激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳法優(yōu)化隨機(jī)寡核苷酸文庫聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增講解

1、激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳法優(yōu)化隨機(jī)寡核苷酸文庫 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的條件11-04-22 13:25:00 編輯：studa20作者：季穎王清清付潔高新宋海峰【摘要】寡核苷酸文庫的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增是指數(shù)富集系統(tǒng)配基進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選適配子技術(shù)中的重要步驟。本研究采用毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合激 光誘導(dǎo)熒光檢測器(CE LIF)，通過對雙鏈產(chǎn)物、PCF副產(chǎn)物以及剩余引物的 考察，研究了寡核苷酸文庫PCR擴(kuò)增時的影響因素，并對其進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表 明，隨機(jī)寡核苷酸文庫的擴(kuò)增與傳統(tǒng)均一模板的擴(kuò)增顯著不同，其在擴(kuò)增十幾 個循環(huán)時產(chǎn)物就達(dá)到最大值；此外，初始模板數(shù)、退火溫度、DNA聚合酶濃度等 條件

2、也有所不同。因此，在進(jìn)行SELEX篩選之前必須對文庫PCR條件進(jìn)行詳細(xì)優(yōu)化。本研究中N39文庫優(yōu)化后的PCRT增條件為：初始模板的量為105個分 子，DNA聚合酶濃度0.05 U/卩L,退火溫度70 C, 18個循環(huán)。本研究為利用 SELEX術(shù)有效篩選適配子，降低篩選的假陽性及提高特異性提供了參考依 據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】毛細(xì)管電泳；指數(shù)富集系統(tǒng)配基進(jìn)化技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；寡核苷酸文庫；適配子核酸適配子(Aptamers)是從大量的組合化學(xué)庫中篩選出的短鏈寡核苷酸， 它具有靶分子范圍廣、穩(wěn)定性好、親和力高等特點，從親和分析到疾病診斷與 治療方面，為自然科學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域帶來了革命性進(jìn)展1,2 o目前

3、用于治療老年性黃斑退行性病變第一個適配子藥物Macugen已于2004年獲得了美國FDA批準(zhǔn)3 o篩選適配子的經(jīng)典方法是指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment， SELEX) 主要有 3 個關(guān)鍵步驟：隨機(jī)寡核苷酸文庫的設(shè)計合成、結(jié)合適配子與未結(jié)合適配子的分離和 結(jié)合適配子的PCRT增。文庫PCR過程中非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)是一個普遍的現(xiàn) 象，而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增條件的特異性決定了 SELE)技術(shù)篩選與靶蛋白特異性結(jié)合的適配子假陽性的高低

4、，因此結(jié)合 適配子的PCRT增是SELEX技術(shù)篩選的關(guān)鍵。目前，分析 PCRT增產(chǎn)物的主要 方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳4和瓊脂糖凝膠電泳5，通過電泳條帶的數(shù)目和 深淺判斷PCF條件的優(yōu)劣，對擴(kuò)增片段大小的判斷并不十分準(zhǔn)確。禾U用毛細(xì)管 電泳技術(shù)定性和定量分析核酸類物質(zhì)是近幾年的分析工作者研究熱點，毛細(xì)管 電泳(Capillary electrophoresis, CE)分析具有準(zhǔn)確、精確、靈敏和重現(xiàn)性好的特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于PCRT物的定量分析69 o本研究采用毛細(xì)管電泳技術(shù)優(yōu)化隨機(jī)寡核苷酸文庫PCF條件，如PCR循環(huán)次數(shù)、初始模板分子數(shù)、DNA聚合酶濃度以及退火溫度等，并將其與均一模板 的擴(kuò)增

5、條件的異同進(jìn)行比較。實驗發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸文庫與均一模板的PCFT增方式明顯不同。在考察初始模板分子數(shù)對文庫PCF擴(kuò)增的影響時發(fā)現(xiàn)，初始模板分子數(shù)對文庫的PCF擴(kuò)增影響顯著，提示文庫的隨機(jī)性不同擴(kuò)增條件也有所 差別，所以在進(jìn)行SELEX篩選之前一定要對文庫的PCF擴(kuò)增進(jìn)行優(yōu)化。2實驗部分2.1儀器與試劑P/ACE MD（毛細(xì)管電泳儀（美國Beckman公司），配有激光誘導(dǎo)熒光檢測器 （LIF）;Beckman MDQ毛細(xì)管電泳儀，配488 nm氬離子激光誘導(dǎo)熒光檢測器，激 發(fā)波長/發(fā)射波長為488/520 nm;未涂層熔融石英毛細(xì)管（50 cm（有效分離長 度）/60.2 cm（總長度）X 75卩

6、m內(nèi)徑，河北永年光纖廠）;MJ Optic on chromo 4熒光定量PCR儀（美國BioRad公司）。TaqDNAK合酶、PCR緩沖液、dNTP（TaKaR公司）。DNA隨機(jī)寡核苷酸文庫 及引物由上海生工合成，并經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 （PAGE純化。所有緩沖液均 使用去離子水配制，并用0.22卩m濾膜過濾。2.2實驗方法2.2.1 PCR 擴(kuò)增 設(shè)計合成隨機(jī) DNA文庫10 5 CTTCTGCCCGCCTCCTTCC （N39） GGAGACGAGATAGGCGGAGACJ 80 nt 的均一模板：5CTTCTGCCCGCCTCCTTCCGGGAGGACGATGCGGATCAGCCATG

7、TTTACGTCACTCCTGGAGAC AGGCGGACACT3 PCR 5端弓I物：5 FAM CTTCTGCCCGCC TCC TCC3，其中熒光素標(biāo)記以便毛細(xì)管電泳檢測;3 端引物：5 AGTGTCCGCCTATCTC GTCTCC。PCR混合液（1.25 mmol/L MgCI2 ，10 mmol/L TrisHCI, 50 nmol/L KCl ，250 卩 mol/L dNTP，5 U/ 卩 L Taq DNA聚合酶，一定濃度的模板和引物）。PCR最終條件模板的量為6X 105個分子， 引物的量為6 pmol，DNA聚合酶的濃度為0.05 U/卩L。PCRT增條件：94 C 預(yù)變

8、性5 min;94 C變性10 s;70 C退火10 s;72 C延伸10 s;最終72 C延 伸5 min;18個循環(huán)。PCR反應(yīng)后，PCR昆合物用于CE分離檢測。2.2.2毛細(xì)管電泳條件 分離溫度：25 C ;進(jìn)樣方式：壓力進(jìn)樣（2.07 kPa）; 進(jìn)樣時間：5 s。25 mmol/L硼酸鈉電泳緩沖液（pH 9.4）。新毛細(xì)管活化條件： 1 mol/L NaOH活化30 min。每天實驗之前，毛細(xì)管沖洗條件：1 mol/L HCl ， H2O 1 mol/L NaOH，H2O依次沖洗3 min。分離前，毛細(xì)管淋洗條件：0.5 mol/L NaOH、H2O電泳緩沖液順序淋洗3 min。分析

9、化學(xué)第38卷第5期 季 穎等：激光誘導(dǎo)熒光毛細(xì)管電泳法優(yōu)化隨機(jī)寡核苷酸文庫聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增 的條件3結(jié)果與討論3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出峰位置的確定本實驗采用的毛細(xì)管電泳分離模式是自由區(qū)帶電泳（C apillary zoneelectrophoresis, CZE），其分離的機(jī)理是基于被分離物質(zhì)的凈電荷與其質(zhì)量比 間的差異;而CZE與瓊脂糖凝膠電泳的不同之處在于 CZE不僅和被分離物質(zhì)長度 有關(guān)還與其所帶電荷有關(guān)。切膠回收后的CE分離有助于快速確定了雙鏈產(chǎn)物的出峰位置（圖1中峰2）。圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳分離圖（A）和1%瓊脂 糖凝膠電泳分離圖（B）A，B，C分別為，圖1B切膠回收產(chǎn)物

10、的分離圖、PCR產(chǎn)物、引物；峰1，2，3分別為引物、產(chǎn)物 dsDNA 副產(chǎn)物（A, B, C was chromatogram of agarose gel recovered products, PCR products and primer respectively.Peak 1,2, 3 was identified as primer, dsDNA products andl?y iroduc-.s，respectively）.非特異性擴(kuò)增是PCR過程中經(jīng)常遇到的問題，對于均一模板而言，隨著初 始模板濃度的下降，達(dá)到產(chǎn)物最大量時非特異擴(kuò)增增加顯著11。本研究中PCRT增總長為80 nt

11、的隨機(jī)寡核苷酸文庫，引物利于對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。在毛細(xì)管分離擴(kuò)增產(chǎn)物時觀察到一個展寬較嚴(yán)重的峰（圖1中峰3），但隨機(jī)文庫模板數(shù)的降低（109103），此峰的豐度變化并不顯著。 Musheev等10發(fā)現(xiàn)對于隨機(jī)的寡核苷酸文庫進(jìn)行 PCRT增時，當(dāng)引物的量還 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于產(chǎn)物時，產(chǎn)物的形成便開始停止；但隨著循環(huán)次數(shù)的增加，產(chǎn)物開始 向另一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，Michael稱其為副產(chǎn)物。本研究將這個類似于文獻(xiàn)中擴(kuò)增情 況的PCRT物稱為“副產(chǎn)物”。3.2隨機(jī)寡核苷酸文庫PCFT增特點對常規(guī)PCRJT增而言，產(chǎn)物量一般隨擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)增加而增加，但本研究 卻發(fā)現(xiàn)隨機(jī)寡核苷酸文庫擴(kuò)增的dsDNA產(chǎn)量并不是逐漸增加的，而

12、是隨著循環(huán) 次數(shù)的增加呈先增加后減少的趨勢。PCRT增到達(dá)18個循環(huán)時（圖2B），dsDNA產(chǎn)量接近最高，同時有少量副產(chǎn)物的出現(xiàn)；繼續(xù)增加PCR循環(huán)次數(shù)，產(chǎn)物的量 不增加而副產(chǎn)物的量明顯增加。同樣PCRT增條件下與文庫長短相同的80 ntssDNA均一模板的擴(kuò)增情況完全不同（圖2A）。隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)增加dsDNA的 量也逐步增加的，在實驗考察的循環(huán)次數(shù)范圍內(nèi)，30多個循環(huán)時產(chǎn)量最高，而此時未見副產(chǎn)物出現(xiàn)。RSD20%（n=3）起始模板分子數(shù)為105，DNA聚合酶濃度為0.05 uints/卩L,退火溫度為70 C。毛細(xì)管電泳條件如 2.2.2所述（The initial nu mber of

13、 template molecules was 105, the concen trati on of Taq DNA polymerase was 0.05 un its per microliters, the ann eali ng temperature was 70 C , and conditions of CE were described in Section 2.2.2）。3.3隨機(jī)寡核苷酸文庫pcrT增副產(chǎn)物的形成機(jī)制關(guān)于隨機(jī)寡核苷酸文庫副產(chǎn)物的形成機(jī)制已有報道。楊清武等12用PCR過量富集寡核苷酸文庫時發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳條有彌散的現(xiàn)象，并出現(xiàn)在產(chǎn)物條帶之后，這

14、就提示副產(chǎn)物要比產(chǎn)物的鏈長。Drabovich等13利用單鏈結(jié)合蛋白分析隨機(jī)文庫 PCRT增產(chǎn)物的組成，其電泳結(jié)果表明單鏈結(jié) 合蛋白存在的時候，引物與副產(chǎn)物的色譜峰都向前移，說明副產(chǎn)物中存在單鏈DNA隨機(jī)文庫PCRT增形成副產(chǎn)物的機(jī)制與均一模板PCRT增形成非特異性產(chǎn)物的機(jī)制不同10。均一模板PCRT增形成的非特異產(chǎn)物主要是引物二聚體， 并隨著循環(huán)次數(shù)緩慢積累，形成相同數(shù)量的產(chǎn)物所需要的循環(huán)次數(shù)隨著初始模 板濃度的增加而減少，因此形成非特異產(chǎn)物的量隨著初始模板量的增加而減 少。隨機(jī)文庫PCRT增的副產(chǎn)物是，其是產(chǎn)物與產(chǎn)物之間的雜交。當(dāng)dsDNA產(chǎn)物達(dá)到一定量時便開始形成(圖2B)。同時，初始模

15、板的濃度對隨機(jī) 寡核苷酸文庫的PCR副產(chǎn)物的產(chǎn)量影響較大。初始模板分子數(shù)從1X105增加到1X 109時，副產(chǎn)物的變化非常明顯(圖3)。但文獻(xiàn)10報道，當(dāng)增加初始模板 的量時，副產(chǎn)物的增加并不明顯。圖3初始模板的分子數(shù)對ssDNA文庫PCFT增產(chǎn)物的影響Fig.3 In flue nee of the nu mber of in itial template molecules onthe mc.ximi.im yield of products cind corresponcing yield of by proclucts for PCR amplification of ssDNA libraryRSD20%(n=3)初始模板的量為 6X 1036X 109,引物用量6 pmol，DNA聚合酶濃度為0.05 uints/卩L,退火溫度為58 C, PCR循環(huán)次數(shù)為18。毛細(xì) 管電泳條件如 2.2.2 所述(The number of initial template molecules was 6X 1036X 109, the amount of primers was 6 pmol, th