二至丸對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞作用的活性組分構(gòu)件研究(一)

1、二至丸對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞作用的活性組分構(gòu)件研究(一)    【關(guān)鍵詞】 二至丸；,中藥復(fù)方組合化學(xué)；,血清藥理學(xué)；,細胞藥理學(xué)；,免疫調(diào)節(jié)；,活性組分構(gòu)件摘要：目的探討二至丸免疫調(diào)節(jié)作用的活性組分構(gòu)件。方法運用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細胞藥理學(xué)方法，觀察女貞子、墨旱蓮系列提取物及其組合物對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞的作用。結(jié)果女貞子乙醇提取物、墨旱蓮乙醇提取物、女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）具有較強的絲裂原樣作用，可以促進小鼠外周血、脾淋巴細胞增殖和腹腔巨噬細胞的吞噬功能。結(jié)論二至丸對小鼠淋巴細胞和巨噬細胞作用的活性組分構(gòu)件是女貞子乙

2、醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）。關(guān)鍵詞：二至丸； 中藥復(fù)方組合化學(xué)； 血清藥理學(xué)； 細胞藥理學(xué)； 免疫調(diào)節(jié)； 活性組分構(gòu)件Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in MiceAbstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted fro

3、m Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water,alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions, blood serum pharmacology and cytopharma

4、cology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC),the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (11) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocy

5、teses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (11).Key words：Erzhi Pill; Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmac

6、ology; Immunoregulation; Active components二至丸是中醫(yī)臨床的經(jīng)典名方，醫(yī)便（明?王三才）記載：“二至丸，清上補下第一方，價廉而功極大。”1它由女貞子、墨旱蓮各等份組成，組方簡單，藥性平和，功效確切，作為補益肝腎良藥。數(shù)百年來，倍受歷代醫(yī)家推崇?，F(xiàn)代還用于衰老、神經(jīng)衰弱、疲勞綜合癥及更年期綜合癥等疾病的治療。中成藥二至丸先后被歷版中國藥典（部）和“第二批國家非處方藥目錄”收載。一些學(xué)者相繼從現(xiàn)代藥理學(xué)角度對其進行了研究，證明二至丸對機體免疫功能具有多方面的調(diào)節(jié)作用，但研究中多以水煎劑、女貞子多糖及方中單味藥提取物給藥25。由于目前對其復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作

7、用機理還缺乏系統(tǒng)規(guī)范的研究，致使制劑工藝粗放，日用劑量過大6，劑型落后，不符合現(xiàn)代中藥要求，影響了它的公眾認(rèn)知度。作者在遵從復(fù)方配伍規(guī)律的前提下，以活性評價為導(dǎo)向，運用中藥復(fù)方組合化學(xué)、血清藥理學(xué)和細胞藥理學(xué)方法，對其免疫調(diào)節(jié)作用的有效組分構(gòu)件進行探討，以期進一步組成精簡方劑，從而為二至丸的二次開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)實驗數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物普通級 KM種小鼠，8周齡，體重2224 g，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究室（許可證號：310101001）。1.1.2 試劑RPMIl640培養(yǎng)液 (Gibco產(chǎn)品)、無酚紅 RPMIl640培養(yǎng)液 (Sigma產(chǎn)品)，配制

8、時加青霉素1×105 IU/L、鏈霉素100 mg/L，過濾，使用時加體積分?jǐn)?shù)為15% 的胎牛血清（FBS，超級，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，F(xiàn)luka產(chǎn)品；LPS(脂多糖)，Sigma產(chǎn)品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 m過濾，分裝，20凍存，臨用前稀釋。MTT(噻唑藍)，Sigma產(chǎn)品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，過濾，4避光保存。硫代羥基乙酸鈉 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所產(chǎn)品。其余試劑均為市售分析純。1.1.3 儀器Napco6lOO型CO2培養(yǎng)箱，美國。96孔板，Nunclon，丹麥。微量可

9、調(diào)加樣器，Labsystems，芬蘭。多頭細胞收集儀，ZT型，上海醫(yī)科大學(xué)。550型酶標(biāo)儀，BioRad，美國。恒溫水浴搖床，Yamato，日本。1.1.4 藥物女貞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱蓮 E clipta prostrata L.（EPL），購于重慶市中藥材公司，符合中國藥典2005年版部規(guī)定。1.2 方法1.2.1 女貞子、墨旱蓮提取物的制備取女貞子或墨旱蓮藥材，粉碎，過20目篩，依次用不同溶劑，10倍量提取2次，2 h/次，過濾，合并提取液，回收溶劑，制備女貞子或墨旱蓮的石油醚提取物（簡稱 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（簡稱 NYSY

10、Z或 HYSYZ）、乙醇提取物（簡稱 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（簡稱 NSJZ或 HSJZ）。臨用前，分別用生理鹽水（NS）制備藥液，必要時可加少量 Tween80助溶，濃度相當(dāng)于1 mg生藥/ml。1.2.2 含藥血清的制備7小鼠按體重隨機分組，每組10只，雌、雄各半。ig給藥，給藥2次，間隔2 h。ig容積10 ml/kg，空白血清組ig NS，各含藥血清組 ig相應(yīng)組分6.7 g生藥 /kg（組合組分13.4 g生藥 /kg）。末次給藥1 h，深度麻醉，心臟無菌采血，3000 r/min離心10 min，收集血清。同組分血清混合，56水浴30 min，-20凍存，臨用前4凍融。1

11、.2.3 細胞懸液的制備8小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），隨即脫頸椎處死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同時無菌取脾。常規(guī)方法制備細胞懸液，PBS液洗滌，離心，細胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液，調(diào)整濃度為2×106 cells/ml，臺盼蘭排除法檢查細胞存活率大于95%。1.2.4 淋巴細胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）實驗996孔細胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50l淋巴細胞懸液、20 l含藥血清和120 l RPMI164010%FBS培養(yǎng)液（對照組、刺激組分別用

12、20 l空白血清），混勻后預(yù)孵1 h，再加入10 l ConA或 LPS（終濃度為5 g/ml）刺激（對照組用10 l PBS），各設(shè)8個復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（Forma.USA）37培養(yǎng)48 h后，加入 MTT 10 l/孔（10 mg/ml）培養(yǎng)8 h，棄上清，加入 DMSO 100 l/孔，MTT結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀570 nm處測定A值。1.2.5 腹腔巨噬細胞（PM）吞噬活性實驗1096孔細胞培養(yǎng)板，各給藥組每孔加入50 l腹腔巨噬細胞懸液、20 l含藥血清和120 l無酚紅 RPMI164010% FBS培養(yǎng)液（對照組用20 l空白血清），各設(shè)8個復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱（F

13、orma.USA）37培養(yǎng)24 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加0.075%中性紅溶液100 l/孔，培養(yǎng)1 h，棄上清液，預(yù)溫的 PBS液洗3遍，加入細胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：無水乙醇）100 l/孔，室溫放置，過夜。次日，取上清液于酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀540 nm處測定A值。1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS11.0統(tǒng)計軟件包。運用單向方差分析（OneWay ANOVA），選用 Dunnett法進行組間顯著性分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示。2 結(jié)果2.1 女貞子或墨旱蓮提取物對小鼠 LP和PM活性的影響結(jié)果見表1。表1 女貞子或墨旱蓮提取物對小鼠 LP和PM活性的影響（略）與正常對照組比較

14、，1）P0.01，2) P0.05；與刺激劑組比較，3) P0.01，4) P0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖從表1可以看出，女貞子或墨旱蓮提取物對 ConA或 LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾淋巴細胞增殖、對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性均有較明顯的促進作用。強度順序依次為，NYCNYSYZNSJZNSYM；HYCHYSYZHSJZHSYM。提示，女貞子或墨旱蓮促進小鼠LP和PM活性作用最強的組分分別是 NYC或 HYC，即女貞子乙醇提取物或墨旱蓮乙醇提取物。表2 女貞子墨旱蓮提取物組合對小鼠 LP和PM活性的影響（略）與正常對照組比較，1) P0.01，2) P0.05；與刺激劑組比較，3) P

15、0.01，4) P0.05；刺激劑指刀豆蛋白 A或脂多糖2.2 女貞子墨旱蓮提取物組合對小鼠 LP和 PM活性的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，女貞子墨旱蓮不同提取物交叉組合后，對 ConA或 LPS誘導(dǎo)的小鼠外周血和脾淋巴細胞增殖、對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性均有較明顯的促進作用。強度順序依次為 NYC+HYCNYC+HYSYZHYC+NYSYZNYC+HSJZHYC+NSJZNYC+HSYMHYC+NSYM。提示，二至丸（女貞子和墨旱蓮的組合復(fù)方）促進小鼠LP和PM活性作用最強的組分構(gòu)件是NYC+HYC，即女貞子乙醇提取物和墨旱蓮乙醇提取物。3 討論免疫功能低下常常與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展密切

16、相關(guān)，已經(jīng)對人類社會構(gòu)成了巨大威脅。對于疾病、衰老或治療藥物引起的免疫功能低下，現(xiàn)代慣用生物制劑，如胸腺素、轉(zhuǎn)移因子、干擾素等，或化學(xué)制劑如左旋咪唑等，增強細胞免疫功能，但這些藥物容易引起發(fā)熱、嘔吐、粒細胞減少及肝腎功能異常等不良反應(yīng)，而中藥在這方面具有獨特的優(yōu)勢11。在人用疫苗佐劑相對缺乏、人們?nèi)找孀⒅馗纳粕|(zhì)量的今天，具有高活性免疫調(diào)節(jié)作用的中藥有效成分被認(rèn)為是理想的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑12。近年來通過臨床或?qū)嶒炑芯堪l(fā)現(xiàn)四君子湯、生脈散、六味地黃丸、當(dāng)歸補血湯、腎氣丸等補益方劑有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，二至丸在改善機體免疫功能方面療效顯著13。目前國內(nèi)對六味地黃丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究較為深

17、入，相繼研制成功了六味地黃口服液、膠囊、軟膠囊及滴丸等新劑型，取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，而對二至丸的相關(guān)研究卻極為薄弱。中藥復(fù)方本身的分子多樣性決定了其“有用分子”不明確，無用或誘發(fā)毒副作用的分子占絕大多數(shù)，從而表現(xiàn)出多成分、多途徑、多靶點的作用特點，這在客觀上增加了中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機理研究的難度。目前，關(guān)于其方法學(xué)研究，觀點和構(gòu)思較多，如三元設(shè)計方案、霰彈理論、血清藥理學(xué)及天然組合化學(xué)庫與多靶作用機理等14，對于實際工作具有一定的啟發(fā)和參考價值。作者在實際研究工作中發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方組合化學(xué)方法在中藥復(fù)方活性成分群研究中具有明顯的優(yōu)勢。該方法借鑒現(xiàn)代藥學(xué)組合化學(xué)研究方法，選擇能代表方劑主治病癥病理生理和治則的藥理學(xué)指標(biāo)，通過組分或單體成分的組合，采用排除篩選法，找出其活性最強的組份構(gòu)件，即確定“有用分子”組合的精簡方劑15。它與直接測定成分法不同，既可充分體現(xiàn)中藥復(fù)方多組分協(xié)同的特點，又可簡化中藥復(fù)方的分子多樣性，符合中醫(yī)藥整體觀和辯證分析的理論精髓。考慮到二至丸原方及其中成藥均采用方中藥味單獨處理后再組合制劑的工藝路線，故本文運用中藥復(fù)方組合化學(xué)方法進行活性部位研究。本研究結(jié)果表明，女貞子乙醇提取物+墨旱蓮乙醇提取物（11）是二至丸復(fù)方最強的免疫調(diào)節(jié)作用活性部位，能夠協(xié)同LPS、ConA等有