淺論黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶

1、淺論黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶    文章標題：摘要：本實驗先采用正交設計法對黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化物酶的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，再通過放大實驗對最佳培養(yǎng)條件進行驗證，最終得出結果：最佳培養(yǎng)條件主要參數(shù)為：pH4.5、葡萄糖：10g/L、酒石酸銨：0.2g/L、吐溫-80：0.2g/L。關鍵詞：黃孢原毛平革菌，木素過氧化酶，藜蘆醇黃孢原毛平革菌，(Phanerochaetechrysosporium，簡稱P.Chrysosporium)是一種絲狀真菌,區(qū)別于單細胞微生物。菌對底物進行降解時,其次生代謝活動對反應環(huán)境的要求較為苛刻,需要一定的營養(yǎng)組分和嚴格

2、的偏酸環(huán)境(pH約4.5左右)。其對底物（染料）的降解主要是依靠其次生代謝產(chǎn)物胞外木素分解酶系。胞外木素分解酶系的發(fā)現(xiàn)是利用黃孢原毛平革菌降解木質素研究的重大進展。該酶系是一組同功酶，由兩類酶構成：木素過氧化物酶（Ligninperoxidases，簡稱Lip）和錳過氧化物酶（Mndependentperoxidases，簡稱Mnp）。kirkTK1小組于1983年首次從黃孢原毛平革菌培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)木素過氧化物酶，并發(fā)現(xiàn)該酶與賴錳酶（Mnp）、漆酶（Laccase）構成木素降解酶體系，該酶系有一個很重要的特點，就是它對底物的氧化是高度非特異性的，廣泛研究表明，該菌可以降解多種染料，包括偶氮類、三

3、苯甲烷類、雜環(huán)類、聚合染料等，在染料廢水處理方面具有廣泛的應用前景2，目前該菌已成為這類研究的模型菌種。在國外，利用黃孢原毛平革菌降解各種結構各異的污染有機物已經(jīng)成為一個非常熱門的研究方向，他們已在木素降解酶系的生產(chǎn)、酶系的性質、酶系的分子生物學研究和利用酶系降解有機污染物方面作了大量的工作。而我們國內的研究卻起步比較晚，開始于九十年代初，主要在木素過氧化物酶的生產(chǎn)條件和木素酶漂白紙漿廢水方面進行了一些探索。3Pasti4已完成了P.Chrysosporium產(chǎn)生的Lip對22種偶氮染料的氧化速率的測定。而且在整個合成階段Lip的合成量要比Mnp大得多，再加上Lip能降解木質素的模型物，因此L

4、ip在木質素的降解中起著主導作用，成為后來的主要研究酶。5本文主要通過對黃孢原毛平革菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化-正交設計法對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，再通過放大實驗對最佳培養(yǎng)基條件進行驗證比較。從而最終確定對黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶最有利的培養(yǎng)基方案。1材料和方法1.1材料1.1.1試驗材料菌種黃孢原毛平革菌(中國科學院微生物所5.776)。斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯煮汁1000mL，蔗糖20g，瓊脂20g，pH4.86.0。基本培養(yǎng)基：葡萄糖，酒石酸銨，吐溫-80，以上成分的量按正交表設計添加。醋酸緩沖液10mmoL/L（pH4.5），KH2PO42g/L，VB11mg/L，

5、0.5M藜蘆醇溶液1.0mL/100mL，微量元素混合液70mL/L，注意此時分不同pH值（4.0、4.5、6.0）。微量元素混合液（L-1）：氨基乙酸：0.5g，MgSO4·7H2O：3g，NaCl：11g，F(xiàn)eSO4·7H2O：0.1g，CoSO4：0.1g，CaCl2·2H2O：0.1g，ZnSO4·7H2O：0.19g，CuSO4·5H2O：0.01g，AlK（SO4）2·12H2O：0.01g，H2BO3：0.01g，Na2Mo·2H2O：0.01g，MnSO4·H2O：0.01g。0.1標準葡萄糖溶液：

6、準確稱取1g無水葡萄糖（預先于100105烘干），用水溶解，加5mL濃鹽酸，用水定容至1000mL。斐林試劑1.1.2儀器設備溫控搖床，太倉市華美生化儀器廠；紫外可見分光光度計（UV-9100），北京市瑞利分析儀器公司。1.2方法1.2.1基本培養(yǎng)條件PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5d的菌絲體加入到無菌水當中，適當攪拌，進行孢子計數(shù)。然后按照不同的量接入到250mL三角瓶中，三角瓶裝液量100mL，接種量（以孢子計）1.0×106mL-1；培養(yǎng)溫度：37，轉速：150r/min，培養(yǎng)6d。1.2.2酶活測定方法木素過氧化物酶（Lip）活力的測定（用氧化黎蘆醇的速率表示）。1mL反應液中含0.2mL

7、藜蘆醇溶液、0.4ml酒石酸緩沖液（250mmoL/L，pH3.0）、0.4mL培養(yǎng)液或稀釋液、20LH2O2溶液（20mmoL/L），于30反應2min，測310nm波長下的吸光度（）變化。一個酶活力單位（U）定義為每分鐘氧化黎蘆醇產(chǎn)生1moL/L黎蘆醛所需的酶量。1.2.3葡萄糖殘?zhí)菧y定（斐林法）61.2.4菌體干重測在      發(fā)酵過程中，每隔一天時間從發(fā)酵罐中取一定體積的發(fā)酵液，用已稱重的干燥濾紙進行過濾。而后將濾紙（連帶菌體）在100左右烘箱中烘至恒重，減去濾紙重量，即得菌體干重。1.2.5放大培養(yǎng)利用最優(yōu)方案及比擬放大對該最佳方案

8、進行放大試驗，記錄整個過程中pH、DO2、殘?zhí)橇?、菌體干重、木素過氧化酶酶活的變化。2結果與討論2.1確定最佳培養(yǎng)時間在靜置和搖床培養(yǎng)條件下測定黃孢原毛平革菌5.776產(chǎn)木素過氧化物酶（Lip）活力隨培養(yǎng)時間的變化，結果如圖1，Lip活力在第6d出現(xiàn)峰值，達到69.1U/L。Lip屬于次級代謝產(chǎn)物，與菌體生長不同步7，且Lip的合成與菌體生長是非偶聯(lián)的。由此確定第6d是研究培養(yǎng)條件改變對Lip活力影響最適時間。8圖1：對照酶活變化曲線2.2正交表的選擇選取pH、葡萄糖、酒石酸銨、吐溫-80為考察因素，每個因素取3個水平，按正交表L9（34）來設計實驗9，正交表如下：表1正交試驗因素水平的安排1

9、0因素水平ApHB葡萄糖（g/L）C酒石酸銨（g/L）D吐溫-80（g/L）1233.04.56.02.05.010.00.20.51.00.20.51.02.3數(shù)據(jù)分析從上述結果可以做出判斷：在其它條件相同的情況下，培養(yǎng)基中碳源（葡萄糖）豐富時更有利于黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶，相比其他，其酶活性高出23倍。同時，根據(jù)喻國策等11的研究也表明，木質素降解酶的產(chǎn)生受氮濃度條件影響，低氮濃度有利于酶的產(chǎn)生，高氮濃度則抑制酶的產(chǎn)生。2.3.1數(shù)據(jù)處理與分析表2正交試驗結果分析表因素水平ABCDXi酶活力（U/L）123456789123123123111222333213132321312231

10、12326.157.731.818.724.022.791.978.181.0Lip含量K1K2K3Sk1k2k3R136.7159.8135.5125.145.653.345.28.1115.665.4250.06106.838.521.883.761.9157.4126.9147.7161.952.542.349.210.2172.3128.6131.1401.557.442.943.714.5總和432ST=6795.32.3.2變量分析表3Lip活力方差分析表方差來源平方和自由度均方F值顯著性ABCD125.065977.51161.89418.98222262.532988.7680

11、.95204.4947.801.293.27*不顯著不顯著F0.05（2，2）=19.0；F0.025（2，2）=39.0122.4確定最優(yōu)培養(yǎng)基方案2.4.1確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方從極差和方差分析中看出影響黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化物歧化酶的因素的主次順序為葡萄糖濃度（碳源）pH，其中酒石酸銨濃度和吐溫-80濃度對木素過氧化物歧化酶活力的增加的影響不明顯，葡萄糖濃度的影響則為很顯著。而pH對酶活力影響很?。ㄕ`差）。所以正交實驗的最佳培養(yǎng)基條件為A2B3C1D1，即pH在4.5，葡萄糖（碳源）含量為10.0g/L，酒石酸胺（氮源）含量為0.2g/L，吐溫-80含量為0.2g/L時為最優(yōu)培養(yǎng)基方案。

12、2.4.2放大試驗利用最優(yōu)方案對該實驗進行放大試驗，具體方案如下：培養(yǎng)液體積：3L、pH4.5、葡萄糖：10g/L、酒石酸銨：0.2g/L、吐溫-80：0.2g/L、醋酸緩沖液10mmoL/L（pH4.5），KH2PO42g/L，VB11mg/L，0.5M藜蘆醇溶液（VA）10mL/L，微量元素混合液70mL/L、溫度：37°C、接種量：1.0x109個孢子/L、轉速：80r/min，培養(yǎng)時間為8d，測定酶活方法同上，同時，測定菌體干重、DO2值、pH變化以及殘?zhí)呛?，結果如下：綜合上述兩圖(圖2和圖3)可知，黃孢原毛平革菌生長的遲緩期很短，在曲線中基本上無法體現(xiàn)出來。不過對于一般生

13、產(chǎn)周期較短的真菌而言，這是比較正常的。而菌體的對數(shù)生長期則較明顯（13d），此過程中黃孢原毛平革菌以最大的速率生長和分裂，菌體數(shù)量呈對數(shù)增加，而且菌體內各成分也按照同樣的比例有規(guī)律的增加，由于黃孢原毛平革菌是好氧微生物，所以在生長的同時大量的消耗氧氣，導致DO2值明顯下降。隨著菌體的生長，也伴隨著生長代謝產(chǎn)物的生成，對于黃孢原毛平革菌來說，主要的代謝產(chǎn)物是過氧化物酶和乙二醛氧化酶。隨著營養(yǎng)物質的消耗，代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境的變化，逐步不宜黃孢原毛平革菌的生長，導致生長速率逐漸降低，從而進入穩(wěn)定期，這個階段也就是黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶的最佳時間，即培養(yǎng)過程中的47d，此階段木素過氧化酶的

14、酶活性最高，具體出現(xiàn)在培養(yǎng)的第7d，酶活高達110U/L，比同時期搖床培養(yǎng)最高酶活（91.9U/L）高接近20U/L。隨著氮源（酒石酸銨）的耗盡，菌體也開始死亡，自溶，從而造成pH和溶氧的回升。3結論黃孢原毛平革菌產(chǎn)木素過氧化酶的最佳培養(yǎng)條件為：pH在4.5，葡萄糖（碳源）含量為10.0g/L，酒石酸胺（氮源）含量為0.2g/L，吐溫-80含量為0.2g/L。但在實驗過程中我們也發(fā)現(xiàn)，在氮源耗盡時還有相當量的葡萄糖存在，約在6g/L左右，所以可考慮適當降低培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，以減少資源浪費，增加效益。作者簡介：鄭銳東（1982-），男，學士，揭陽職業(yè)技術學院生物工程系助教，主要從事微生物工程

15、的相關工作。參考文獻：1丁佐龍,邢邦啟.木素過氧化物酶合成的部分影響因素J.合肥工業(yè)大學學報(自然科學版),1998,6(21):12.2章燕芳,李華鐘,華兆哲等.黃孢原毛平革菌合成的木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶及其菌球在染料脫色過程中的作用J.過程工程學報,2002,3(2):246.3梁園園,張朝暉,周嘵云.黃孢原毛平革菌木素降解酶系的研究進展J.工業(yè)微生物,2003,4(33):4243.4PastiMB,PaszczynskiA,GoszczynskiS,etal.InfluenceofAromaticSubstitutionPatternsonAzoDyeDegradabilitybyStretomycessp.andPhanerochaetechrysosporiumJ.Appl.Environ.Microbiol.,1992,58(11):36053613.5張朝暉,夏黎明,林建平等.黃孢原毛平革菌培養(yǎng)合成木素過氧化物酶研究J。浙江大學學報(自然科學版)，1999,2(33):132133.6華南理工大學等.工業(yè)發(fā)酵分析M.北京:中國輕工業(yè)出版社,2003.1617.7劉穩(wěn),李楊,高培基等.過氧化物酶研究進展J.纖維素科學與技術,2000,8(2):5064.8楊曉