臨床基因擴(kuò)增檢驗的質(zhì)量保證（共97）.ppt

1、臨床基因擴(kuò)增檢驗的臨床基因擴(kuò)增檢驗的質(zhì)量保證質(zhì)量保證定定 義義n質(zhì)量保證質(zhì)量保證(Quality Assurance,QA)(Quality Assurance,QA) 為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。 n室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality Control,IQC)Internal Quality Control,IQC) 由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。

2、定定 義義n室間質(zhì)量評價室間質(zhì)量評價 （External Quality Assessment, External Quality Assessment, EQAEQA） 為客觀比較一實驗室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實驗室之間的結(jié)果具有可比性。這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定在實時的測定結(jié)果的可接受性。當(dāng)EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒炇艺J(rèn)證的目的而評價實驗室操作時，常描述為實驗室能力比對檢驗（Proficiency testing, PT）。在以前的文獻(xiàn)中，EQA常描述室間質(zhì)量控制。定定 義義

3、n準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 (Accuracy)(Accuracy) 待測物的測定值與其真值的一致性程度。準(zhǔn)確度不能直接以數(shù)值表示，通常以不準(zhǔn)確度來間接衡量。對一分析物重復(fù)多次測定，所得均值與其真值或參考靶值之間的差異亦即偏差即為測定的不準(zhǔn)確度。 n偏差偏差 (Bias) (Bias) 待測物的測定值與一可接受參考值之間的差異。定定 義義n精密度精密度(Precision) 在一定條件下所獲得的獨立的測定結(jié)果之間的一致性程度。與準(zhǔn)確度一樣，精密度同樣也是以不精密度來間接表示。測定不精密度的主要來源是隨機(jī)誤差，以標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和/或變異系數(shù)（CV）具體表示。SD或CV越大，表示重復(fù)測定的離散度越大，精密度越

4、差，反之則越好。 定定 義義n批批 (Run) 在相同條件下所獲得的一組測定。 n均值（均值（Mean） n標(biāo)準(zhǔn)差（標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation, SD或或s） n變異系數(shù)（變異系數(shù)（Coefficient of variation, CV） 定定 義義n正態(tài)分布正態(tài)分布(Gaussian distribution) 當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時間重復(fù)多次測定，當(dāng)測定數(shù)據(jù)足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應(yīng)測定值的個數(shù)，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。 定 義n正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學(xué)含義可用

5、均數(shù)（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來說明。臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室常規(guī)測定步驟常規(guī)測定步驟n標(biāo)本收集：標(biāo)本收集：選擇測定項目、標(biāo)本收集和保存。n實驗室測定：實驗室測定：標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、核酸擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測、測定的有效性和臨床診療價值。n報告和解釋：報告和解釋：結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評之間的關(guān)系質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評之間的關(guān)系臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理暫行辦法管理暫行辦法n總則n實驗室規(guī)劃、設(shè)置和審批n實驗室管理n監(jiān)督管理n附則臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的設(shè)置n臨床標(biāo)本的接收n基因擴(kuò)增檢

6、驗實驗室設(shè)置的一般要求 n基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作流程 臨床標(biāo)本的接收 n通常的工作流程：標(biāo)本采集 血清分離 編號 保存或檢測n應(yīng)在四個測定區(qū)域之外的地方或區(qū)域內(nèi)接收 n接收的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中n在核酸提取時帶入至標(biāo)本制備區(qū)臨床基因擴(kuò)增實驗室設(shè)置的一般原則臨床基因擴(kuò)增實驗室設(shè)置的一般原則n各區(qū)獨立n注意風(fēng)向n因地制宜n方便工作“十六字方針十六字方針”基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作流程基因擴(kuò)增檢驗實驗室工作流程n進(jìn)入各個工作區(qū)必須遵循嚴(yán)格的單一方向順序。臨床標(biāo)本收集、運送、保存及其質(zhì)量控制 n標(biāo)本收集 n標(biāo)本保存n標(biāo)本運送 標(biāo)本收集n標(biāo)本采集時間對擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響 n標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 n標(biāo)本的類型

7、和采集量 n采樣質(zhì)量的評價 n采樣及運輸容器 n標(biāo)本采集中的防污染 標(biāo)本采集時間對擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響n在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結(jié)果。 標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備n標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其它雜物,但應(yīng)適度,過度清潔消毒有可能會去掉或破壞靶微生物,故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行。標(biāo)本的類型和采集量n標(biāo)本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。一般來說，如果標(biāo)本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測。n對于定量測定來說，對標(biāo)本的收集要求更為精確。采樣質(zhì)量的評價n血清(漿)標(biāo)本:溶血、脂血等；n分泌物、痰：評價內(nèi)容包括細(xì)胞組

8、成，所需類型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。 評價方法：包括肉眼觀察,顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。 采樣及運輸容器 n標(biāo)本的采集材料如棉簽應(yīng)為一次性使用；n運輸容器亦應(yīng)為密閉的一次性裝置；n采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴(kuò)增及檢測過程造成干擾。 標(biāo)本采集中的防污染 n 采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液等；n 如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RNAase失活。標(biāo)本保存 n靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標(biāo)本的保存對于核酸擴(kuò)增測定的有效性極為重要。 n使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標(biāo)本，標(biāo)本可在室溫下穩(wěn)定約7天。 標(biāo)本保存n臨床體液標(biāo)

9、本長期保存應(yīng)在-70下。 n如為提取核酸后用于DNA擴(kuò)增分析的樣本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)緩沖液中4 下保存。 n用于RNA擴(kuò)增分析的樣本，則應(yīng)于上述緩沖液中-80或液氮下保存。 n核酸的乙醇沉淀物則可于-20下保存。 標(biāo)本運送 n樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實驗室。n樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運送或郵寄。n實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。臨床基因擴(kuò)增檢驗的室內(nèi)質(zhì)量控制臨床基因擴(kuò)增檢驗的室內(nèi)質(zhì)量控制n

10、測定前的質(zhì)量控制n核酸樣本的制備及其質(zhì)量控制 n統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制n質(zhì)量控制的評價測定前質(zhì)量控制測定前質(zhì)量控制n實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理n理想的試劑和操作方法 n人員培訓(xùn) 實驗室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理n臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室應(yīng)有充分合理的空間、良好的照明和空調(diào)設(shè)備 ；n實驗室儀器設(shè)備應(yīng)保養(yǎng)良好，實驗用品要達(dá)到相應(yīng)的要求。加樣器的校準(zhǔn)？帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢？離心機(jī)？熱循環(huán)儀？水浴箱和/或恒溫干浴儀？酶標(biāo)儀和洗板機(jī)？基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控基因擴(kuò)增儀器設(shè)備的質(zhì)控儀器設(shè)備儀器設(shè)備質(zhì)控方法質(zhì)控方法 頻頻 度度失控標(biāo)準(zhǔn)失控標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增儀儀器校驗實驗當(dāng)儀器移動時實驗失敗熱電偶監(jiān)測溫度擴(kuò)增功能檢測每月一次每 4 個

11、月一次 如靶溫度或溫度差異超出允許范圍待測孔未出現(xiàn)擴(kuò)增，檢測溫度程序打印每次測定時打印程序不對加樣器校準(zhǔn)每年 2 次不符合要求水浴箱溫度檢測每次實驗不符合要求酶標(biāo)儀預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)每年 2 次不符合要求帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢n首先制備一個含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸頭的最大體積為100l，則將加樣器吸取體積調(diào)至110120l，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質(zhì)量好，則有色液體不應(yīng)出現(xiàn)在濾塞之上，否則說明濾塞不嚴(yán)。 帶濾塞吸頭的使用及質(zhì)檢n用實驗來檢驗帶濾塞吸頭的質(zhì)量：先純化制備數(shù)份強陽性和數(shù)份陰性核酸標(biāo)本，然后將加樣器吸取量設(shè)至擴(kuò)增加樣所需的體積，使用待評價帶濾塞吸頭對

12、一份強陽性樣本來回吸取10次（模擬10份陽性樣本的吸?。?，將最后一次的吸取液加至一含擴(kuò)增反應(yīng)液的管中，之后，換一個新吸頭，連續(xù)吸取10份陰性樣本分別至10個擴(kuò)增反應(yīng)管中，此過程重復(fù)35次，最后對每一管按所用試劑方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測。強陽性樣本應(yīng)為強陽性，陽性弱或出現(xiàn)陰性則說明吸頭可能含有擴(kuò)增抑制物。所有陰性樣本應(yīng)為陰性，出現(xiàn)陽性則表明吸頭不能有效地防止氣溶膠對加樣器的污染。 擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測方法n一是使用一種熱電偶探針、微伏轉(zhuǎn)換器和自動圖示記錄儀組成擴(kuò)增加熱模塊孔內(nèi)溫度監(jiān)測記錄系統(tǒng)，當(dāng)孔間溫度變異超出1時，其可測出來。n具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴(kuò)增反應(yīng)管放置于擴(kuò)

13、增儀各孔中，熱電偶探針透過擴(kuò)增反應(yīng)管蓋插至緩沖液中，然后按程序進(jìn)行一個常規(guī)的PCR擴(kuò)增，加熱模塊如為96孔，則至少要測定12孔不同位置孔內(nèi)的溫度，在整個擴(kuò)增過程中，可移動熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測溫度，但每一孔內(nèi)溫度監(jiān)測至少要有一個擴(kuò)增周期。 擴(kuò)增儀孔間溫度的重復(fù)性和均一性的檢測方法n第二種方法并非直接測定孔內(nèi)溫度，而是通過擴(kuò)增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽性質(zhì)控樣本的擴(kuò)增反應(yīng)管置于擴(kuò)增儀各孔中按常規(guī)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，觀察結(jié)果的一致性程度，如果有某一個或幾個孔結(jié)果有問題，則應(yīng)確定這一個或幾個孔是否會重復(fù)性地得到假陰性結(jié)果，如果是，則表明相應(yīng)孔的熱傳導(dǎo)有損壞。 實驗室的

14、日常工作管理實驗室的日常工作管理 工工 作作 項項 目目 核核 查查 點點水浴箱、微量恒溫器（加熱模塊） 校準(zhǔn)及記錄 溫度10%次氯酸鈉溶液 新鮮配制生物安全柜 先起動運行30分鐘后再開始工作 室內(nèi)質(zhì)控 弱陽性質(zhì)控（定性） 有 低、中、高濃度質(zhì)控（定量） 有 陰性質(zhì)控：原樣本 有 經(jīng)歷提取過程的空管 有 僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液管 有n實驗臺面 使用后用10%次氯酸鈉溶液消毒，n 再用70%乙醇清潔 紫外照射n加樣器、離心機(jī) 使用后用10%次氯酸鈉溶液消毒，n 再用70%乙醇清潔n實驗室各區(qū) 遵循單一工作流向n 紫外照射理想的試劑和操作方法 n試劑盒的質(zhì)檢n定量測定的精密度是測定組成步驟的變異和的平

15、方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測等）的標(biāo)準(zhǔn)差； SDSDSDabc222.理想的試劑和操作方法n改善測定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應(yīng)對試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集、核酸提取、測定方法和儀器操作寫出“標(biāo)準(zhǔn)操作程序”(SOP) 實驗室質(zhì)量管理體系的建立n質(zhì)量手冊n質(zhì)量體系程序文件n標(biāo)準(zhǔn)操作程序質(zhì)量管理的內(nèi)涵n寫你所做的n做你所寫的n記錄你已做的怎樣編寫SOP？人員培訓(xùn) n臨床基因擴(kuò)增檢驗的操作主要是標(biāo)本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡單，但由于均為微量操作，要獲得穩(wěn)定可靠的測

16、定結(jié)果，操作人員需要一定的專業(yè)技術(shù)知識和經(jīng)驗，要盡可能做到知其然又知其所以然。 核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測核酸樣本的制備、擴(kuò)增檢測及其質(zhì)量控制及其質(zhì)量控制n一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理n核酸的分離純化n靶核酸提取的質(zhì)量 n臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) n核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測的質(zhì)控 n產(chǎn)物檢測的質(zhì)控 一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理n靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。 n一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂

17、解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。核酸的分離純化 n核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。 n經(jīng)典方法n硅吸附法n對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進(jìn)行評價。 臨床標(biāo)本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質(zhì) n臨床標(biāo)本中：臨床標(biāo)本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產(chǎn)物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。n核酸提取中：核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑 。

18、 對臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施n質(zhì)控措施： 采用內(nèi)質(zhì)控（internal control, IC）（通常稱為內(nèi)標(biāo)）的方法 n內(nèi)標(biāo)有兩種,即競爭性的和非競爭性的內(nèi)標(biāo)。 n內(nèi)標(biāo)設(shè)置的必要性？統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制統(tǒng)計學(xué)質(zhì)量控制 n理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件n測定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序 n統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的特點 n統(tǒng)計質(zhì)控方法理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件n基質(zhì)與待測樣本一致；n所含待測物濃度接近試驗的決定性水平；n穩(wěn)定；n靶值或預(yù)期結(jié)果已定；n無已知的生物傳染危險性；n單批可大量獲得；n價廉測定中質(zhì)控樣本的設(shè)置、數(shù)量及排列順序n每次檢測究竟使用幾個質(zhì)控樣本并排在臨床標(biāo)本中的哪個位置最為適宜？從

19、理論上說，為最大可能地檢出實驗的隨機(jī)和系統(tǒng)誤差，應(yīng)每隔幾份臨床標(biāo)本插入1份質(zhì)控樣本，但考慮國內(nèi)目前的實際情況及成本效益，一般來說，如果臨床基因擴(kuò)增檢驗的標(biāo)本量不是特別大，定性測定有一份接近cut-off的弱陽性和一份陰性質(zhì)控樣本應(yīng)可以滿足要求。而定量測定則要根據(jù)試驗的測定范圍，采用高、中、低三種濃度的質(zhì)控樣本。至于在測定中的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。 臨床基因擴(kuò)增檢驗室內(nèi)質(zhì)控的臨床基因擴(kuò)增檢驗室內(nèi)質(zhì)控的獨特性獨特性n即監(jiān)測污染發(fā)生的陰性質(zhì)控的設(shè)置。 n應(yīng)該包括1份陰性原血清樣本、1份在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個空管和僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管。 陰性原血清質(zhì)控樣本的功能

20、n監(jiān)測實驗室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的污染； n由實驗操作所致的標(biāo)本間的交叉污染；n擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。 在標(biāo)本核酸提取過程中帶入的一個空管的功能n基本功能與陰性原血清質(zhì)控樣本相同，但不同的是，其基質(zhì)為水，不含陰性原血清質(zhì)控樣本中可能有的擴(kuò)增抑制物，因而對污染的反映更為靈敏；n不能取代原血清陰性樣本。僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管的功能n監(jiān)測擴(kuò)增試劑是否發(fā)生污染，具有較強的污染鑒別性。n如想鑒別實驗室是否發(fā)生污染，可將一個或多個空管打開靜置于標(biāo)本制備區(qū)3060分鐘，然后加入擴(kuò)增反應(yīng)混合液同時以水替代核酸樣本擴(kuò)增，如為陽性，而上述僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管為陰性，則說明實驗室以前擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。 統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的特點 n

21、檢驗誤差有兩類，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機(jī)誤差。n系統(tǒng)誤差通常表現(xiàn)為質(zhì)控物測定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設(shè)備、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物出現(xiàn)問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。n隨機(jī)誤差則表現(xiàn)為測定SD的增大，主要是由實驗操作人員的操作等隨機(jī)因素所致，其出現(xiàn)難以完全避免和控制。統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的功能n統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的功能就是發(fā)現(xiàn)誤差的產(chǎn)生及分析誤差產(chǎn)生的原因，采取措施予以避免。n開展統(tǒng)計質(zhì)量控制前，應(yīng)將可以控制的誤差產(chǎn)生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內(nèi)質(zhì)控的前提，也是保證常規(guī)檢驗工作質(zhì)量的先決條件。 統(tǒng)計質(zhì)控方法 n基線測定n質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 nLevey-J

22、ennings質(zhì)控圖方法 nLevey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 n累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法 n“即刻法”質(zhì)控方法 基線測定n最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； n當(dāng)RCV與OCV接近，或小于2 OCV時，則RCV是可以接受的。以上為批間變異。n批內(nèi)變異的測定；n室內(nèi)質(zhì)控物的測定準(zhǔn)確度的評價。 臨床基因擴(kuò)增檢驗臨床基因擴(kuò)增檢驗IQCIQC統(tǒng)計統(tǒng)計計算問題計算問題n可使用質(zhì)控樣本擴(kuò)增后的拷貝數(shù)/ml或IU/ml來進(jìn)行統(tǒng)計

23、計算，也可用其對數(shù)值進(jìn)行。n由于基因擴(kuò)增結(jié)果的原始數(shù)據(jù)通常很大，故使用其對數(shù)值來進(jìn)行質(zhì)控統(tǒng)計分析可能要更為方便一些。 質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 n質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 n質(zhì)控規(guī)則的功能 n常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義 質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式n通常質(zhì)控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質(zhì)控測定中超出質(zhì)量控制限的測定值的個數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值13SD來表示。 n當(dāng)質(zhì)控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。 n常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測定值中，如果有一個測定值超出均值3s范圍，即可將該批測定判為失控。 質(zhì)控規(guī)則的功能 n簡

24、單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控 。n當(dāng)整個質(zhì)控過程中使用同一個質(zhì)控物時，可用來判斷單個或多個測定批內(nèi)該質(zhì)控物的測定值是否失控； n當(dāng)整個質(zhì)控過程中使用兩個或兩個以上的不同的質(zhì)控物時，可用來判斷同一或多個測定批內(nèi)的兩個或兩個以上的質(zhì)控物的測定值是否失控。 常用質(zhì)控規(guī)則的符號及定義 符符 號號 定定 義義n12S 一個質(zhì)控測定值超出2s控制限。n13S 一個質(zhì)控測定值超出3s控制限。n22S 兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s或2s控制限。nR4S 同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。n31S 三個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或1s控制限。n41S 四個連

25、續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s或1s控制限。n7X 七個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。n7T 七個連續(xù)的質(zhì)控測定值呈現(xiàn)一個向上或向下的趨勢變化。n8X 八個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。n9X 九個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。n10X 十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值（）的同一側(cè)。Levey-Jennings質(zhì)控圖方法 n也稱Shewhart質(zhì)控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。后來（二十世紀(jì)五十年代初），Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的

26、Levey-Jennings質(zhì)控圖。質(zhì)控圖質(zhì)控圖質(zhì)控圖質(zhì)控圖Levey-Jennings質(zhì)控圖基本的統(tǒng)計學(xué)含義n穩(wěn)定條件下，在20個IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個。n如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 質(zhì)控圖的記錄的其它方面nIQC數(shù)據(jù)是用來控制實際過程的，因此其表達(dá)應(yīng)清楚和直接，在質(zhì)控圖上記錄結(jié)果時，應(yīng)同時記錄測定的詳細(xì)情況，如日期、試劑、質(zhì)控物批號和含量及測定者姓名等。 Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的特點n優(yōu)點是簡單明了；n缺點： 以2s為失控限，假失控的概率太高，通常

27、不能接受； 以3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強。 Levey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法 nWestgard多規(guī)則質(zhì)控方法即是將前述的多個質(zhì)控規(guī)則同時應(yīng)用進(jìn)行質(zhì)控判斷的方法。最初常用的有六個質(zhì)控規(guī)則，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S規(guī)則作為告警規(guī)則，當(dāng)出現(xiàn)質(zhì)控測定值違反12S規(guī)則時，則起動其它規(guī)則進(jìn)行判斷。只有當(dāng)使用所有質(zhì)控規(guī)則判斷確定某測定批在控時才說明該測定批在控，只要上述質(zhì)控規(guī)則之一判斷測定批失控則即認(rèn)為該測定批失控。通常上述規(guī)則中，13S和R4S規(guī)則反映的是隨機(jī)誤差，而22S、41S和10X反映的是系統(tǒng)誤差，系統(tǒng)

28、誤差超出一定的程度，也可從13S和R4S規(guī)則反映出來。 Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法的特點n其是在Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，自然也就具有Levey-Jennings質(zhì)控圖方法的優(yōu)點，可通過相似的質(zhì)控圖來進(jìn)行分析； n假失控和假告警概率低； n誤差檢出能力增強 。累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法n累積和 (CUSUM) 質(zhì)控方法于1977年由Westgard等提出,對系統(tǒng)誤差有較好的測出能力。 常用的累積和 (CUSUM) 質(zhì)控規(guī)則 質(zhì)控規(guī)則質(zhì)控規(guī)則 起動累積和計算的閾值（起動累積和計算的閾值（k） 質(zhì)控限（質(zhì)控限（h） 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.

29、5s 5.1sCSss0 . 17 . 2CSss0 . 10 . 3CSss5 . 01 . 5累積和 (CUSUM) 質(zhì)控具體步驟 n與上述其它質(zhì)控方法一樣,首先得到測定均值和標(biāo)準(zhǔn)差(s) ;n確定起動累積和計算的閾值（k）和質(zhì)控限（h）; n確定質(zhì)控規(guī)則; n繪制質(zhì)控圖;n累積和(CUSUM)計算;n如有失控，則采取措施予以糾正，再開始上述累積和計算。 累積和 (CUSUM) 質(zhì)控圖“即刻法”質(zhì)控方法 n“即刻法”質(zhì)控方法的實質(zhì)是一種統(tǒng)計學(xué)方法,即Crubs異常值取舍法 ；n只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。 “即刻法”質(zhì)控方法具體步驟 n將連續(xù)的質(zhì)控測定值按從小到大排列，

30、即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xn（x1為最小值，xn為最大值）； n計算均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(s);n按下述公式計算SI上限和SI下限值； SI上限=（x最大值 均值）/s SI下限=（均值 x最大值 ）/sn將SI上限和SI下限值與SI值表中的數(shù)值比較。 質(zhì)控結(jié)果的判斷 nSI上限和SI下限值均 n3s對應(yīng)的值時，說明該質(zhì)控測定值的變化已超出3s，屬“失控”。室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的評價 nIQC為一集體活動，除實際測定者外，還應(yīng)有另外一人對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)檢。n不能將IQC作為一個監(jiān)察方法，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一次測定未達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)以建設(shè)性的而非批評的方式去探查失控的原因。n除了將IQC數(shù)據(jù)作為日常質(zhì)控

31、外，還應(yīng)定期評價累積數(shù)據(jù)以監(jiān)測在測定操作中的長期變化趨勢。n評價應(yīng)定期進(jìn)行。弱陽性質(zhì)控樣本常見的失控原因 n核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留等。 n儀器的問題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。 n試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。 陰性質(zhì)控樣本的失控原因 n主要為擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”和/或臨床標(biāo)本的核酸提取過程中發(fā)生的標(biāo)本間的交叉 “污染”. 室內(nèi)質(zhì)控的局限性室內(nèi)質(zhì)控的局限性nIQC可確保每次測定與確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一致，但不能保證在單個的測定樣本中不出現(xiàn)誤差。比如

32、樣本鑒別錯誤、樣本吸取錯誤、結(jié)果記錄錯誤等。此類誤差的發(fā)生率在不同的實驗室有所不同，一般要求小于0.1%，且應(yīng)均勻地分布于測定前、測定中和測定后的不同階段。影響臨床基因擴(kuò)增檢驗結(jié)果的最關(guān)鍵因素n產(chǎn)物“污染”（Carry-over)n測定人員的操作：標(biāo)本混淆；貼錯標(biāo)簽、核酸提取等n試劑避免基因擴(kuò)增檢驗假陽性結(jié)果的措施n嚴(yán)格的實驗室分區(qū)；n使用帶“濾心”的吸頭；n設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時處理）；n使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑；n臨床“假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不宜做PCR檢測。避免基因擴(kuò)增檢驗假陰性結(jié)果的措施n避免由于來自于標(biāo)本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標(biāo)本