臨床基因擴增檢驗的質量保證（共97）.ppt

1、臨床基因擴增檢驗的臨床基因擴增檢驗的質量保證質量保證定定 義義n質量保證質量保證(Quality Assurance,QA)(Quality Assurance,QA) 為一產品或服務滿足特定質量要求提供充分可信性所必要的有計劃的和系統(tǒng)的措施。 n室內質量控制（室內質量控制（Internal Quality Control,IQC)Internal Quality Control,IQC) 由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實驗室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實驗室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項工作。

2、定定 義義n室間質量評價室間質量評價 （External Quality Assessment, External Quality Assessment, EQAEQA） 為客觀比較一實驗室的測定結果與靶值的差異，由外單位機構，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實驗室的結果，發(fā)現誤差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性。這是對實驗室操作和實驗方法的回顧性評價，而不是用來決定在實時的測定結果的可接受性。當EQA用來為執(zhí)業(yè)許可或實驗室認證的目的而評價實驗室操作時，常描述為實驗室能力比對檢驗（Proficiency testing, PT）。在以前的文獻中，EQA常描述室間質量控制。定定 義義

3、n準確度準確度 (Accuracy)(Accuracy) 待測物的測定值與其真值的一致性程度。準確度不能直接以數值表示，通常以不準確度來間接衡量。對一分析物重復多次測定，所得均值與其真值或參考靶值之間的差異亦即偏差即為測定的不準確度。 n偏差偏差 (Bias) (Bias) 待測物的測定值與一可接受參考值之間的差異。定定 義義n精密度精密度(Precision) 在一定條件下所獲得的獨立的測定結果之間的一致性程度。與準確度一樣，精密度同樣也是以不精密度來間接表示。測定不精密度的主要來源是隨機誤差，以標準差（SD）和/或變異系數（CV）具體表示。SD或CV越大，表示重復測定的離散度越大，精密度越

4、差，反之則越好。 定定 義義n批批 (Run) 在相同條件下所獲得的一組測定。 n均值（均值（Mean） n標準差（標準差（Standard deviation, SD或或s） n變異系數（變異系數（Coefficient of variation, CV） 定定 義義n正態(tài)分布正態(tài)分布(Gaussian distribution) 當一質控物用同一方法在不同的時間重復多次測定，當測定數據足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應測定值的個數，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“鐘形”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。 定 義n正態(tài)分布的基本統(tǒng)計學含義可用

5、均數（）、標準差（s）和概率來說明。臨床基因擴增檢驗實驗室臨床基因擴增檢驗實驗室常規(guī)測定步驟常規(guī)測定步驟n標本收集：標本收集：選擇測定項目、標本收集和保存。n實驗室測定：實驗室測定：標本接收、貼標簽、樣本處理、核酸擴增、產物檢測、測定的有效性和臨床診療價值。n報告和解釋：報告和解釋：結果發(fā)出、結果解釋和臨床管理。質量保證、室內質控和室間質評之間的關系質量保證、室內質控和室間質評之間的關系臨床基因擴增檢驗實驗室臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法管理暫行辦法n總則n實驗室規(guī)劃、設置和審批n實驗室管理n監(jiān)督管理n附則臨床基因擴增檢驗實驗室的設置臨床基因擴增檢驗實驗室的設置n臨床標本的接收n基因擴增檢

6、驗實驗室設置的一般要求 n基因擴增檢驗實驗室工作流程 臨床標本的接收 n通常的工作流程：標本采集 血清分離 編號 保存或檢測n應在四個測定區(qū)域之外的地方或區(qū)域內接收 n接收的標本應收集在原始容器中n在核酸提取時帶入至標本制備區(qū)臨床基因擴增實驗室設置的一般原則臨床基因擴增實驗室設置的一般原則n各區(qū)獨立n注意風向n因地制宜n方便工作“十六字方針十六字方針”基因擴增檢驗實驗室工作流程基因擴增檢驗實驗室工作流程n進入各個工作區(qū)必須遵循嚴格的單一方向順序。臨床標本收集、運送、保存及其質量控制 n標本收集 n標本保存n標本運送 標本收集n標本采集時間對擴增檢測結果的影響 n標本采集部位的準備 n標本的類型

7、和采集量 n采樣質量的評價 n采樣及運輸容器 n標本采集中的防污染 標本采集時間對擴增檢測結果的影響n在疾病發(fā)展過程中，標本采集過早或過晚都可能會給出假陰性結果。 標本采集部位的準備n標本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其它雜物,但應適度,過度清潔消毒有可能會去掉或破壞靶微生物,故標本采集部位的準備應由訓練有素的人員進行。標本的類型和采集量n標本的類型和采集量應根據所測病原體而定。一般來說，如果標本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測。n對于定量測定來說，對標本的收集要求更為精確。采樣質量的評價n血清(漿)標本:溶血、脂血等；n分泌物、痰：評價內容包括細胞組

8、成，所需類型細胞的數量和核酸總量。 評價方法：包括肉眼觀察,顯微鏡下觀察和化學分析等。 采樣及運輸容器 n標本的采集材料如棉簽應為一次性使用；n運輸容器亦應為密閉的一次性裝置；n采樣所用的防腐劑、抗凝劑及相關試劑材料不應對核酸擴增及檢測過程造成干擾。 標本采集中的防污染 n 采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)、表皮細胞、痰液等；n 如使用玻璃器皿，必須經高壓滅菌，以使可能存在的RNAase失活。標本保存 n靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要。 n使用GITC作為穩(wěn)定劑保存標本，標本可在室溫下穩(wěn)定約7天。 標本保存n臨床體液標

9、本長期保存應在-70下。 n如為提取核酸后用于DNA擴增分析的樣本，可于10 mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)緩沖液中4 下保存。 n用于RNA擴增分析的樣本，則應于上述緩沖液中-80或液氮下保存。 n核酸的乙醇沉淀物則可于-20下保存。 標本運送 n樣本一經采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。n樣本中如加入了適當的穩(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運送或郵寄。n實驗室應根據待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應的規(guī)定。臨床基因擴增檢驗的室內質量控制臨床基因擴增檢驗的室內質量控制n

10、測定前的質量控制n核酸樣本的制備及其質量控制 n統(tǒng)計學質量控制n質量控制的評價測定前質量控制測定前質量控制n實驗室設施、儀器設備及管理n理想的試劑和操作方法 n人員培訓 實驗室設施、儀器設備及管理n臨床基因擴增檢驗實驗室應有充分合理的空間、良好的照明和空調設備 ；n實驗室儀器設備應保養(yǎng)良好，實驗用品要達到相應的要求。加樣器的校準？帶濾塞吸頭的使用及質檢？離心機？熱循環(huán)儀？水浴箱和/或恒溫干浴儀？酶標儀和洗板機？基因擴增儀器設備的質控基因擴增儀器設備的質控儀器設備儀器設備質控方法質控方法 頻頻 度度失控標準失控標準擴增儀儀器校驗實驗當儀器移動時實驗失敗熱電偶監(jiān)測溫度擴增功能檢測每月一次每 4 個

11、月一次 如靶溫度或溫度差異超出允許范圍待測孔未出現擴增，檢測溫度程序打印每次測定時打印程序不對加樣器校準每年 2 次不符合要求水浴箱溫度檢測每次實驗不符合要求酶標儀預防性維護及校準每年 2 次不符合要求帶濾塞吸頭的使用及質檢n首先制備一個含12%甘油及色素（如甲基橙）的水溶液，如果吸頭的最大體積為100l，則將加樣器吸取體積調至110120l，再套上吸頭后吸取上述有色液體。如果吸頭質量好，則有色液體不應出現在濾塞之上，否則說明濾塞不嚴。 帶濾塞吸頭的使用及質檢n用實驗來檢驗帶濾塞吸頭的質量：先純化制備數份強陽性和數份陰性核酸標本，然后將加樣器吸取量設至擴增加樣所需的體積，使用待評價帶濾塞吸頭對

12、一份強陽性樣本來回吸取10次（模擬10份陽性樣本的吸?。?，將最后一次的吸取液加至一含擴增反應液的管中，之后，換一個新吸頭，連續(xù)吸取10份陰性樣本分別至10個擴增反應管中，此過程重復35次，最后對每一管按所用試劑方法進行擴增檢測。強陽性樣本應為強陽性，陽性弱或出現陰性則說明吸頭可能含有擴增抑制物。所有陰性樣本應為陰性，出現陽性則表明吸頭不能有效地防止氣溶膠對加樣器的污染。 擴增儀孔間溫度的重復性和均一性的檢測方法n一是使用一種熱電偶探針、微伏轉換器和自動圖示記錄儀組成擴增加熱模塊孔內溫度監(jiān)測記錄系統(tǒng)，當孔間溫度變異超出1時，其可測出來。n具體做法是將裝有TE緩沖液并上加石蠟油的擴增反應管放置于擴

13、增儀各孔中，熱電偶探針透過擴增反應管蓋插至緩沖液中，然后按程序進行一個常規(guī)的PCR擴增，加熱模塊如為96孔，則至少要測定12孔不同位置孔內的溫度，在整個擴增過程中，可移動熱電偶探針至上述不同孔中監(jiān)測溫度，但每一孔內溫度監(jiān)測至少要有一個擴增周期。 擴增儀孔間溫度的重復性和均一性的檢測方法n第二種方法并非直接測定孔內溫度，而是通過擴增功能來間接獲知孔間的均一性，即將加有一已知的含一定濃度的陽性質控樣本的擴增反應管置于擴增儀各孔中按常規(guī)進行擴增檢測，觀察結果的一致性程度，如果有某一個或幾個孔結果有問題，則應確定這一個或幾個孔是否會重復性地得到假陰性結果，如果是，則表明相應孔的熱傳導有損壞。 實驗室的

14、日常工作管理實驗室的日常工作管理 工工 作作 項項 目目 核核 查查 點點水浴箱、微量恒溫器（加熱模塊） 校準及記錄 溫度10%次氯酸鈉溶液 新鮮配制生物安全柜 先起動運行30分鐘后再開始工作 室內質控 弱陽性質控（定性） 有 低、中、高濃度質控（定量） 有 陰性質控：原樣本 有 經歷提取過程的空管 有 僅含擴增反應混合液管 有n實驗臺面 使用后用10%次氯酸鈉溶液消毒，n 再用70%乙醇清潔 紫外照射n加樣器、離心機 使用后用10%次氯酸鈉溶液消毒，n 再用70%乙醇清潔n實驗室各區(qū) 遵循單一工作流向n 紫外照射理想的試劑和操作方法 n試劑盒的質檢n定量測定的精密度是測定組成步驟的變異和的平

15、方根(SD)= 上式中SDa、SDb、SDc是步驟a、b、c等（例如試劑準備、標本采集、核酸提取、擴增和產物檢測等）的標準差； SDSDSDabc222.理想的試劑和操作方法n改善測定精密度的措施必須首先著重在最不精密的步驟上，應對試劑準備、標本收集、核酸提取、測定方法和儀器操作寫出“標準操作程序”(SOP) 實驗室質量管理體系的建立n質量手冊n質量體系程序文件n標準操作程序質量管理的內涵n寫你所做的n做你所寫的n記錄你已做的怎樣編寫SOP？人員培訓 n臨床基因擴增檢驗的操作主要是標本處理中的核酸提取步驟，這其中所涉及的又主要是加樣器的使用，盡管操作簡單，但由于均為微量操作，要獲得穩(wěn)定可靠的測

16、定結果，操作人員需要一定的專業(yè)技術知識和經驗，要盡可能做到知其然又知其所以然。 核酸樣本的制備、擴增檢測核酸樣本的制備、擴增檢測及其質量控制及其質量控制n一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理n核酸的分離純化n靶核酸提取的質量 n臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質 n核酸樣本制備及擴增檢測的質控 n產物檢測的質控 一般核酸提取試劑促使靶核酸從細胞內釋出的原理n靶核酸可以與宿主細胞整合，核內游離及胞漿內各種構形存在于細胞內，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細菌、病毒、原蟲或真菌細胞內，如果上述細胞破裂,則靶核酸亦可存在于細胞外。 n一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂

17、解細胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結合于核酸的蛋白質，從而將靶核酸從細胞內釋放出來。核酸的分離純化 n核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質去除。 n經典方法n硅吸附法n對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。 臨床標本及核酸提取中可能存在的抑制和干擾物質 n臨床標本中：臨床標本中：血清或血漿中的血紅素及其代謝產物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。n核酸提取中：核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機溶劑 。

18、 對臨床標本中可能存在的抑制/干擾物的質控措施n質控措施： 采用內質控（internal control, IC）（通常稱為內標）的方法 n內標有兩種,即競爭性的和非競爭性的內標。 n內標設置的必要性？統(tǒng)計學質量控制統(tǒng)計學質量控制 n理想的室內質控樣本的條件n測定中質控樣本的設置、數量及排列順序 n統(tǒng)計學質控的特點 n統(tǒng)計質控方法理想的室內質控樣本的條件n基質與待測樣本一致；n所含待測物濃度接近試驗的決定性水平；n穩(wěn)定；n靶值或預期結果已定；n無已知的生物傳染危險性；n單批可大量獲得；n價廉測定中質控樣本的設置、數量及排列順序n每次檢測究竟使用幾個質控樣本并排在臨床標本中的哪個位置最為適宜？從

19、理論上說，為最大可能地檢出實驗的隨機和系統(tǒng)誤差，應每隔幾份臨床標本插入1份質控樣本，但考慮國內目前的實際情況及成本效益，一般來說，如果臨床基因擴增檢驗的標本量不是特別大，定性測定有一份接近cut-off的弱陽性和一份陰性質控樣本應可以滿足要求。而定量測定則要根據試驗的測定范圍，采用高、中、低三種濃度的質控樣本。至于在測定中的排列順序，可排于標準品或校準品之后，臨床樣本之前。 臨床基因擴增檢驗室內質控的臨床基因擴增檢驗室內質控的獨特性獨特性n即監(jiān)測污染發(fā)生的陰性質控的設置。 n應該包括1份陰性原血清樣本、1份在標本核酸提取過程中帶入的一個空管和僅含擴增反應混合液的管。 陰性原血清質控樣本的功能

20、n監(jiān)測實驗室的以前擴增產物的污染； n由實驗操作所致的標本間的交叉污染；n擴增反應試劑的污染。 在標本核酸提取過程中帶入的一個空管的功能n基本功能與陰性原血清質控樣本相同，但不同的是，其基質為水，不含陰性原血清質控樣本中可能有的擴增抑制物，因而對污染的反映更為靈敏；n不能取代原血清陰性樣本。僅含擴增反應混合液的管的功能n監(jiān)測擴增試劑是否發(fā)生污染，具有較強的污染鑒別性。n如想鑒別實驗室是否發(fā)生污染，可將一個或多個空管打開靜置于標本制備區(qū)3060分鐘，然后加入擴增反應混合液同時以水替代核酸樣本擴增，如為陽性，而上述僅含擴增反應混合液的管為陰性，則說明實驗室以前擴增產物的存在。 統(tǒng)計學質控的特點 n

21、檢驗誤差有兩類，一是系統(tǒng)誤差，一是隨機誤差。n系統(tǒng)誤差通常表現為質控物測定均值的漂移，是由操作者所使用的儀器設備、試劑、標準品或校準物出現問題而造成的，這種誤差可以通過前述的措施方法加以控制，是可以排除的。n隨機誤差則表現為測定SD的增大，主要是由實驗操作人員的操作等隨機因素所致，其出現難以完全避免和控制。統(tǒng)計學質控的功能n統(tǒng)計學質控的功能就是發(fā)現誤差的產生及分析誤差產生的原因，采取措施予以避免。n開展統(tǒng)計質量控制前，應將可以控制的誤差產生因素盡可能地加以控制，這不但是做好室內質控的前提，也是保證常規(guī)檢驗工作質量的先決條件。 統(tǒng)計質控方法 n基線測定n質控規(guī)則的表達方式及定義 nLevey-J

22、ennings質控圖方法 nLevey-Jennings質控圖結合Westgard多規(guī)則質控方法 n累積和 (CUSUM) 質控方法 n“即刻法”質控方法 基線測定n最佳條件下的變異（Optimal conditions variance, OCV）和常規(guī)條件下的變異（Routine conditions variance, RCV）； n當RCV與OCV接近，或小于2 OCV時，則RCV是可以接受的。以上為批間變異。n批內變異的測定；n室內質控物的測定準確度的評價。 臨床基因擴增檢驗臨床基因擴增檢驗IQCIQC統(tǒng)計統(tǒng)計計算問題計算問題n可使用質控樣本擴增后的拷貝數/ml或IU/ml來進行統(tǒng)計

23、計算，也可用其對數值進行。n由于基因擴增結果的原始數據通常很大，故使用其對數值來進行質控統(tǒng)計分析可能要更為方便一些。 質控規(guī)則的表達方式及定義 n質控規(guī)則的表達方式 n質控規(guī)則的功能 n常用質控規(guī)則的符號及定義 質控規(guī)則的表達方式n通常質控規(guī)則以符號AL來表示，其中A為質控測定中超出質量控制限的測定值的個數，L為控制限，通常用均值或均值13SD來表示。 n當質控測定值超出控制限L時，即可將該批測定判為失控。 n常用的13S質控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質控測定值中，如果有一個測定值超出均值3s范圍，即可將該批測定判為失控。 質控規(guī)則的功能 n簡

24、單地說就是用于判斷測定批的失控還是在控 。n當整個質控過程中使用同一個質控物時，可用來判斷單個或多個測定批內該質控物的測定值是否失控； n當整個質控過程中使用兩個或兩個以上的不同的質控物時，可用來判斷同一或多個測定批內的兩個或兩個以上的質控物的測定值是否失控。 常用質控規(guī)則的符號及定義 符符 號號 定定 義義n12S 一個質控測定值超出2s控制限。n13S 一個質控測定值超出3s控制限。n22S 兩個連續(xù)的質控測定值同時超出+2s或2s控制限。nR4S 同一批測定中，兩個不同濃度質控物的測定值之間的 差值超出4s控制限。n31S 三個連續(xù)的質控測定值同時超出+1s或1s控制限。n41S 四個連

25、續(xù)的質控測定值同時超出+1s或1s控制限。n7X 七個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（）的同一側。n7T 七個連續(xù)的質控測定值呈現一個向上或向下的趨勢變化。n8X 八個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（）的同一側。n9X 九個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（）的同一側。n10X 十個連續(xù)的質控測定值同時處于均值（）的同一側。Levey-Jennings質控圖方法 n也稱Shewhart質控圖，是由美國的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產品的質量控制。后來（二十世紀五十年代初），Levey-Jennings將其引入臨床檢驗的質量控制 。經Henry和Segalove的改良，即為目前常用的

26、Levey-Jennings質控圖。質控圖質控圖質控圖質控圖Levey-Jennings質控圖基本的統(tǒng)計學含義n穩(wěn)定條件下，在20個IQC結果中不應有多于1個結果超過2SD（95.5%可信限）限度；在1000個測定結果中超過3SD（99.7%可信限）的結果不多于3個。n如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 質控圖的記錄的其它方面nIQC數據是用來控制實際過程的，因此其表達應清楚和直接，在質控圖上記錄結果時，應同時記錄測定的詳細情況，如日期、試劑、質控物批號和含量及測定者姓名等。 Levey-Jennings質控圖方法的特點n優(yōu)點是簡單明了；n缺點： 以2s為失控限，假失控的概率太高，通常

27、不能接受； 以3s為失控限，假失控的概率低，但誤差檢出能力不強。 Levey-Jennings質控圖結合Westgard多規(guī)則質控方法 nWestgard多規(guī)則質控方法即是將前述的多個質控規(guī)則同時應用進行質控判斷的方法。最初常用的有六個質控規(guī)則，即12S、13S、22S、R4S、41S和10X，其中12S規(guī)則作為告警規(guī)則，當出現質控測定值違反12S規(guī)則時，則起動其它規(guī)則進行判斷。只有當使用所有質控規(guī)則判斷確定某測定批在控時才說明該測定批在控，只要上述質控規(guī)則之一判斷測定批失控則即認為該測定批失控。通常上述規(guī)則中，13S和R4S規(guī)則反映的是隨機誤差，而22S、41S和10X反映的是系統(tǒng)誤差，系統(tǒng)

28、誤差超出一定的程度，也可從13S和R4S規(guī)則反映出來。 Westgard多規(guī)則質控方法的特點n其是在Levey-Jennings質控圖方法的基礎上產生的，自然也就具有Levey-Jennings質控圖方法的優(yōu)點，可通過相似的質控圖來進行分析； n假失控和假告警概率低； n誤差檢出能力增強 。累積和 (CUSUM) 質控方法n累積和 (CUSUM) 質控方法于1977年由Westgard等提出,對系統(tǒng)誤差有較好的測出能力。 常用的累積和 (CUSUM) 質控規(guī)則 質控規(guī)則質控規(guī)則 起動累積和計算的閾值（起動累積和計算的閾值（k） 質控限（質控限（h） 1.0s 2.7s 1.0s 3.0s 0.

29、5s 5.1sCSss0 . 17 . 2CSss0 . 10 . 3CSss5 . 01 . 5累積和 (CUSUM) 質控具體步驟 n與上述其它質控方法一樣,首先得到測定均值和標準差(s) ;n確定起動累積和計算的閾值（k）和質控限（h）; n確定質控規(guī)則; n繪制質控圖;n累積和(CUSUM)計算;n如有失控，則采取措施予以糾正，再開始上述累積和計算。 累積和 (CUSUM) 質控圖“即刻法”質控方法 n“即刻法”質控方法的實質是一種統(tǒng)計學方法,即Crubs異常值取舍法 ；n只要有3個以上的數據即可決定是否有異常值的存在。 “即刻法”質控方法具體步驟 n將連續(xù)的質控測定值按從小到大排列，

30、即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xn（x1為最小值，xn為最大值）； n計算均值()和標準差(s);n按下述公式計算SI上限和SI下限值； SI上限=（x最大值 均值）/s SI下限=（均值 x最大值 ）/sn將SI上限和SI下限值與SI值表中的數值比較。 質控結果的判斷 nSI上限和SI下限值均 n3s對應的值時，說明該質控測定值的變化已超出3s，屬“失控”。室內質控數據的評價 nIQC為一集體活動，除實際測定者外，還應有另外一人對測定數據進行質檢。n不能將IQC作為一個監(jiān)察方法，當發(fā)現一次測定未達到質量標準時，應以建設性的而非批評的方式去探查失控的原因。n除了將IQC數據作為日常質控

31、外，還應定期評價累積數據以監(jiān)測在測定操作中的長期變化趨勢。n評價應定期進行。弱陽性質控樣本常見的失控原因 n核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。 n儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內溫度與所示溫度的不一致性等。 n試劑的問題。如Taq酶和/或逆轉錄酶的失活、探針的純度及標記效率和核酸提取試劑的效率等。 陰性質控樣本的失控原因 n主要為擴增產物的“污染”和/或臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉 “污染”. 室內質控的局限性室內質控的局限性nIQC可確保每次測定與確定的質量標準一致，但不能保證在單個的測定樣本中不出現誤差。比如

32、樣本鑒別錯誤、樣本吸取錯誤、結果記錄錯誤等。此類誤差的發(fā)生率在不同的實驗室有所不同，一般要求小于0.1%，且應均勻地分布于測定前、測定中和測定后的不同階段。影響臨床基因擴增檢驗結果的最關鍵因素n產物“污染”（Carry-over)n測定人員的操作：標本混淆；貼錯標簽、核酸提取等n試劑避免基因擴增檢驗假陽性結果的措施n嚴格的實驗室分區(qū)；n使用帶“濾心”的吸頭；n設立“陰性”質控（與標本同時處理）；n使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑；n臨床“假陽性”問題：病原微生物如結核桿菌經藥物治療后已死亡，但PCR仍可為陽性，故治療結束后至少兩周內不宜做PCR檢測。避免基因擴增檢驗假陰性結果的措施n避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標本