外周血淋巴細胞HLA－B表達與胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系

1、外周血淋巴細胞HLAB表達與胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)系    目的：探討外周血淋巴細胞（PBL）HLABnbsp;mRNA及HLAB抗原表達與胃癌發(fā)生、分化的關(guān)系。方法：自行設(shè)計、篩選HLAB特異性引物，應(yīng)用RTPCR方法檢測了30例胃癌患者外周血淋巴細胞HLABnbsp;mRNA的表達，并與流式細胞術(shù)檢測HLAB抗原進行比較     張義  鄒雄  楊曉靜  單寧寧  秦緒珍  鄒明瑾 目的：探討外周血淋巴細胞（PBL）HLAB mRNA及HLAB抗原表達與胃癌發(fā)生、分化

2、的關(guān)系。方法：自行設(shè)計、篩選HLAB特異性引物，應(yīng)用RTPCR方法檢測了30例胃癌患者外周血淋巴細胞HLAB mRNA的表達，并與流式細胞術(shù)檢測HLAB抗原進行比較。結(jié)果：胃癌患者PBL HLAB mRNA表達率（23.3）與正常人（87.5）相比差異顯著（P0.01），尤以低分化轉(zhuǎn)移胃癌（16）下降更為明顯；而流式細胞術(shù)檢測高分化未轉(zhuǎn)移胃癌患者PBL HLAB抗原表達率（88.20）與正常對照（98.84）相比，雖然無顯著性差異（P0.056），但存在明顯下降趨勢；低分化伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌（73.26）則下降顯著（P0.05）。結(jié)論：胃癌患者淋巴細胞 HLAB mRNA及HLAB抗原表達降低或

3、缺失，且與其分化程度相關(guān)。檢測PBL HLAB mRNA較HLAB抗原能更直接、更本質(zhì)地反映胃癌發(fā)生分化的關(guān)系。主題詞：淋巴細胞HLAB；胃癌；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；流式細胞術(shù) 近十余年來，免疫學上突破性進展是提出了MHC（Major histocompatibility ）在免疫應(yīng)答中的重要作用。T細胞受體識別MHC（Major histocompatibility）和腫瘤抗原的復合體，是激活機體抗腫瘤免疫第一步。目前學術(shù)界已形成共識：腫瘤細胞表面MHC抗原表達下調(diào)和腫瘤的發(fā)生、分化、轉(zhuǎn)移有關(guān)，是導致腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因。但有關(guān)外周血淋巴細胞HLA（Human leukocyte ant

4、igen）表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究鮮有報道，本研究設(shè)計并篩選人外周血淋巴細胞HLAB特異性引物，成功克隆了HLAB功能基因，觀察胃癌患者外周血淋巴細胞HLAB mRNA及HLAB抗原表達情況，為腫瘤的基因診斷和基因治療提供有價值的臨床指標。    材料與方法 一、材料 1. 研究對象：2003.032003.07 山東大學齊魯醫(yī)院普外科住院病人，經(jīng)手術(shù)前胃鏡或術(shù)后病理學檢查確診的胃癌病人30例，男22例，女8例，年齡3678歲，中位年齡56.8歲。其中未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高分化腺癌5例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低分化腺癌25例；正常對照取自山東大學齊魯醫(yī)院健康職工

5、查體者，均無既往胃病史。 2. 主要試劑與儀器：逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶及WBC裂解液（深圳匹基生物公司饋贈）；淋巴細胞分離液（上海華精生物公司）；瓊脂糖試劑（美國Sigma公司）；鼠抗人HLAB McAb及PE標記羊抗鼠IgG1（美國BD公司）；GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder（上海生物工程公司）。Biometra 梯度PCR擴增儀、Sunrise電泳儀、Bioemetra凝膠圖象分析系統(tǒng)、EPTENDORF紫外分光光度計（德國Whatman公司）；HERMLE Z383K 低溫高速離心機（德國HERMLE公司）；ABI PRISM 37796全自動DNA測序儀（美國PE

6、公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。    二、方法 1. 引物設(shè)計與合成：據(jù)Genebank公布的HLAB基因序列，參閱相關(guān)文獻1，2，設(shè)計HLAB特異性引物（深圳匹基生物公司合成），并進一步篩選、驗證其工作情況。 2. PBL RNA的提取及鑒定：外周血淋巴細胞總RNA提取參閱分子克隆相關(guān)方法3，并在此基礎(chǔ)上加以改良。提取的RNA在EPTENDORF紫外分光光度計上測定260nm和280nm波長吸光度及RNA濃度，1.5瓊脂糖甲醛變性電泳，鑒定所提取的RNA純度及完整性。    3. RT

7、PCR擴增：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系25ul，其中逆轉(zhuǎn)錄酶1ul，Taq酶0.2ul，primer1、primer2各0.4ul，RNA 15ul。PCR反應(yīng)參數(shù)為42 30 min；95 3 min；94 1 min；55 1 min；72 1 min，5個循環(huán)。94 10 sec；60 40sec；40個循環(huán)。72 5 min。 4. 擴增產(chǎn)物電泳掃描及序列分析：將上述PCR擴增產(chǎn)物于2瓊脂糖凝膠上電泳掃描，cDNA 以BigDye terminator v2.0為測試試劑，在ABI PRISM 37796型全自動測序儀上測序，并在互聯(lián)網(wǎng)上用Blastn服務(wù)器對序列進行查詢和比較。 5. HLAB

8、mRNA及HLAB抗原在胃癌中的表達：提取40例正常對照及30例不同類型胃癌病人PBL總RNA并調(diào)整其濃度，以actin作內(nèi)參照，用RTPCR方法檢測HLAB mRNA表達；用流式細胞術(shù)觀察HLAB抗原在胃癌中的表達情況。 6. 統(tǒng)計學方法：平均熒光強度以均數(shù)±標準差表示，例數(shù)分析以百分比表示，使用SPSS 10.0 for windows統(tǒng)計軟件t檢驗及X2檢驗進行統(tǒng)計學處理。   結(jié)果 1. PBL總RNA鑒定：提取的正常人PBL RNA在EPTENDORF紫外分光光度計測定，其吸光度均值為A260A2801.87，平均濃度為262.7ug/ml，1.5低熔點瓊脂糖變性

9、電泳可見5s，18s，28s三條清晰條帶，表明所提RNA濃度較純，且RNA完整無裂解，可用于RTPCR。 2. 擴增片段序列分析：擴增片段HLAB cDNA 在Genbank Blastn 服務(wù)器在線查詢比較顯示，與已知序列具有99.3符合率，說明已經(jīng)成功獲得了表達外周血淋巴細胞HLAB功能的目的基因。 3. 正常人PBL HLAB mRNA的表達：40例正常人PBL HLAB mRNA 經(jīng)RTPCR擴增，瓊脂糖電泳圖譜顯示35例呈現(xiàn)特異性的強亮帶（圖2），與預期287 bp片段相吻合，其陽性表達率為87.5。            

10、                  4. 胃癌病人PBL HLAB mRNA及HLAB抗原的表達：30例胃癌病人中HLAB mRNA 表達缺失者23例，占胃癌病人的76.6（2330）；表達明顯降低者5例，占16.7（530）。其中，25例低分化轉(zhuǎn)移胃癌中HLAB mRNA未表達者21例，占84（2125），5例高分化未轉(zhuǎn)移胃癌中3例呈現(xiàn)低表達狀態(tài)（60。35），2例表達缺失（圖3）。與正常人相比，胃癌病人外周血中淋巴細胞HLAB mRNA陽性表達率（23.3，730）明顯低于正常人（

11、87.5，3540），統(tǒng)計學分析具有顯著性差別（P0.01）。 20例不同類型的胃癌病人間標法HLAB流式細胞儀檢測結(jié)果顯示（見表1），高分化未轉(zhuǎn)移胃癌病人外周血淋巴細胞HLAB抗原表達陽性率（88.20）與正常對照（98.84）相比，雖然無顯著性差異（P0.056），但存在明顯下降趨勢；而低分化伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌（73.26）則差異顯著（P0.05）。以平均熒光強度（MFI）分析，高分化未轉(zhuǎn)移胃癌病人MFI（55.27±2.41）及低分化轉(zhuǎn)移胃癌病人MFI（25.73±1.87）與正常對照相比均存在非常顯著性差異（P0.01）。表明胃癌患者外周血淋巴細胞HLAB抗原表達下調(diào)

12、，且與其分化、轉(zhuǎn)移有關(guān)。    討論 在人類基因組中，編碼HLA類分子的基因組成包括124 HLAA、258 HLAB和74 HLAC4，其中HLAB表達最多（56.6）。研究表明腫瘤細胞表面HLA類分子，尤其是HLAB表達下降或缺失，是逃避CTL殺傷，導致腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視的機理之一5。以往對HLA類分子的研究多集中于腫瘤細胞表面，如David R.6對乳腺癌、大腸癌病人檢測結(jié)果顯示腫瘤細胞表面HLA類分子表達分別降低88和73，且與腫瘤細胞表面HLAB mRNA相關(guān)較好（r20.80）。本課題前期研究中也得到類似結(jié)論7，8。 但腫瘤細胞表面HLA表

13、達是腫瘤細胞的特性，而宿主血液白細胞HLA表達的變化，則反映了全身HLA狀態(tài)，代表了宿主的免疫特性。其HLA表達的強弱，一定程度上表示了機體辨別異己的能力。本研究根據(jù)HLAB基因結(jié)構(gòu)特點9，10及相關(guān)文獻，合成針對HLAB保守區(qū)的引物加以篩選，RTPCR擴增、凝膠電泳圖譜顯示表達了與預期結(jié)果相吻合的DNA片段，經(jīng)DNA測序、計算機分析顯示與Genebank公布序列高度符合，表明成功獲得了 HLAB表達的功能基因。應(yīng)用于胃癌患者，結(jié)果顯示胃癌患者PBL HLAB mRNA表達率（23.3）與正常人相比（87.5），具有非常顯著差異（P0.01）。同時，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)高分化未轉(zhuǎn)移胃癌病人PBL

14、 HLAB抗原表達率（88.20）與正常對照（98.84）相比，雖然無顯著性差異（P0.056），但存在明顯下降趨勢；而低分化伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌表達率（73.26）與正常相比則差異顯著（P0.05）。以平均熒光強度（MFI）分析，高分化未轉(zhuǎn)移胃癌病人MFI（55.27±2.41）及低分化轉(zhuǎn)移胃癌病人MFI（25.73±1.87）與正常對照 （116.26±25.73）相比均存在非常顯著性差異（P0.01）。提示胃癌患者PBL HLAB mRNA 及HLAB抗原表達下調(diào)與其分化、轉(zhuǎn)移有關(guān)，而這種改變在腫瘤發(fā)生的早期就可能出現(xiàn)，并影響腫瘤的臨床轉(zhuǎn)歸。其機理可能與細胞膜上

15、HLAB的脫落，修飾后裝配和運輸，或合成及調(diào)控等因素有關(guān)11。但PBL HLAB基因及其編碼的蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的分子生物學機制，尚有待于進一步研究闡明。 目前國內(nèi)外檢測HLAB多采用組織化學法，較先進的使用流式細胞術(shù)。由于HLAB具有高度的多態(tài)性，使用針對HLAB 不同抗原決定簇的不同抗體，流式細胞儀測定結(jié)果存在差異。本研究根據(jù)HLAB保守序列設(shè)計特異性引物，用RTPCR方法檢測PBL HLAB mRNA表達，消除了不同抗體因素的影響，減少了誤差。Liu K等12研究也顯示RTPCR檢測腫瘤細胞表面HLAB表達較流式細胞術(shù)更敏感。本實驗表明從基因水平檢測HLAB mRNA表達較HLAB

16、抗原能更準確、更本質(zhì)地反應(yīng)與胃癌發(fā)生、分化和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。                參考文獻 1 David R. Johnson，Barbara C，Biedermann，et al. Rapid cloning of HLA class cDNAs by locus specific PCR. Journal of Immunological Methods，2000，233：119129. 2 Peter Krausa，Jason B. Stein，Jan Capper，et al.

17、DNA sequencing based typing HLAB and HLAC alleles：a strategy for analyzing exons 2 to 7. Human Immunology，2002，63：s42. 3 薩姆布魯克 D. W. 拉塞爾等，分子克隆實驗指南M. 北京：科學出版社，2002，518522. 4 Bodmer JG，Marsh SG，Albert ED，et al. Nomerclature for factors the HLA system. Human Immunol. 1998，60：361368. 5 Maeurer MJ，Gollin

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