三磷酸腺苷檢測方法綜述

1、三磷酸腺苷檢測方法綜述三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)是一切生物體新陳代謝的能量源泉，普遍存在于一切生物細胞體內(nèi)，為細胞內(nèi)各種需能過程提供能量，是細胞生存的必須因素。三磷酸腺苷(AdenosinetriphosPhate)簡稱ATP，又名腺三磷，腺嗓吟配糖三磷酸，分子式為C10H16N5Ol3P3，分子量為507.21。ATP是核苷酸，一分子ATP中含有一分子腺嚓吟堿基，一分子核糖和三分子磷酸基。ATP是白色無定形粉末，無臭無味。具有引濕性，易溶于水，不溶于醇、醚及其它有機溶劑。ATP在水溶液中呈微酸性，其中性鈉、鉀鹽在-15保存，可穩(wěn)定數(shù)月，在0保

2、存可穩(wěn)定一星期；在0，7%的三氯乙酸中，ATP可穩(wěn)定數(shù)小時；在100lmol/L鹽酸中，10分鐘就游離出66%的磷；在0以上的堿性溶液中ATP分解成為無機焦磷酸鹽及一磷酸腺苷。中國專利CN104297219A提供一種高靈敏度的三磷酸腺苷檢測方法，其特征在于，其包括以下步驟：制備氨基化磁性納米粒子；制備固定化三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)；對配置好的三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)進行預(yù)處理，清除酶系統(tǒng)中殘留的三磷酸腺苷；使用MPI-B化學(xué)發(fā)光檢測儀進行三磷酸腺苷測定。同時，通過查閱文獻，我們找到了這幾種方法，根據(jù)ATP與其所含雜質(zhì)理化性質(zhì)的差異，發(fā)展起來了許多ATP的分析方法，歸納起來主要有層析法、電泳法和光學(xué)分析

3、法。關(guān)于層析法又分為紙層析法、薄層層析法、離子交換柱層析法和高效液相色譜法。紙層析方法測定ATP含量是生化試劑核苷酸含量測定的通用方法，其常用的展開劑組成為異丙醇+濃氨水+水(7:1:2)。薄層層析法與紙層析法一樣，是生化試劑核苷酸含量測定的通用方法。離子交換柱層析法是通過調(diào)節(jié)pH使核苷酸帶負電，陰離子樹脂吸附，通過改變PH值或降低陰離子濃度將核苷酸分離出來。高效液相色譜具有強大的分離能力，隨著高效液相色譜法(HPLC)的廣泛應(yīng)用，ATP制劑及生物組織中ATP純度與含量的測定變得簡便易行。近年來，報道的ATP電泳分析方法主要有紙電泳法、醋酸纖維薄膜電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法和毛細管電泳法。衛(wèi)生部

4、及地方的ATP標(biāo)準(zhǔn)測定方法均采用紙電泳法。該方法采用紙電泳將ATP與雜質(zhì)分離，紫外分光光度計測定分離出的ATP的吸收值，計算其含量。醋酸纖維薄膜電泳法采用了與紙電泳類似的實驗路線。瓊脂糖凝膠電泳法可以快速測定ATP的含量。采用毛細管的區(qū)帶電泳技術(shù)，克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴散和樣品擴散問題，使分析靈敏度有了很大提高，分離效率可達數(shù)百萬塊塔板數(shù)。光學(xué)分析法也有著其獨到的優(yōu)勢，主要有ATP試劑盒法和生物發(fā)光法，ATP試劑盒法是運用試劑盒檢測ATP的含量，生物發(fā)光法是運用熒光素酶和Mg2+的作用下，經(jīng)過一些列處理發(fā)出光，根據(jù)發(fā)光強度來確定ATP的含量。檢測方法方法名稱操作特點專利方法CN1042972

5、19A制備氨基化磁性納米粒子；制備固定化三磷酸腺苷檢測酶系統(tǒng)；清除酶系統(tǒng)中殘留的三磷酸腺苷；使用MPI-B化學(xué)發(fā)光檢測儀進行三磷酸腺苷測定。利用納米技術(shù)去除試劑本底殘存的ATP（三磷酸腺苷），降低試劑本身的發(fā)光值，從而提高試劑的檢測靈敏度。層析法紙層析法點樣量50ug，在30cm長新華一號濾紙上層析1216小時。層析畢，50烘干，于紫外光下劃斑點，對照標(biāo)準(zhǔn)，剪下ATP層析斑點(畫點要同樣大小)。分別將層析斑點用0.0lmol/L HCl15ml，40-50洗脫2小時，測定A260，據(jù)此算出ATP含量。對于一些定性分析，也可以直接用顯色劑顯色觀察結(jié)果。技術(shù)成熟，操作簡便，操作時間長，精度低。薄層

6、層析法以正丁醇十丙酮+冰乙酸+5%氨水+水(7:5:3:3:2)為展開劑，點樣量20ug，在以硅膠GF為吸附劑的薄板上展層。層析完畢后，于50干燥，紫外光下觀察吸收斑點。技術(shù)成熟，操作簡便，精度低。離子交換柱層析法PH值高于5時，所有的核苷酸都會帶負電荷，會被陰離子樹脂吸附，因此可以采用分步降低PH值或分步增加陰離子濃度的方法將不同的核苷酸依次洗脫下來。檢測洗脫液徹60，將之與洗脫液體積作圖，便能得到ATP的分析結(jié)果。可大量制取ATP，操作時間長，精度低高效液相色譜法采用UV-HPLC法檢測了ATP操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，儀器昂貴。電泳法紙電泳法以0.05mol/L，pH3.0的檸檬酸溶液作緩沖液

7、，處理過的新華二號濾紙為支持介質(zhì)，濕法點樣，電壓梯度1820v/cm，電泳1小時45分鐘。電泳畢，吹干濾紙，于紫外燈照射下剪出各吸收斑點，在0.01mol/LHcl溶液浸泡1小時，過濾，測定上清液A257，按照吸收系數(shù)計算出ATP含量。技術(shù)成熟，操作繁瑣，耗時長。醋酸纖維薄膜電泳法通過電泳、干燥、描斑點、洗脫、測吸光度值等步驟來測定ATP的含量，程序繁雜。電泳時間短，檢測便捷，需薄層掃描儀。瓊脂糖凝膠電泳法以瓊脂糖做支持介質(zhì)，以0.05mol/L、pH3.5的檸檬酸溶液做緩沖溶液，在40V/cm電壓梯度下電泳5分鐘，實現(xiàn)了ATP與其它雜質(zhì)的有效分離，測得了ATP含量。電泳時間短，精度低。毛細管電泳法在Beelaman5010型毛細管電泳儀上，采用熔融石英毛細管柱，以0.025m。比磷酸氫二鈉為電極緩沖液(用lmol氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10.2