大蒜素納米粒抑制原位移植性肝癌生長的實(shí)驗(yàn)研究

1、大蒜素納米粒抑制原位移植性肝癌生長的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】     目的：探討大蒜素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（DATSPBCANP）對人肝癌裸鼠原位移植瘤生長的影響及其可能的分子機(jī)制。方法：采用在裸鼠肝包膜下接種肝細(xì)胞HepG2移植物的方法構(gòu)建人肝癌裸鼠原位移植瘤模型，并將其分為空白對照組、空白納米粒組、大蒜素（DATS）注射液組和DATS納米粒組(DATSPBCANP)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；用藥2周后處死實(shí)驗(yàn)動物，觀察腫瘤體積的變化，計(jì)算抑瘤率，采用免疫組化法檢測腫

2、瘤組織中的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），Western blot檢測原位肝癌移植物組織中細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：人肝癌裸鼠原位移植瘤模型構(gòu)建成功率為100，DATS納米粒組平均腫瘤體積明顯縮小（P0.05)，免疫組化法和Western blot檢測顯示，DATS納米粒組PCNA蛋白表達(dá)明顯降低（P0.05），而Fas和FasL蛋白的表達(dá)各組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論：DATSPBCANP對肝臟具有明顯的靶向性，能顯著抑制肝癌體內(nèi)生長，其機(jī)制可能是抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。     【關(guān)鍵詞】  大蒜素 納米粒 肝腫瘤 原位移

3、植模型          ZHANG Zhimian1, YANG Xiaoyun1, DENG Shuhai2, XU Wei2, SHI Chengyao3    (1. Health Examination Center, Qilu Hospital of Shandong University; 2. Institute of Pharmaceutical preparation,    School of Pharmacy, Shand

4、ong University; 3. Department of Pharmacy, Qilu Hospital of Shandong University,    Jinan 250012, Shandong, China)    ABSTRACT  Objective: To study the antitumor effect and the relevant mechanism of the hepatic targeted polybutylcyanoacrylate nanoparticles of diall

5、yl trisulfide (DATSPBCANP) on orthotopic transplanted HepG2 hepatocellular carcinoma in nude mice. Methods: The orthotopic transplantation HCC models were established by implanting HCC HepG2 xenograft bits under the envelope of the mouse liver. Then, they were divided into 4 groups: the normal salin

6、e (NS) group, the empty nanoparticles group, the diallyl trisulfide (DATS) group, and the DATSPBCANP group. Two weeks later, the tumor volume was determined,  the PCNA expression in cancer tissues was determined by using immunohistochemistry, and the apoptosis and cell proliferation were determ

7、ined by Western blot. Results: The success rate of tumor orthotopic transplantation was 100%. Intravenous administration of DATSPBCANP significantly delayed the growth of orthotopic transplantation hepatoma in nude mice (compared with the other three groups, all P0.05). The results of immunohistoche

8、mistry and western blot analysis showed that tumors from DATSPBCANPtreated mice exhibited a markedly downregulating expression of PCNA compared with the control tumor. There was no significant difference in the expression of Fas and FasL proteins among the four groups (P0.05). Conclusion: DATSPBCANP

9、 has a significant antitumor  山  東  大  學(xué)  學(xué)  報(bào)  (醫(yī)  學(xué)  版)45卷4期    張志勉，等.大蒜素納米粒抑制原位移植性肝癌生長的實(shí)驗(yàn)研究     effect on the orthotopic transplantation HCC model in association with the suppression of proliferation of tumor cells.&#

10、160;   KEY WORDS  Allicin; Nanoparticles; Hepatocellular; Model, orthotopic transplantation    大蒜素（allicin）為由百合科植物大蒜鱗莖中提取的一種具有多方面藥理作用的有機(jī)含硫物質(zhì)，其防癌抗癌作用是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)1,2，化學(xué)結(jié)構(gòu)為二烯丙基三硫化物（diallyl trisulfide，DATS）的化合物被認(rèn)為是其中抗癌活性最強(qiáng)的成份3。目前化學(xué)治療雖是治療肝癌的重要手段，但存在著抗癌藥物肝臟分布少，毒副作用大、無法對癌細(xì)胞產(chǎn)生有效殺傷

11、作用等問題。因此，尋找新型高效的抗癌藥物，提高藥物作用的靶向性并降低毒副作用，是目前肝癌治療中亟待解決的問題。我們既往的研究表明46，通過采用與介入治療相似的方法局部給予大蒜素，能夠抑制皮下移植腫瘤的生長。納米粒載藥系統(tǒng)不僅可使給藥量的80濃集于肝臟，而且能使藥物進(jìn)入肝細(xì)胞。為進(jìn)一步探討提高大蒜素療效的途徑，我們選取乳化聚合法研制的大蒜素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（DATSPBCANP）作為干預(yù)物質(zhì)，利用裸鼠原位移植性肝癌模型對大蒜素抗癌的體內(nèi)機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究。    1  材料與方法    1.1  材料 

12、; HepG2人肝癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，小牛血清購自上海華美公司。大蒜素購自江蘇清江藥業(yè)有限公司，DATS注射液（30?mg/支）購自上海禾豐制藥有限公司。大蒜素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（DATSPBCANP）由山東大學(xué)藥學(xué)院制備，其平均粒徑為113.4?nm，平均載藥量為（18.18±0.46）?？谷嗽鲋臣?xì)胞核抗原（PCNA，36?kDa）抗體、抗人Fas（45?kDa）抗體、抗人FasL（40?kDa）抗體和抗人肌動蛋白（actin，44?kDa）抗體均購自美國Santa Cruz公司。  

13、60; 雄性BALB/c裸小鼠35只，3 4周齡，體重12.1 15.0?g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，在SPF級條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。    1.2  人肝癌異位移植瘤（供體瘤）的制備  HepG2細(xì)胞株體外傳代培養(yǎng)到細(xì)胞處于對數(shù)生長期，收集細(xì)胞制成濃度為5×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，直接注射接種于5只裸小鼠頸側(cè)和大腿皮下，每點(diǎn)0.1?ml，待腫塊生長至1 1.5?cm時(shí)進(jìn)行原位移植。接種前，無菌狀態(tài)下完整取出瘤組織，放入RPMI 1640溶液中，剔除外周纖維組織、血管及中央壞死組織，用取樣器切成約1?mm

14、5;1?mm瘤塊備用。    1.3  人肝癌裸鼠肝原位移植瘤模型的建立  采取肝內(nèi)隧道植入法將剩余30只裸小鼠麻醉后開腹，暴露肝左葉，用麻醉套管針在肝葉上刺孔，將切成小塊的新鮮異位移植瘤塊植入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，明膠海綿填塞壓迫止血，縫合關(guān)腹，預(yù)防切口感染。    1.4  實(shí)驗(yàn)分組及處理  手術(shù)造模后10?d，將造模成功的荷原位移植瘤裸小鼠分別稱量、標(biāo)記，并隨機(jī)分成4組，經(jīng)尾靜脈注射給藥，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參照文獻(xiàn)7確定給藥量。1組為空白對照組（0.9%生理鹽水，n=5），2組為空白納米粒組（空白納米粒1.5

15、?mg/(kg·d)，n=8），3組為DATS注射液組（DATS 1.5?mg/(kg·d)，n=8），4組為DATS納米粒組（DATSPBCANP 1.5?mg/(kg·d)，n=8）。注射前均用生理鹽水調(diào)整藥物濃度，使每次注射量為0.2?ml，隔天注射1次，共2周。停藥1?d后稱體重、處死裸鼠，解剖肝臟，完整切取移植腫瘤并測量大小。將切除腫瘤標(biāo)本一部分用10福爾馬林固定，24?h內(nèi)石蠟包埋，另一部分迅速以液氮凍存，用于后續(xù)行分子生物學(xué)指標(biāo)檢測。    1.5  觀察指標(biāo)  主要包括：小鼠實(shí)驗(yàn)前后的一般生長情況；

16、小鼠肝腫瘤大小、形態(tài)，有無侵犯、種植或轉(zhuǎn)移；抑瘤率。沿腫瘤最長軸切開腫瘤，測量切面的長徑（L）及短徑（W），根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積（V/mm3）：W2×L×0.52；抑瘤率（%）=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/空白對照組腫瘤體積)×100%。    1.6  腫瘤組織中PCNA的表達(dá)  采用免疫組化法進(jìn)行檢測。將石蠟包埋后的腫瘤組織連續(xù)切片，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行，一抗為抗人PCNA抗體，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。判斷標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞核呈棕黃色為PCNA表達(dá)陽性細(xì)胞。鏡下觀察每張切片計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（

17、15;400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，以1?000個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)為PCNA指數(shù)。    1.7  Western blot測定各組腫瘤組織中PCNA、Fas和FasL蛋白的表達(dá)  提取瘤組織總蛋白，10%聚丙烯凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBS溶液封閉后，先與相應(yīng)的一抗4?孵育過夜，TBS漂洗，再加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，37? 2?h，TBS漂洗后，采用ECL發(fā)光試劑檢測。全自動圖像分析儀分析測定條帶的面積和灰度值，得出積分灰度值以代表蛋白質(zhì)表達(dá)量。    1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理&

18、#160; 資料結(jié)果用±s表示，使用SPSS 10.0軟件自動進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)  果    2.1  動物模型的建立及原位移植腫瘤的生長情況  術(shù)中小鼠死亡1例，原位移植瘤模型成功29例，成功率為100。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），提示處理前各組小鼠具有可比性，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組小鼠體重亦無明顯差異（P0.05）。實(shí)驗(yàn)2周后處死并解剖小鼠，各組小鼠肝內(nèi)均可見腫瘤生長，其中1組有1

19、只小鼠肺轉(zhuǎn)移，其余組均未發(fā)現(xiàn)明顯侵犯、種植或轉(zhuǎn)移。腫瘤部位大體解剖示：腫瘤形態(tài)相對規(guī)則，切面呈乳白色，質(zhì)韌，分葉狀，局限，有包膜或包膜不完整；組織切片顯示細(xì)胞成團(tuán)、異型性明顯，可見病理性核分裂像，細(xì)胞排列紊亂，局部區(qū)域可見壞死。與空白對照組相比，DATS納米粒組小鼠原位移植的腫瘤明顯縮小，抑瘤率為45，而空白納米粒組和DATS注射液組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見表1。 表1  各組小鼠原位移植腫瘤抑瘤率及PCNA指數(shù)8    *2.2  PCNA表達(dá)的檢測結(jié)果  免疫組化法檢測PCNA的表達(dá)顯示，空白對照組50以上的腫瘤細(xì)胞P

20、CNA表達(dá)陽性，而且顯示強(qiáng)陽性（鏡下顯示為濃染的深棕黃色細(xì)胞核）者居多，空白納米粒組和DATS注射液組與空白對照組無明顯差異，而DATS納米粒組陽性細(xì)胞則明顯減少（P0.01），且無顯著深染的細(xì)胞核；各組PCNA表達(dá)指數(shù)的差異見表1。采用Western Blot法檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化法的結(jié)果，見圖1。由圖1可見，DATS納米粒組與空白對照組相比，PCNA蛋白表達(dá)明顯降低，而空白納米粒組、DATS注射液組與空白對照組相比無明顯差異，以actin為內(nèi)參照計(jì)算PCNA的相對表達(dá)強(qiáng)度，分析結(jié)果見圖2。由圖2可見，與空白對照組相比，DATS納米粒組PCNA蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.

21、007）。各組原位移植瘤中PCNA、Fas和FasL蛋白的表達(dá)（actin作為內(nèi)參照）    2.3  Fas和FasL蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果  蛋白印跡結(jié)果顯示，各組Fas和FasL蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見圖1。    3  討  論    近年研究顯示，大蒜素具有獨(dú)特的藥理活性，對肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的生長均有明顯抑制作用。目前臨床應(yīng)用的大蒜素制劑主要有膠囊劑和注射劑，但普遍存在生物半衰期短（t1/2=2.32?h）和一定毒副作用等缺點(diǎn)，而

22、且持續(xù)治療易產(chǎn)生耐藥性，理化性質(zhì)不穩(wěn)定。要提高肝癌化療效果的關(guān)鍵則是提高抗癌藥物對癌細(xì)胞及組織、器官的靶向性，降低藥物對正常細(xì)胞、組織和器官的毒副作用。抗癌藥物肝靶向傳輸系統(tǒng)為肝癌的藥物治療提供了一種新的思路和給藥方法。在靶向給藥制劑中，納米粒以其良好的靶向性、穩(wěn)定性、表面易修飾性、釋藥的持續(xù)性、制備工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注8。本研究采用的干預(yù)藥物DATSPBCANP，是以生物可降解型高分子材料聚氰基丙烯酸正丁酯為載體材料，利用現(xiàn)代靶向制劑技術(shù)研制的肝靶向性大蒜素納米粒。前期研究6顯示，DATSPBCANP一方面可以提高大蒜素體內(nèi)穩(wěn)定性、改變體內(nèi)代謝動力學(xué)，使其得以緩慢釋放、延長作用時(shí)間，另一

23、方面可以提高大蒜素對肝癌細(xì)胞作用的靶向性，提高抗癌療效，降低其他臟器的毒副作用，為探索肝臟治療藥物實(shí)現(xiàn)肝靶向給藥具有較高的科學(xué)技術(shù)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。本研究選用小鼠為動物模型，以DATS注射液為對照，研究了DATSPBCANP的體內(nèi)抗癌效應(yīng)。結(jié)果顯示，DATSPBCANP對小鼠原位移植性肝癌有明顯的抗腫瘤效應(yīng)，同時(shí)荷瘤鼠體重?zé)o明顯影響。    人類多種腫瘤移植瘤模型的建立，為人類更好地研究腫瘤的生長和抗腫瘤的藥物篩選提供了理想的工具。皮下移植瘤被認(rèn)為是進(jìn)行腫瘤相關(guān)動物體內(nèi)研究的經(jīng)典模型9，但由于缺乏腫瘤生長的“真實(shí)”的微環(huán)境，仍然存在很多問題。本研究采用的是人肝癌

24、原位移植小鼠動物模型，它不僅維持了原有腫瘤生物學(xué)特性，在宿主體內(nèi)能顯示類似于人類腫瘤體內(nèi)的惡性行為與特征，更加符合人肝癌的生物學(xué)特征。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)隨細(xì)胞周期變化，PCNA的表達(dá)水平可作為估計(jì)細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)10。本研究采用免疫組化和蛋白印記兩種方法顯示，DATS納米粒組小鼠移植瘤中PCNA蛋白表達(dá)較空白對照組明顯降低，而DATS注射液組、空白納米粒組與空白對照組相比無明顯差異，證實(shí)了DATSPBCANP在體內(nèi)可抑制人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，從而降低癌細(xì)胞的增殖能力。DATS注射液對移植瘤的生長無明顯影響，提示DATS可能在體內(nèi)運(yùn)輸過程中被降解代謝，而DATSPBCANP具

25、有肝靶向性，能夠到達(dá)肝臟組織而較少被降解。因此，我們推測，DATS在體內(nèi)遏制肝癌細(xì)胞惡性增殖，可能是抑制腫瘤生長的機(jī)制之一。但Fas和FasL蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果顯示，在各組小鼠移植瘤間無明顯差異，與我們前期體外及體內(nèi)皮下移植瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異5，這可能是大蒜素體內(nèi)外作用機(jī)制差異所致。    我們的系列研究顯示，DATSPBCANP具有明顯的肝臟靶向性，能夠解決大蒜素半衰期短、易降解、缺乏肝組織靶向性等問題，而且能夠顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長，但對其體內(nèi)抗腫瘤的確切機(jī)制及最佳劑量尚需進(jìn)一步探討。    【參考文獻(xiàn)】 

26、1 Xiao D, Lew KL, Kim YA, et al. Diallyl trisulfide suppresses growth of PC3 human prostate cancer xenograft in vivo in association with Bax and Bak inductionJ. Clin Cancer Res, 2006, 12(22):6?8366?843.     2 Xiao D, Li M, HermanAntosiewicz A, et al. Diallyl trisulfide inhibits a

27、ngiogenic features of human umbilical vein endothelial cells by causing Akt inactivation and downregulation of VEGF and VEGFR2J. Nutr Cancer, 2006, 55(1):94107.    3 Xiao D, Choi S, Johnson DE, et al. Diallyl trisulfideinduced apoptosis in human prostate cancer cells involves cJun Nterminal kinase and extracellularsignal regulated kinasemediated phosphorylation of Bcl2J. Oncogene, 2004, 23(13):5?5945?606.    4 鐘 寧, 馬亞兵, 高海青, 等. 大蒜素抑制體外人肝癌細(xì)胞的侵襲能力J. 世界華人消化雜志, 2005, 13(6):743747.    5 Zhang ZM, Zhong