)粒的EcoR、Sal雙酶切鑒定（略）Fig.3 AGE analysis of recombinant plasmid pGBKT7core digested with EcoR, SalM: DNA PCR marker; 13: pGBKT7 core recombinant plasmid2.4  人胎肝cDNA文庫的擴增、純化與鑒定  經(jīng)測定，待轉(zhuǎn)化的人肝cDNA文庫滴度在