哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞蛋白激酶C活性變化的研究

1、    哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞蛋白激酶C 活性變化的研究        【摘要】目的研究哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞蛋白激酶C(PKC)活性的變化及其與氣流受限程度的關(guān)系。方法從18例哮喘患者和6名正常對(duì)照組的外周靜脈血中分離和純化淋巴細(xì)胞胞漿及胞膜部分PKC, 然后采用同位素-32P-ATP 催化活性測(cè)定法檢測(cè)它們的活性。結(jié)果(1)哮喘患者淋巴細(xì)胞PKC的總活性較健康對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.01),胞膜PKC的活性明顯升高(P<0.05),各哮喘組胞膜部分P

2、KC活性占總活性的百分比值與正常對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)。體外實(shí)驗(yàn)表明,(1)乙酰甲膽堿組(5例)或組胺組(5例)均可明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞胞漿PKC的轉(zhuǎn)位(P<0.05),從而激活PKC；(2)淋巴細(xì)胞PKC的總活性與患者氣流受限的程度有密切關(guān)系。PKC的總活性與一秒鐘用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1占預(yù)計(jì)值）呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.73,P<0.001,18例); 與氣道峰值流速(PEF)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.62,P<0.01,18例);與 50 肺活量時(shí)的用力呼氣流速(50)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.63, P<0.01,18例);(3) 哮喘

3、患者淋巴細(xì)胞PKC 活性與血清可溶性白介素2受體（sIL-2R）濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.58,P<0.05,18例)。結(jié)論(1) 哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞PKC總活性及其活化程度較健康組顯著增強(qiáng),PKC的異常激活可能與炎癥介質(zhì)的釋放增加有關(guān);(2)哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞PKC總活性與氣流受限程度有顯著相關(guān)關(guān)系;(3)PKC 通道可能參與T淋巴細(xì)胞的活化過程。 提示PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在哮喘的發(fā)病機(jī)制中可能具有一定的意義?！娟P(guān)鍵詞】哮喘淋巴細(xì)胞蛋白激酶CThe changes of protein kinase C activity in peripheral blood lymphocyt

4、es in asthmatic patientsLIU Xiansheng, XU Yongjian, ZHANG ZhenxiangDepartment of Respiratory Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan,430030【Abstract】ObjectiveTo investigate changes of protein kinase C (PKC) activities in peripheral blood lymphocytes (PBL) and the relationship bet

5、ween PKC activities and level of the air flow limitation in asthmatic patients. MethodsPKC from cytosolic and membrane fractions of PBL was isolated and purified, then its activities were determined. Results(1) The total PKC activities in PBL in asthmatic subjects (n=18)were significantly increased

6、as compared to those in normal subjects (n=6,P<0.01). More over, the membrane PKC activities and their percentages in the total PKC activities were higher in asthmatics than in normals (P<0.05). In vitro it suggested that methacholine(n=5)or histamine (n=5) could significantly increase translo

7、cation of PKC from cytosol to membrane (P<0.05) and, by doing so,activate the PKC in PBL. (2) The total PKC activities were significantly correlated with FEV1(r=-0.73,P<0.001,n=18),PEF(r=-0.62,P<0.01,n=18)and 50(r=-0.63, P<0.01,n=18). (3) The total PKC activities in PBL were significantl

8、y correlated with the levels of sIL-2R in serum in the asthmatics (r=0.58, P<0.05,n=18). Conclusions(1) The total activities and the level of translocation of PKC were significantly increased in PBL in asthmatics as compared to normals. This abnormal activation state of PKC in PBL may be related

9、with the increased levels of inflammatory mediators. (2) Highly significant correlations existed between the total PKC activities and the level of air flow limitation in asthmatics. (3) PKC signal pathway may be implicated in the activation of T-lymphocytes in asthma. It is suggested that the role o

10、f PKC signal pathway may be important in the pathogenisis of asthma.【Key words】AsthmaLymphocytesProtein kinase C哮喘的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡述清楚。以往的研究認(rèn)為，淋巴細(xì)胞在哮喘氣道慢性炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)及形成過程中有至關(guān)重要的作用1。蛋白激酶C(PKC)通道是近年來發(fā)現(xiàn)的一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道, 研究表明，淋巴細(xì)胞中至少有11種PKC亞型分布,參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的多種生理功能2。但是,有關(guān)哮喘發(fā)病中淋巴細(xì)胞內(nèi)PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其與淋巴細(xì)胞的功能和哮喘病情變化關(guān)系的研究目前尚不多見

11、。我們就該問題進(jìn)行研究, 以探討PKC信號(hào)通道在哮喘發(fā)病中的意義, 為進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。對(duì)象與方法一、對(duì)象哮喘組18例,男10例,女8例,年齡33±6歲, 無吸煙史，受試前至少1個(gè)月內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素，均符合支氣管哮喘診治方案的診治標(biāo)準(zhǔn)3,按照患者的病史及其一秒鐘用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1占預(yù)計(jì)值）,將患者分為3組即：輕度組6例，男2例，女4例， FEV1占預(yù)計(jì)值>80；中度組6例，男4例, 女2例，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值<80或>60; 重度組6例，男4例, 女2例，F(xiàn)EV1占預(yù)計(jì)值<60。其中輕度組為臨床緩解期患者，中、重度組為活

12、動(dòng)期患者，另以6名正常人的外周血作為對(duì)照，男4名，女2名，年齡32±8歲。二、方法PKC活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行4。(1)血樣采集及淋巴細(xì)胞的分離:抽取受試者外周靜脈血10 ml, 置于肝素化(30 IU/ml)的無菌試管中, 以等體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH值為7.4,實(shí)驗(yàn)室自配)稀釋，再加于等體積的淋巴細(xì)胞分離液(上海生物化學(xué)制劑廠)上,1 000 r/min，離心25分鐘,然后用細(xì)胞采集器收集試管中間的一層乳白色的液體即為淋巴細(xì)胞，加入0.85的氯化胺以破碎紅細(xì)胞,繼續(xù)用PBS稀釋洗滌2次,用錐蟲藍(lán)排除法檢測(cè)細(xì)胞的活性>97。(2)粉碎淋巴細(xì)胞:將分離出來的

13、淋巴細(xì)胞懸浮于超聲緩沖液A中,其成分為: 25 mmol/L Tris HCL, 2 mmol/L EGTA, 2 mmol/L EDTA, 2 mmol/L二硫蘇糖醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟,250 mmol/L葡萄糖(以上各種試劑均購(gòu)于武漢華美生物工程公司),在冰浴中,用超聲細(xì)胞粉碎儀(Kontes,美國(guó))粉碎淋巴細(xì)胞,每次持續(xù)30秒,間隔30秒，共處理4次。(3)PKC的提?。篜KC的提取分為胞漿及胞膜兩個(gè)過程。將超聲粉碎后的淋巴細(xì)胞勻漿液經(jīng)超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman, Optima L-90K)超速離心(35 000 r/min 60分鐘,4),取上清液即為胞漿可溶PKC粗提

14、液;沉淀部分中加入含有0.3Triton(辛基苯氧基聚乙氧乙醇)X-100的緩沖液A中,4條件下震蕩60分鐘后,再次離心(35 000 r/min，60分鐘,4),取上清液即為胞膜PKC的粗提液。(4) PKC的純化:將粗提液加入經(jīng)緩沖液平衡后的1 ml DEAE-纖維素柱(美國(guó)Sigma公司)內(nèi), 用4倍體積的緩沖液過柱,洗脫非結(jié)合蛋白,然后用140 mmol/L NaCL緩沖液4 ml洗脫,收集洗脫液待測(cè)。(5)PKC活性的測(cè)定:反應(yīng)液(pH=7.5)的成份：25 mmol/L Tris HCL, 10 mmol/L MgCL2, 0.5 mmol/L CaCl2, 1 g/L組蛋白(-S

15、型,美國(guó)sigma公司),0.06 g/L 磷酯酰絲氨酸(PS,美國(guó)Sigma公司)，0.004 g/L 二酰基甘油(DAG,美國(guó)Sigma公司), 0.1 mmol/L -32P-ATP(北京亞輝生物技術(shù)有限公司),0.2 mg 酶蛋白；反應(yīng)自加入ATP開始,最后加入15的三氯醋酸以終止反應(yīng)；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離底物組蛋白區(qū)帶，測(cè)定32P摻入組蛋白的放射性,計(jì)算出PKC的活性(單位為mol。min-1。g-1),胞漿及胞膜PKC活性均以所測(cè)的實(shí)際活性與未加DAG與PS時(shí)所得的活性之差表示, 細(xì)胞PKC總活性為胞漿及胞膜PKC活性之和。乙酰甲膽堿(Mch)及組織胺(HT)對(duì)淋巴細(xì)

16、胞PKC活性的影響:取5名正常人外周血各2份,按上述的方法,分離出淋巴細(xì)胞,將其懸浮于0.5 ml的Hanks平衡液中, 加入100 nmol/L Mch或者100 nmol/L HT,孵育10分鐘后,2 000 r/min，離心2分鐘，再用PBS沖洗2次,最后測(cè)定細(xì)胞胞漿及胞膜PKC的活性。1.sIL-2R的測(cè)定: 參照文獻(xiàn)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISIA)試驗(yàn)進(jìn)行5。試劑盒由德國(guó)寶靈曼公司提供。2.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:用Lowary法6測(cè)定。3.肺功能的測(cè)定: 采用呼吸功能測(cè)定儀(美能達(dá)AS-300,日本)測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均用±s表示。組間差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05

17、為差異有顯著性。兩組間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。結(jié)果一、正常組及哮喘組PBL中PKC活性的變化與正常對(duì)照組比較，各哮喘組PKC總活性（PKCt）、胞膜PKC活性（PKCm）及胞漿PKC活性（PKCc）均明顯增強(qiáng),其中胞膜PKC占PKC總活性的百分比亦明顯提高(表1)。表1哮喘患者PBL的PKC活性的變化(±s)組別例數(shù) PKCt (mol。min-1。g-1) PKCm(mol。min-1。g-1) PKCc (mol。min-1。g-1)PKCm/PKCt(%)正常對(duì)照組 6 1.3±0.50.10±0.051.17±0.447.6±2.3輕度

18、組 6 2.3±0.60.35±0.201.98±0.5014.7±5.6中度組 6 2.8±0.8*0.53±0.28* 2.31±0.51* 17.7±4.8*重度組 6 4.2±0.9*1.07±0.37*3.14±0.63* 24.9±5.6*注：與正常組比較P<0.05；*P<0.01 表2Mch及HT對(duì)正常對(duì)照組PBL的PKC活性的影響(±s)組別 例數(shù) PKCt (mol。min-1。g-1)PKCm (mol。min-1。g-1)PKCc

19、 (mol。min-1。g-1) PKCm/PKCt(%)正常對(duì)照組6 1.3±0.50.10±0.051.17±0.447.6±2.3正常Mch組5 1.7±0.50.62±0.291.05±0.2536.1±7.3正常HT組5 1.6±0.60.64±0.27 1.00±0.3739.1±5.0注:與對(duì)照組比較P<0.05 二、Mch及HT體外對(duì)正常人PBL中PKC活性的影響體外實(shí)驗(yàn)表明,PBL經(jīng)Mch及HT處理后，其胞膜PKC活性及其占總活性的百分比較對(duì)照組均明顯

20、升高；胞漿PKC活性減弱，但差異無顯著性（P>0.05，表2)。三、哮喘組淋巴細(xì)胞PKC總活性與氣流受限程度的關(guān)系PKC總活性與FEV1占預(yù)計(jì)值呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.73,P<0.001）; 與最大呼氣流量(PEF)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.62,P<0.01); 與50%肺活量時(shí)的用力呼氣流速(50)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.63,P<0.01)。四、哮喘組血清sIL-2R濃度及其與氣流受限程度的關(guān)系輕度哮喘組血清SIL-2R濃度為(289±79)×103 U/L，與正常對(duì)照組(210±55)×103 U/L比較，差異無顯著性(P

21、>0.05)。 中、重度組均明顯升高，分別為(428±54)×103 U/L、(512±130)×103 U/L(P<0.05)。在各組哮喘患者中，血清sIL-2R濃度與FEV1占預(yù)計(jì)值呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.75, P<0.001）;與PEF呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.52,P<0.05）。五、淋巴細(xì)胞PKC總活性與血清sIL-2R濃度的關(guān)系淋巴細(xì)胞PKC總活性與血清sIL-2R濃度之間呈顯著正相關(guān)（r=0.58，P<0.05)。討論P(yáng)KC通道是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道, 以往的研究表明,PKC在哮喘的發(fā)病機(jī)制中可能有重要

22、的意義,如促進(jìn)氣道平滑肌的增生,促進(jìn)氣道粘液的分泌等。但是有關(guān)該通道在哮喘發(fā)病中作用的臨床研究資料尚很少見。本組試驗(yàn)表明，在各哮喘組患者中外周血淋巴細(xì)胞PKC總活性均較正常對(duì)照組明顯升高, 而且與患者肺功能FEV1占預(yù)計(jì)值、PEF及50值均呈顯著負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果從臨床研究的角度提示，PKC通道可能參與哮喘發(fā)病的病理生理過程,外周血淋巴細(xì)胞PKC活性的檢測(cè)在臨床病情的評(píng)估中可能具有一定的參考意義。靜息情況下,PKC大多位于細(xì)胞的胞漿部分,胞膜中含量很少,當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激(如抗原或某些炎癥介質(zhì))之后,胞膜中的磷酯發(fā)生崩解而產(chǎn)生二?；视?DAG),激活胞漿中的PKC,使其從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜,這種轉(zhuǎn)

23、位是PKC活化的重要標(biāo)志7。有研究認(rèn)為, 胞漿中若超過5的PKC轉(zhuǎn)位至胞膜, 便足可提示PKC及淋巴細(xì)胞的活化8。本組試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較,哮喘患者的淋巴細(xì)胞中超過7的胞漿PKC發(fā)生轉(zhuǎn)位,其胞膜PKC活性占細(xì)胞PKC總活性的百分比顯著升高。Bansal等9在研究中也曾得到類似的結(jié)果。該結(jié)果提示哮喘患者淋巴細(xì)胞PKC被激活的程度較正常對(duì)照組明顯提高,進(jìn)一步顯示了PKC通道在哮喘發(fā)病中可能具有的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明,參與哮喘炎癥反應(yīng)的組織胺及乙酰膽堿均可促進(jìn)淋巴細(xì)胞PKC的轉(zhuǎn)位及活化,因此我們推測(cè),患者外周血淋巴細(xì)胞PKC的異?；罨赡芘c哮喘發(fā)病時(shí)炎癥介質(zhì)的釋放增加有關(guān)。但是在哮喘發(fā)病過程中,

24、PKC的這種異常活化與細(xì)胞本身的功能變化是否存在某種聯(lián)系目前尚不明了。為此我們探討了它與血清中sIL-2R的關(guān)系。sIL-2R是一種可溶性的白細(xì)胞介素受體,表達(dá)于外周血T淋巴細(xì)胞后脫落至血清而形成,它是T淋巴細(xì)胞活化的重要標(biāo)志10。在哮喘患者中,血清sIL-2R水平較正常對(duì)照組增高,且與氣道的功能狀態(tài)有密切關(guān)系5,本組試驗(yàn)也證明了這點(diǎn)。結(jié)果表明，PKC的總活性與血清中的sIL-2R水平呈顯著正相關(guān)。提示在哮喘發(fā)病中,PKC可能與T淋巴細(xì)胞的活化有關(guān)。綜上所述,在哮喘發(fā)病中,炎癥介質(zhì)的釋放增多有可能使淋巴細(xì)胞PKC被異常激活,PKC的活性與T淋巴細(xì)胞的活化及患者氣道氣流受限的程度密切相關(guān), 提示

25、PKC信息通道在哮喘的發(fā)病機(jī)制中可能具有重要的意義。繼續(xù)在該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究,對(duì)于從細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)傳導(dǎo)方面闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)而探討新的治療途徑將具有積極意義。志謝中科院水生生物研究所楊仲安、同濟(jì)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室陶德定及同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)生化教研室胡圓圓同志在實(shí)驗(yàn)過程中所提供指導(dǎo)，特致謝作者單位：430030 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科參考文獻(xiàn)1Drazen JF, Turino GM. Progress of the interface of inflammation and asthma. Am J Respir Crit Care Med, 1995, 152:386-387.2劉先勝，徐永健，張珍祥. 蛋白激酶C與淋巴細(xì)胞的功能調(diào)節(jié). 國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，1999，22:105-108.3中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組. 支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療、療效判斷標(biāo)準(zhǔn)及教育和管理方案). 中華結(jié)核和呼吸雜志, 1997,20:261-267.4Vachier I,Chanez P, Radeau T, et al. Cellular protein kinase C activity in asthma. Am J Respir Crit Care Med,1997,155:1211-1216.5Park CS, L