卵蛋白致敏豚鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)

1、    卵蛋白致敏豚鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)        T淋巴細(xì)胞在哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起樞紐作用。哮喘時激活的T淋巴細(xì)胞增加1，白細(xì)胞介素3（IL-3）、IL-5、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子mRNA（GM-CSF mRNA）表達(dá)增強(qiáng)，除了抗原反復(fù)刺激外，與T淋巴細(xì)胞凋亡障礙，生存時間延長可能也有一定的關(guān)系。 目前，已證實(shí)凋亡的發(fā)生是受基因控制，發(fā)現(xiàn)了許多與凋亡有關(guān)的基因。我們的實(shí)驗(yàn)觀察了哮喘豚鼠外周血淋巴細(xì)胞的凋亡及其相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤（b

2、cl-2）、白細(xì)胞介素1轉(zhuǎn)化酶（ICE）的表達(dá)。材料與方法哮喘豚鼠模型：雄性豚鼠400500 g，20只豚鼠隨機(jī)分為哮喘組和對照組， 每組10只。哮喘組在第1天和第8天分別用2% 卵白蛋白（OA）氯化鈉0.5 ml(OA 2 g+0.9%氯化鈉100 ml)+氫氧化鋁凝膠0.5 ml腹腔注射,第21天密閉溶器中霧化吸入2% OA 1小時,或出現(xiàn)哮喘樣發(fā)作為止。對照組按哮喘組的用量和方法用0.9% 生理鹽水取代OA。標(biāo)本留?。悍謩e于激發(fā)后48小時處死動物，取頸動脈血肝素抗凝，沿管壁緩慢加入盛有淋巴細(xì)胞分離液的試管中，1 500 r/min，離心15分鐘，取淋巴細(xì)胞層混懸液，PBS漂洗3次共5分鐘

3、，制成均勻的細(xì)胞涂片，4%多聚甲醛固定30分鐘，-70保存?zhèn)溆?。凋亡?xì)胞的原位末端法（TUNEL）標(biāo)記：凋亡試劑盒購自德國寶靈曼公司，標(biāo)記方法參照說明操作。主要步驟：0.1% 曲通(Triton X-100), 4處理2分鐘, 以增強(qiáng)細(xì)胞的通透性,PBS漂洗3次共5分鐘(下同)。加入由末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），脫氧三磷酸核苷（dNTP）和熒光素標(biāo)記的dNTP組成的混合物每片30 l，37孵育60分鐘，PBS液漂洗，堿性磷酸酶連接的抗熒光素抗體每片30 l，37孵育30分鐘，PBS液漂洗，5-溴-4-氮-3-吲哚-磷酸鹽/硝基四唑氮藍(lán)（BCIP/NBT）顯色，光鏡觀察。即用型鏈酶合素-

4、生物素-酶復(fù)合物(SABC)免疫細(xì)胞化學(xué)染色：(SABC)試劑盒與bcl-2、ICE單克隆抗體均購自武漢博士德公司（丹麥DAKO產(chǎn)）。染色方法參照說明書，主要步驟：甲醇-H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15分鐘，PBS液漂洗，0.1% Triton X-100、室溫15分鐘，20% 小牛血清封閉非特異著色；分別加bcl-2（150）、ICE（150）單克隆抗體每片20 l，37、30分鐘，然后4過夜，PBS液漂洗；加生物素化的羊抗小鼠IgG，每片30 l，37、30分鐘，PBS液漂洗；加即用型SABC試劑，37、30分鐘；3，3-二氨基聯(lián)苯胺四酸鹽(DAB)顯色，部分蘇木素復(fù)染，光鏡觀察。結(jié)果觀察

5、：TUNEL染色和bcl-2、ICE免疫細(xì)胞化學(xué)染色，每例涂片在高倍（×400）鏡下隨機(jī)選擇10個視野，計(jì)算凋亡陽性細(xì)胞的平均百分率和免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性率。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：百分率以±s表示，采用非配對資料t檢驗(yàn)和相關(guān)分析，P<0.05為相異有顯著性。結(jié)果染色結(jié)果：凋亡細(xì)胞呈棕褐色，正常淋巴細(xì)胞著色很淺，高倍鏡下染色主要在核膜（1，2）。bcl-2陽性信號呈棕黃色，定位于胞漿、核膜（3，4），ICE陽性信號定位于胞漿和細(xì)胞核（5，6）。淋巴細(xì)胞凋亡率：哮喘組為(3.5±1.0)% ，對照組為（6.8±1.5）% ，哮喘組顯著低于對照組（P<0.0

6、1）。bcl-2、ICE基因蛋白表達(dá)：bcl-2哮喘組顯著高于對照組（P<0.05）;ICE表達(dá)哮喘組低于對照組(P<0.05)。討論細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)存在的一種普遍現(xiàn)象，對維持組織細(xì)胞的平衡起著重要的作用。研究表明，哮喘發(fā)作時患者外周血T淋巴細(xì)胞處于活化狀態(tài)，其活化程度除了與活化產(chǎn)物水平及病情轉(zhuǎn)歸有密切相關(guān)外，與淋巴細(xì)胞凋亡障礙，生存時間延長可能也有一定關(guān)系1。Zhang等2比較了小鼠T輔助淋巴細(xì)胞Th1和Th2亞群受到抗原刺激后凋亡的變化，當(dāng)Th1和Th2共同培養(yǎng)時，Th2存活時間長于Th1。由此推測，支氣管哮喘時Th2的存活時間也可能延長，從而分泌更多細(xì)胞因子。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

7、明，哮喘豚鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組，提示哮喘時外周血淋巴細(xì)胞凋亡降低，與以上結(jié)果一致。Bcl-2是一種凋亡抑制基因，與多種細(xì)胞的凋亡抑制密切相關(guān)3。Vanx等4報告了bcl-2基因可以阻止淋巴細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。近年來發(fā)現(xiàn)，ICE在細(xì)胞死亡通路處于重要位置，細(xì)胞外的死亡信息與細(xì)胞表面Fas結(jié)合，傳入細(xì)胞內(nèi)，ICE被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，它的激活使細(xì)胞內(nèi)蛋白水解，導(dǎo)致DNA片段產(chǎn)生，細(xì)胞發(fā)生凋亡5，關(guān)于ICE在哮喘方面的研究較少。本組結(jié)果表明，哮喘豚鼠外周血淋巴細(xì)胞存在凋亡抑制， 而其凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)增高、ICE表達(dá)降低，可能在哮喘淋巴細(xì)胞凋亡中起重要作用。1哮喘組外周血

8、淋巴細(xì)胞凋亡，原位末端標(biāo)記法BCIP/NBT顯色×2002對照組外周血淋巴細(xì)胞凋亡，原位末端標(biāo)記法BCIP/NBT顯色×2003哮喘組外周血淋巴細(xì)胞bcl-2表達(dá)，免疫組化檢測對氨基聯(lián)苯胺顯色×4004對照組外周血淋巴細(xì)胞bcl-2表達(dá)，免疫組化檢測對氨基聯(lián)苯胺顯色×2005哮喘組外周血淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素1 轉(zhuǎn)化酶表達(dá)，免疫組化檢測對氨基聯(lián)苯胺顯色×2006對照組外周血淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素1 轉(zhuǎn)化酶表達(dá)免疫組化檢測對氨基聯(lián)苯胺顯色×200作者單位：075000 張家口，北京軍區(qū)第二五一醫(yī)院干部病房（郭曉明）；第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸病研

9、究所重慶，400037（王長征、錢桂生)(本文16見插頁第44頁)參考文獻(xiàn)1Corrigan CJ, Kay AB.CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Am Rve Respir Dis，1990，141:970.2Zhang X,Bvuner T,Carter L,et al. Unreal death in thelper cell (Th1) and Th2 effectors.Th1 but not Th2 effectorsundergo fas/fas l-mediated apoptosis. J EXP Med , 1997, 185: 1837.3Woolley KL, Gibson PG, Carty K, et al. Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma.Am J Respir Crit Care Med,1996，154:337.4VauxDBcl-2 initiates a new categorg of