中藥抗流感病毒的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究

1、中藥抗流感病毒的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究的可行性分析報(bào)告一、立項(xiàng)依據(jù)1.目的及意義：流感是最常見的呼吸道病毒感染性疾病，發(fā)病率高，傳播迅速，中藥治療、預(yù)防流感有悠久的歷史。根據(jù)地域、氣候，臨床表現(xiàn)的差異，因時(shí)、因地、因人制宜，辨證施治是中藥治療流感的優(yōu)勢和精髓所在。嶺南地區(qū)氣候炎熱，潮濕多雨，病毒性上呼吸道感染以風(fēng)熱多見，其風(fēng)寒束表之象多輕且持續(xù)時(shí)間較短，但多兼有濕邪為患之象。以辛溫、辛涼、化濕三法合用所立之羌銀解熱湯，經(jīng)過4年的臨床觀察，取得了良好療效，該研究成果獲得了2009年度中山市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。本課題以該方為基礎(chǔ)，深入研究中藥對(duì)機(jī)體抗流感病毒的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以及病毒清除能力，進(jìn)一步闡明中藥抗

2、流感病毒的作用。2.研究現(xiàn)狀： 流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬，是一種非常容易發(fā)生變異和基因重配的病毒，每隔10-13年就會(huì)發(fā)生大變異，引起大流行1。由于每次變異對(duì)機(jī)體來說都是一種新病毒，從而造成人類對(duì)每一次的流感爆發(fā)都缺乏免疫力，因此普遍易感并不斷擴(kuò)散。流感病毒危害很大，每年約有50-100萬人會(huì)死于流感病毒感染，因此抗流感藥物的開發(fā)和研究也就顯得非常重要2。 目前，國際上認(rèn)可的抗流感藥物主要包括：M2離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑。M2離子通道阻滯劑是通過組織病毒脫衣殼及其核酸釋放，從而起到抑制病毒的復(fù)制和增殖的。臨床常用的離子通道阻滯劑包括金剛烷胺和金剛乙胺，但二者局限于抗流感A型病毒

3、，而且具有明顯的副作用3-4。加上在近年的幾次人流感大爆發(fā)中，發(fā)現(xiàn)病毒已對(duì)金剛烷胺和金剛乙胺耐藥，因此，M2離子通道抑制劑抗流感作用已受到普遍的質(zhì)疑。神經(jīng)氨酸酶抑制劑是針對(duì)流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶位點(diǎn)，選擇性抑制流感病毒復(fù)制而起效的。因?yàn)椴《局械纳窠?jīng)氨酸酶位點(diǎn)相對(duì)穩(wěn)定，不會(huì)因?yàn)椴《咀儺愔甑某霈F(xiàn)而改變結(jié)構(gòu)及功能，因此作用于該位點(diǎn)的藥物不容易出現(xiàn)耐藥情況。目前研究比較深入和常用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑包括奧司他韋（達(dá)菲）和扎那米韋5。實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察發(fā)現(xiàn)，這兩種藥物對(duì)治療甲型流感均有顯著效果6-9。遺憾的是，新近研究卻發(fā)現(xiàn)，流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑同樣存在“耐藥性”問題。有報(bào)道指出，在16%的接受奧司

4、他韋的人甲型流感中存在該種變異株10，其耐藥機(jī)理可能是與神經(jīng)氨酸苷酶單一氨基酸被替代所致。病毒變異所引出的耐藥性問題已成為現(xiàn)有西藥抗流感的一道“障礙”，同時(shí)也成為新藥開發(fā)的重點(diǎn)所在。由于西藥的機(jī)構(gòu)單一，作用位點(diǎn)恒定，因此增加了其產(chǎn)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，因此，研究者不斷進(jìn)行研究，試圖從具有多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)的中草藥中尋求有效地抗流感藥物。流感一病在古籍上雖無記載，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)、發(fā)病特點(diǎn)以及具有極強(qiáng)傳染性等，應(yīng)屬祖國醫(yī)學(xué)時(shí)行感冒和風(fēng)溫范疇，起病多由熱寒疫毒侵入人體所致11，因此治療上也已疏風(fēng)祛邪，清熱解毒為主。但隨著中醫(yī)藥抗流感研究的不斷深入，近年抗流感中藥的篩選已不再局限于外感藥和清熱解毒藥范圍

5、，而是嘗試從各類不同主治功效的藥物中篩選有效的抗流感藥物，并獲得了不少喜人的成果12-13。與現(xiàn)行抗流感西藥單一的抗病毒作用不同，中藥的作用包括兩個(gè)方面。一方面能通過直 接阻斷病毒繁殖過程中吸附、穿入、復(fù)制、成熟任一環(huán)節(jié)，從而起到抗病毒的作用，另一方面能通過對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)控，起到抑制病毒的目的。其中，中藥對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，正是其抗流感作用方面的優(yōu)勢所在。 最近更有研究發(fā)現(xiàn)，流感藥物的耐藥往往是發(fā)生在免疫系統(tǒng)低下的患者身上14，因此，對(duì)流感患者機(jī)體免疫的調(diào)控對(duì)于藥物抗流感作用來說，顯得尤為重要。 羌銀解熱湯是在總結(jié)歷代醫(yī)家經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合我院專家多年臨床經(jīng)驗(yàn)所創(chuàng)立的防治流感方藥。 在過

6、去的實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察當(dāng)中，我們發(fā)現(xiàn)，羌銀解熱湯具有確切的抗流感作用15-18?；谶@一研究成果，本課題旨在利用免疫抑制小鼠建立的流感模型為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，從體液免疫及細(xì)胞免疫兩個(gè)方面，探討羌銀解熱湯對(duì)流感染病機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的作用，從而為完善羌銀解熱湯抗流感的相關(guān)研究，以及該方進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。參考文獻(xiàn)： 1 Fraser C, Donneuy CA, Cauchernez S, et al. Pandemic potential of a atrain of influenza A(H1N1):early findingsJ. Science, 2009, 324:1557-1561.

7、2 劉彥明,肖洪廣,鄭君德.流感病毒的致病機(jī)理研究進(jìn)展J.中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào), 2009,23(3):183-185. 3 Colman PM. Zanamivir:An influenza virus neuraminidase inhibitor. Expert Review of Anti-Infective Therapy,2005,3:191-199. 4 Yin L, Jiang JD. Progress in anti-influenza drugs. Chin New Drugs J, 2004, 13:685-687. 5 張博,付杰,周永達(dá),等.流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的研究

8、進(jìn)展J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009,21:253-257. 6 Leneva LA, Roberts N, Govorkova EA, et al. The neuraminidase inhibitor GS4104 (oseltamivir phosphate) isefficacious against A/Hong Kong/156/97 (H5N1) and A/Hong Kong/1074/99 (H9N2) influenza viruses. Antiviral Res, 2000,48:101-115. 7 Govorkova EA, Leneva IA, Goloube

9、va OG, et al. Comparison of efficac -ies of RWJ-270201, zanamivir, and oseltamivir against H5N1, H9N1, and other avian influenza viruses. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45:2723-2732. 8 Gubareva LV, McCullers JA, Bethell RC, et al. Characterization of influenza A/Hong Kong/156/97( H5N1 ) virus in

10、a mouse model and protect -ive effect of zanamivir on H5N1 infection in mice. J Infect Dis, 1998,178:1592-1596. 9 Leneva IA, Goloubeva O, Fenton RJ, et al. Efficacy of zanamivir against avian influenza A viruses that possess genes encoding H5N1 internal proteins and are pathogenic in mammals. Antimi

11、crob Agents Chemother, 2001,45:1216-1224. 10 Ward P, Small I, Smith J, et al. Oseltamivir(Tamiflu) and its potential for use in the event of an inflenza pandemic. J Antimicrob Chemother, 2005,55:i5-i21.11 段艷菊, 孔繁智. 中藥抗流感病毒作用機(jī)理的研究概況J. 浙江中醫(yī)雜志, 2009,44(8):615-617. 12 張薇, 盧芳國, 周興, 等. 單位中藥抗流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展J.

12、中國實(shí)用醫(yī)藥, 2007,2(2):64-65. 13 周香意, 袁長津, 盧芳國. 中藥復(fù)方抗流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展J. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2008,14(4):79-81. 14 McCullers JA. The clinical need for new antiviral drugs directed against influenza virus.J Infect Dis, 2006,193:751-753,760-764. 15 繆英年, 林棉, 李亮, 等. 羌銀解熱湯對(duì)感染流感病毒小鼠治療作用實(shí)驗(yàn)研究J. 湖北中醫(yī)雜志, 2007, 29(11):7-8. 16 李亮, 林棉,

13、繆英年, 等. 羌銀解熱湯治療流感實(shí)驗(yàn)研究J. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2008,22(11):18-19. 17 李亮, 繆英年, 林棉. 羌銀解熱湯治療病毒性上呼吸道感染臨床觀察J. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2007,14(12):67-68. 18 李亮, 繆英年, 林棉. 羌銀解熱湯治療流行性感冒療效觀察J. 中國中醫(yī)急癥, 2009,18(6):878-879.二、研究內(nèi)容1.研究目的：研究取得顯著臨床療效的羌銀解熱湯對(duì)流感小鼠免疫調(diào)節(jié)著作用，從機(jī)體特異性免疫、非特異性免疫、細(xì)胞免疫、體液免疫、以及清除病毒多方面深入闡述中藥抗病毒的機(jī)理。2.研究對(duì)象：NIH小鼠3.研究內(nèi)容： （1）免疫抑

14、制流感小鼠模型的建立。（2）實(shí)驗(yàn)研究2、羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠非特異性免疫功能的影響（碳粒廓清試驗(yàn)）。3、羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠特異性免疫功能的影響。羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠體液免疫免疫功能的影響。 A 羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠血清溶血素抗體的影響。 B 羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠血清IL-2、IL-4及IFN-的測定。羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠細(xì)胞免疫免疫功能的影響。A 羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的測定。B 羌銀解熱湯對(duì)免疫抑制流感小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力的測定。三、研究方法和技術(shù)路線1.研究方法（1）藥物制備：把羌銀解熱湯煎煮2次后，合并2次濾液，濃縮

15、成含生藥量1g/ml的藥液，并以蒸餾水稀釋成各濃度藥液備用。 （2）免疫抑制小鼠模型的建立：NIH小鼠80只，隨機(jī)分為7組，每組10只。分別為正常對(duì)照組，免疫抑制空白對(duì)照組，羌銀解熱湯高劑量組、羌銀解熱湯中劑量組、羌銀解熱湯低劑量組、達(dá)菲組及模型對(duì)照組。除空白對(duì)照組組外的其余各組小鼠，以環(huán)磷酰胺做腹腔注射，劑量為50mg/kg（以生理鹽水調(diào)至體積約0.5ml/只），空白對(duì)照組注射等體積生理鹽水，隔日1次，共3次。 （3）實(shí)驗(yàn)研究： 肺組織中病毒RNA的測定：免疫抑制小鼠模型建立后，按組別給予灌胃給藥，連續(xù)5天，劑量分別為正常對(duì)照組，羌銀解熱湯高劑量組（ 40g/kg·d）、羌銀解熱湯

16、中劑量組（20g/kg·d）、羌銀解熱湯低劑量組（10g/kg·d）、達(dá)菲組（50mg/kg·d）。正常對(duì)照組、免疫抑制模型組、流感模型組以及免疫抑制流感模型組，以等體積蒸餾水代替。在給藥后第二天，除空白對(duì)照組及免疫抑制模型組外的其余各組小鼠在乙醚麻醉下，以H1N1病毒（10倍LD50）通過滴鼻方式進(jìn)行攻毒，空白對(duì)照組及免疫抑制模型組以等量生理鹽水代替。最后一次給藥2h后以頸椎脫臼法處死小鼠，于無菌條件下，剪取小鼠肺組織，每只小鼠各取1個(gè)樣本。并以RNA提取試劑盒提取各樣本（鼠肺）總RNA，再以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測鼠肺中的流感病毒RNA含量。 溶血素抗體測定實(shí)

17、驗(yàn)：取NIH小鼠80只，各組小鼠分組、造模與給藥方法如上，連續(xù)給藥7天。所有小鼠均于最后一次給藥2h后腹腔注射雞紅血球懸浮液（雞紅血球以Alsev er溶液保存，并置于于4冰箱，使用時(shí)先以生理鹽水洗滌，再用生理鹽水配成10%的懸浮液使用），腹注5小時(shí)后，摘眼球采血，然后取血清與5%雞紅血球懸浮液及10% 補(bǔ)體（以3只豚鼠血清混合后，再以生理鹽水配成10%溶液），在37恒溫箱中保溫30min后，再置于0冰箱中，使反應(yīng)中止。離心后取上清液，測定其OD值。碳粒廓清試驗(yàn)：取NIH小鼠80只，各組小鼠分組、造模與給藥方法如上，連續(xù)給藥7天。待最后一次給藥1小時(shí)后，把稀釋好的印度墨汁（10ml/kg）對(duì)各

18、組小鼠作尾靜脈注射，分別于2min及10min時(shí)進(jìn)行眼眶后靜脈叢取血，測定其光密度（OD）。并稱取小鼠肝臟及脾臟質(zhì)量，算得K值（廓清指數(shù)）及a值（肝脾吞噬系數(shù)）。 T淋巴細(xì)胞亞群的測定：取NIH小鼠80只，各組小鼠分組、造模與給藥方法如上，連續(xù)給藥5天。待最后一次給藥12小時(shí)后，將小鼠摘眼球取血后（血液室溫靜置備用），以脫臼法處死，無菌條件下剖取脾臟，并制備成細(xì)胞懸液，留取部分作T淋巴細(xì)胞增殖能力的測定，其余以Tris-NH4Cl溶脹紅細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取106個(gè)細(xì)胞（200ul體積），加入熒光標(biāo)記CD3+、CD4+、CD8+抗體，避光水浴45min，冷PBS洗滌2次后，以流式細(xì)胞儀測量CD3+T、

19、CD4+T、CD8+T細(xì)胞數(shù)量。T淋巴細(xì)胞增殖能力的測定：T淋巴細(xì)胞亞群測定實(shí)驗(yàn)中所取得的各組無菌脾細(xì)胞懸液，以完全I(xiàn)MDN培養(yǎng)液稀釋。鏡下計(jì)算脾細(xì)胞數(shù)，把細(xì)胞濃度調(diào)至5×106/ml。取1%臺(tái)酚藍(lán)以1:4比例加入細(xì)胞懸液中，觀察活細(xì)胞數(shù)（>95%）。將不同組別的脾細(xì)胞懸液置于96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔，加入ConA 100ug/孔，終濃度為5ug/ml。然后置CO2培養(yǎng)箱孵育48h，取出用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況。待脾淋巴細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)分裂期時(shí)（以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的大淋巴母細(xì)胞為標(biāo)志）每孔加入5mg/ml MTT 10ul/孔，置CO2培養(yǎng)箱孵育6h后取出，貼壁吸上清液100ul

20、棄之，加入DMSO 100 ul/孔。充分振蕩后，靜置10min，以酶標(biāo)儀測定。 血清IL-2、IL-4及IFN-的測定：把T淋巴細(xì)胞亞群測定實(shí)驗(yàn)中取得的各組小鼠血液，靜置及離心后吸取血清，并按IL-2、IL-4及IFN-測定試劑盒操作，以ELISA法檢測各組小鼠血清中的IL-2、IL-4及IFN-。中藥制備及動(dòng)物模型建立2.技術(shù)路線病毒清除能力測定免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究非特異性免疫特異性免疫細(xì)胞免疫體液免疫碳粒廓清 實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測鼠肺中流感病毒RNA含量血清IL-2IL-4及IFN-的測定溶血素抗體測定實(shí)驗(yàn)T淋巴細(xì)胞增殖能力測定T淋巴細(xì)胞亞群的測定四、工作基礎(chǔ)和條件1.承擔(dān)單位概況本項(xiàng)

21、目承擔(dān)單位中山市中醫(yī)院是三級(jí)甲等中醫(yī)醫(yī)院、廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，近年承擔(dān)部、省、市級(jí)科研課題多項(xiàng)，獲省市科技成果獎(jiǎng)勵(lì)多項(xiàng)。中山市中醫(yī)院擁有價(jià)值1.2億元的先進(jìn)設(shè)備儀器，有1500多張病床，日均門診病人7000多人次，目前擁有各類技術(shù)人員723人，其中博士4人，碩士70人，高級(jí)職稱人員143人，中級(jí)職稱人員有204人，其科研教學(xué)能力較強(qiáng)，尤其是科研能力、水平和科研管理工作在中山市處于領(lǐng)先地位，近年承擔(dān)部、省、市級(jí)科研課題多項(xiàng)，獲市級(jí)科技成果獎(jiǎng)勵(lì)多項(xiàng)。本單位另有經(jīng)省衛(wèi)生廳頒發(fā)生產(chǎn)許可證、能生產(chǎn)十多個(gè)劑型的制劑室，有設(shè)備齊全的藥檢室、藥化研究室和中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，有符合SPF級(jí)要求的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（省科技廳頒發(fā)許可證）和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，配有細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、冷凍離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀和全自動(dòng)動(dòng)物血球儀等儀器，為藥物的提取分離、藥理實(shí)驗(yàn)及制劑研究提供了必要