小兒急性淋巴細(xì)胞白血病的免疫分型和抗原受體基因分析

1、    小兒急性淋巴細(xì)胞白血病的免疫分型和 抗原受體基因分析        近年來(lái)，用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平檢測(cè)免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因的重排，從本質(zhì)上區(qū)分B系和T系，與免疫分型結(jié)合起來(lái)分析已成為一種對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病(急淋)分型的較理想手段。1材料和方法研究對(duì)象為近兩年臨床收治的小兒急淋20例，男14例，女6例，年齡212歲，中位數(shù)年齡6歲。20例入院時(shí)已做骨髓涂片形態(tài)學(xué)診斷。取以上初發(fā)未經(jīng)化療患兒的骨髓35ml，經(jīng)ACD抗凝，用密度梯度分離法分離出單個(gè)核細(xì)

2、胞，制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液，部分涂片(涂片作形態(tài)學(xué)檢查，白血病細(xì)胞占90%以上)，其余提取DNA。免疫分型采用堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)組化染色(APAAP)法，選用T細(xì)胞系單抗：CD3、CD4、CD5、CD7、CD8，B細(xì)胞系單抗：CD10、CD19、CD20，髓系單抗：CD13和單抗HLA-DR，這些單抗均購(gòu)自DAKO公司。二抗、三抗由武漢生物制品研究所提供。抗原受體基因重排測(cè)定采用DNA印跡法，實(shí)驗(yàn)所用探針I(yè)gH-JH(2.5kb)、IgH-C(1.2kb)、TCR(1.5kb)、TCR(0.7kb)、TCR(0.7kb)。常規(guī)方法提取DNA，分別用BamHI、EcoRI及Hind進(jìn)行

3、酶切，經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，用經(jīng)隨機(jī)引物法標(biāo)記的32P探針與尼龍膜上變性過(guò)的DNA雜交，放射自顯影。2結(jié)果參照有關(guān)文獻(xiàn)1，根據(jù)單抗識(shí)別細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性與否(以25%的原始細(xì)胞被單抗標(biāo)記為陽(yáng)性結(jié)果)，將本組20例急淋免疫分型分為非T-ALL、T-ALL。非T-ALL又分為、4個(gè)亞型，T-ALL又分為、3個(gè)亞型。所有病例均經(jīng)CD13排除髓系白血病。同時(shí)，20例急淋的DNA分別與探針JH、C、J、J、C雜交以顯示重排與否。免疫分型與抗原受體基因重排的關(guān)系以及兩類(lèi)急淋的抗原受體基因結(jié)構(gòu)的變化發(fā)生率比較，分別見(jiàn)表1和表2。3討論B細(xì)胞是分泌產(chǎn)生免疫球蛋白(Ig)的前身，

4、T細(xì)胞膜上存在膜受體(TCR)。編碼Ig和TCR的基因由胚系中數(shù)個(gè)分隔開(kāi)的基因片段V、D、J、C經(jīng)重排而形成，隨著淋巴細(xì)胞分化成熟，Ig在B系細(xì)胞中的重鏈和輕鏈先后發(fā)生重排，在T系細(xì)胞中，TCR以順序重排。了解這些基因重排便可了解淋巴細(xì)胞的起源和分化。本文20例與探針JH、C、J1、J和C的DNA印跡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)非T-ALL中代表IgH的JH基因重排或丟失發(fā)生率為100%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致2，提示這些白血病細(xì)胞起源于B系淋巴細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。IgH的基因結(jié)構(gòu)中的恒定區(qū)C基因片段由多個(gè)外顯子組成，靠近5端的C與免疫球蛋白的類(lèi)型轉(zhuǎn)換有關(guān)3，只有成熟的B細(xì)胞才有可能發(fā)生C結(jié)構(gòu)變化。Ha.K等報(bào)道4，根據(jù)B

5、amH的酶切譜，用探針JH和C與BamH酶切的基因組DNA雜交，顯示二者的胚系帶等長(zhǎng)，在pre-B階段兩者所反映的問(wèn)題相同，都證明IgH基因是否重排。而本實(shí)驗(yàn)所用C探針是與Hind 酶切人組DNA雜交，它的胚系片段與JH無(wú)關(guān)。本組20例均顯示C呈胚系狀態(tài)，說(shuō)明其中所有非T-ALL都尚未進(jìn)入具免疫球蛋白類(lèi)型轉(zhuǎn)換的成熟B細(xì)胞階段，與免疫分型一致。6例T-ALL的TCR1、的基因重排測(cè)定，TCR、TCR、TCR1的基因結(jié)構(gòu)變化率分別為83%、67%、100%，除TCR的發(fā)生率較低外，其它兩者與國(guó)外報(bào)道近似5，與免疫分型相吻合。另外，亦顯示的重排先于和。同時(shí)14例非T-ALL的TCR、和1的重排或缺失

6、發(fā)生率分別是14%、71%和71%；6例T-ALL發(fā)生IgH的重排率為17%。IgH基因的結(jié)構(gòu)變 表1免疫分型與抗原受體基因重排的關(guān)系例號(hào)免疫 分型IgHTCRTCRTCRJH(BamHI)C(Hind)J(EcoR)C(EcoR)J1(EcoR1)1T-G/GG/GR/RR/GR/D2T-G/GG/GG/GG/GR/D3T-R/RG/GG/GR/RR/R5T-G/GG/GR/GR/GD/D6T-G/GG/GD/DR/DD/D7T-G/GG/GR/GR/GD/D10非T-R/GG/GD/DG/GG/G12非T-R/GG/GR/RG/GR/D14非T-D/DG/GR/GG/GR/D15非T-R/

7、RG/GR/RR/RD/D17非T-R/RG/GD/DG/GD/D18非T-R/RG/GR/RG/GD/D19非T-R/RG/GR/RG/GD/D20非T-D/DG/GR/DG/GR/D22非T-D/DG/GG/GG/GD/D25非T-R/R/RG/GG/GG/GG/G26非T-R/RG/GG/GG/GG/G28非T-R/RG/GR/DR/GD/D30非T-NG/GG/GG/GG/G32非T-R/DG/GR/DG/GR/D注：R為重排，G為胚系，D為缺失，N為未檢測(cè) 表2ALL中IgH與TCR基因重排與缺失IgHTCRTCRTCR1N%N%N%N%非T-ALL13100*214*1071107

8、1T-ALL1175834676100*：與T-ALL相比，P0.01變化在非T-ALL中的發(fā)生率明顯高于T-ALL(P0.01)，TCR基因的結(jié)構(gòu)變化在T-ALL中的發(fā)生率明顯高于非T-ALL(P0.01)；而TCR和TCR1的基因結(jié)構(gòu)變化在兩類(lèi)ALL中的差異無(wú)顯著意義(P0.05，P0.05)，表明在基因重排或缺失中IgH對(duì)B系A(chǔ)LL、TCR對(duì)T系A(chǔ)LL分別具有型的特異性鑒別意義；TCR和TCR1則無(wú)型的特異性。盡管基因重排結(jié)果顯示，不僅在非T-ALL中發(fā)生部分TCR基因重排或缺失，而且在T-ALL中也發(fā)生少數(shù)IgH基因重排或缺失的交叉重排現(xiàn)象，但是結(jié)合免疫學(xué)分析仍不妨礙對(duì)T系與B系急淋的

9、區(qū)分。一般說(shuō)來(lái)，免疫學(xué)分型本身可以鑒別急淋的T系與B系及其亞型，然而目前尚存在的諸多問(wèn)題，如特異性單抗種類(lèi)不能滿足細(xì)胞表面的分化抗原、分化抗原的敏感性較低、無(wú)分化抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞等往往使免疫分型難以確定，因此基因重排分析和免疫分型可以互補(bǔ)，彼此不可替代。 參考文獻(xiàn)1Nadler LM, Korsmeyer SJ, Anderson KC, et al. B cell origin of Non-T cell acute lymphoblastic leukemia. J Clin Investiga-tion, 1984,74(2)332.2Foon KA, Todd RF. Immunol

10、ogic classification of leukemia and lymphoma. Blood, 1986,68(1)1.3金伯泉.免疫球蛋白超家族.見(jiàn)：金伯泉主編.細(xì)胞和分子免疫學(xué).第1版.西安：世界書(shū)出版公司，1995.27-80.4Ha K, Hozumi N, Hrincu A, et al. Lineage specification of leukemia: Results of the analysis of sixty cases of childhood leukemia. Bri J Hemato, 1985,61(2)237.5Jacques JM, Van Dongen, Ingrid