實(shí)驗(yàn)室常用試劑、緩沖液的配制方法_圖文

1、 實(shí)驗(yàn)室常用試劑、緩沖液的配制方法1 M Tris-HCl(pH7.4, 7.6, 8.0 組份濃度配制量 配制方法 1 M Tris-HCl 1 L 1. 稱量121.1 g Tris置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?3. 按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需要的pH 值。 4. 將溶液定容至1 L。5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。注意：應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH 值，因?yàn)門ris 溶液的pH 值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1，溶液的pH 值大約降低0.03個(gè)單位。1.5 M Tris-HCl(pH8.8 組份濃度配制量 配制方法 1.5 M Tris-H

2、Cl 1 L 1. 稱量181.7 g Tris置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?3. 用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至8.8。4. 將溶液定容至1 L。5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。注意：應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH 值，因?yàn)門ris 溶液的pH 值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1，溶液的pH 值大約降低0.03個(gè)單位。10×TE Buffer(pH7.4, 7.6, 8.0 組份濃度配制量 配制方法 100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA 1 L 1. 量取下列溶液，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，

3、均勻混合。3. 將溶液定容至1 L后，高溫高壓滅菌。4. 室溫保存。3 M 醋酸鈉(pH5.2 組份濃度配制量 配制方法 PBS Buffer 組份濃度配制量 配制方法 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO 4, 2 mM KH2PO 4 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 滴加濃鹽酸將pH 值調(diào)節(jié)至7.4，然后加入去離子水將溶液定容至1 L。4. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。注意：上述PBS Buffer中無二價(jià)陽離子，如需要，可在配方中補(bǔ)充1 mM CaCl2和0.5 mM Mg

4、Cl2。10 M 醋酸銨 組份濃度配制量 配制方法 10 M 醋酸銨100 ml 1. 稱量77.1 g醋酸銨置于100200 ml燒杯中，加入約30 ml的去離子水?dāng)嚢枞芙狻?2. 加去離子水將溶液定容至100 ml。 3. 使用0.22 m 濾膜過濾除菌。4. 密封瓶口于室溫保存。注意：醋酸銨受熱易分解，所以不能高溫高壓滅菌。Tris-HCl 平衡苯酚 配制方法 1. 使用原料：大多數(shù)市售液化苯酚是清亮無色的，無需重蒸餾便可用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。但有些液化苯酚呈粉紅色或黃色，應(yīng)避免使用。同時(shí)也應(yīng)避免使用結(jié)晶苯酚，結(jié)晶苯酚必須在160對(duì) 其進(jìn)行重蒸餾除去諸如醌等氧化產(chǎn)物，這些氧化產(chǎn)物可引起磷酸

5、二酯鍵的斷裂或?qū)е翿NA 和DNA 的交聯(lián)等。因此，苯酚的質(zhì)量對(duì)DNA 、RNA 的提取極為重要，我們推薦使用高質(zhì)量的苯酚進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。2. 操作注意：苯酚腐蝕性極強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù)鏡等。所有操作均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，與苯酚接觸過的皮膚部位應(yīng)用大量水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。3. 苯酚平衡：因?yàn)樵谒嵝詐H 條件下DNA 分配于有機(jī)相，因此使用苯酚前必須對(duì)苯酚進(jìn)行平衡使其pH 值達(dá)到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下： 液化苯酚應(yīng)貯存于-20，此時(shí)的苯酚呈結(jié)晶狀態(tài)。從冰柜中取出的苯酚首先在室溫下放置使其達(dá)到室溫，然后在68水浴中使苯酚充分融解。 加入羥基喹啉（8

6、-Quinolinol ）至終濃度0.1%。該化合物是一種還原劑、RNA 酶的不完全抑制劑及金屬離子的弱螯合劑，同時(shí)因其呈黃色，有助于方便識(shí)別有機(jī)相。 加入等體積的1 M Tris-HCl（pH8.0，使用磁力攪拌器攪拌15分鐘，靜置使其充分分層后，除去上層水相。 重復(fù)操作步驟。 加入等體積的0.1 M Tris-HCl（pH8.0，使用磁力攪拌器攪拌15分鐘，靜置使其充分分層后，除去上層水相。 重復(fù)操作步驟，稍微殘留部分上層水相。 使用pH 試紙確認(rèn)有機(jī)相的pH 值大于7.8。 將苯酚置于棕色玻璃瓶中4避光保存。苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1 配制方法 1. 說明：從核酸樣品中除

7、去蛋白質(zhì)時(shí)常常使用苯酚/氯仿/異戊醇（25 : 24 : 1。氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離，而異戊醇則有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的氣泡。 2. 配制方法：將Tris-HCl 平衡苯酚與等體積的氯仿/異戊醇（24 : 1）混合均勻后，移入棕色玻璃瓶中4保存。10% (W/V SDS 2 N NaOH 組份濃度配制量 配制方法 2 N NaOH 100 ml 1. 量取80 ml去離子水置于100200 ml塑料燒杯中（NaOH 溶解過程中大量放熱，有可能使玻 璃燒杯炸裂。 2. 稱取8 g NaOH小心地逐漸加入到燒杯中，邊加邊攪拌。3. 待NaOH 完全溶解后，用去離子水將溶液體

8、積定容至100 ml。4. 將溶液轉(zhuǎn)移至塑料容器中后，室溫保存。2.5 N HCl 組份濃度配制量 配制方法 2.5 N HCl 100 ml 1. 在78.4 ml的去離子水中加入21.6 ml的濃鹽酸（11.6 N，均勻混合。 2. 室溫保存。 5 M NaCl 組份濃度配制量 配制方法 5 M NaCl 1 L 1. 稱取292.2 g NaCl置于1 L燒杯中，加入約800 ml的去離子水后攪拌溶解。 2. 加去離子水將溶液定容至1 L后，適量分成小份。 3. 高溫高壓滅菌后，4保存。20% (W/V Glucose 組份濃度20% (W/V Glucose 配制量配制方法 100 m

9、l 1. 稱取20 g Glucose置于100200 ml燒杯中，加入約80 ml的去離子水后，攪拌溶解。2. 加去離子水將溶液定容至100 ml。 3. 高溫高壓滅菌后，4保存。Solution I(質(zhì)粒提取用 組份濃度配制量 配制方法 25 mM Tris-HCl（pH8.0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose1 L 1. 量取下列溶液，置于1 L燒杯中。 2. 高溫高壓滅菌后，4保存。3. 使用前每50 ml的Solution I 中加入2 ml的RNase A（20 mg/ml。Solution II(質(zhì)粒提取用 組份濃度配制量 配制方法 Solution III(

10、質(zhì)粒提取用 組份濃度配制量 配制方法 3 M KOAc, 5 M CH3COOH 500 ml 1. 稱量下列試劑，置于500 ml燒杯中。 2. 加入300 ml去離子水后攪拌溶解。3. 加去離子水將溶液定容至500 ml。4. 高溫高壓滅菌后，4保存。0.5 M EDTA(pH8.0 組份濃度配制量 配制方法 0.5 M EDTA 1 L 1. 稱取186.1 g Na2EDTA ·2H 2O ，置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢琛?3. 用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.0（約20 g NaOH。注意：pH 值至8.0時(shí)，EDTA 才能完全溶解。4.

11、加去離子水將溶液定容至1 L。5. 適量分成小份后，高溫高壓滅菌。6. 室溫保存。1 M DTT 組份濃度配制量 配制方法 1 M DTT 20 ml 1. 稱取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料離心管內(nèi)。 2. 加20 ml的0.01 M NaOAc（pH5.2，溶解后使用0.22 m 濾器過濾除菌。 3. 適量分成小份后，-20保存。10 mM ATP 組份濃度配制量 配制方法 10 mM ATP 20 ml 1. 稱取121 mg Na2ATP ·3H 2O ，加入到50 ml塑料離心管內(nèi)。 2. 加20 ml的25 mM Tris-HCl（pH8.0，攪拌溶解。 3.

12、 適量分成小份后，-20保存。 蛋白質(zhì)電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法30% (W/VAcrylamide 組份濃度配制量 配制方法 30%（W/V）Acrylamide 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加去離子水將溶液定容至1 L，用0.45 m 濾膜濾去雜質(zhì)。4. 于棕色瓶中4保存。注意：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性，配制時(shí)應(yīng)戴手套等。聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)橛锌赡芎猩倭康奈淳酆铣煞荨?0% (W/VAcrylamide 組份濃度配制量 配制方法 40%（W/V）A

13、crylamide 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加去離子水將溶液定容至1 L，用0.45 m 濾膜濾去雜質(zhì)。4. 于棕色瓶中4保存。注意：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性，配制時(shí)應(yīng)戴手套等。聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)橛锌赡芎猩倭康奈淳酆铣煞荨?0% (W/V 過硫酸銨 組份濃度配制量 配制方法 5×Tris-Glycine Buffer (SDS-PAGE電泳緩沖液 組份濃度配制量 配制方法 0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%

14、（W/V）SDS 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，攪拌溶解。3. 加去離子水將溶液定容至1 L后，室溫保存。5×SDS-PAGE Loading Buffer5 ml 1. 量取下列試劑，置于10 ml塑料離心管中。 2. 加去離子水溶解后定容至5 ml。3. 小份（500 l/份）分裝后，于室溫保存。4. 使用前將25 l 的2-ME 加到每小份中。5. 加入2-ME 的Loading Buffer可在室溫下保存一個(gè)月左右。組份濃度配制量 配制方法 0.1%（W/V）考馬斯亮藍(lán)R-250, 25%（V/V） 異丙醇, 10%（V/

15、V） 冰醋酸1 L 1. 稱取1 g考馬斯亮藍(lán)R-250，置于1 L燒杯中。 2. 量取250 ml的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。 3. 加入100 ml的冰醋酸，攪拌均勻。4. 加入650 ml的去離子水，攪拌均勻。5.用濾紙除去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。組份濃度配制量 配制方法 10%（V/V）醋酸, 5%（V/V）乙醇 1 L 1. 量取下列溶液，置于1 L燒杯中。 2. 充分混合后使用。組份濃度配制量 配制方法 組份濃度配制量 配制方法 組份濃度配制量 配制方法 0.4%（W/V）AgNO 3, 1%（V/V）濃NH 3·H 2O, 0.04%（W/V）NaOH 100 ml

16、 1. 量取下列試劑，加入100200 ml的試劑瓶中。 2. 均勻混合。該溶液應(yīng)為無色透明狀。如氨水濃度過低時(shí)溶液會(huì)呈混濁狀，此時(shí)應(yīng)補(bǔ)加濃氨水,直至透明。3. 本染色液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，不宜保存。組份濃度配制量 配制方法 0.005%（W/V）檸檬酸, 0.02%（V/V）甲醛1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L試劑瓶中。 2. 加入1 L去離子水后，搖動(dòng)混合溶解。3. 室溫保存。 核酸電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法50×TAE Buffer(pH8.5 組份濃度配制量 配制方法 2 M Tris-醋酸, 100 mM EDTA1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒

17、杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加入57.1 ml的醋酸，充分?jǐn)嚢琛?. 加去離子水將溶液定容至1 L后，室溫保存。10×TBE Buffer(pH8.3 組份濃度配制量 配制方法 10×MOPS Buffer 組份濃度配制量 配制方法 200 mM MOPS, 20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 1 L 1. 稱量41.8 g MOPS，置于1 L燒杯中。 2. 加約700 ml DEPC處理水，攪拌溶解。 3. 使用2 N NaOH調(diào)節(jié)pH 值至7.0。4. 再向溶液中加入下列試劑。 5. 用DEPC 處理水將溶液定容至1 L。6. 用

18、0.45 m 濾膜過濾除去雜質(zhì)。7. 室溫避光保存。注：溶液見光或高溫滅菌后會(huì)變黃。變黃時(shí)也可使用，但變黑時(shí)不要使用。組份濃度配制量 配制方法 10 mg/ml 溴乙錠100 ml 1. 稱量1 g 溴乙錠，加入到100 ml容器中。 2. 加入去離子水100 ml，充分?jǐn)嚢钄?shù)小時(shí)完全溶解溴乙錠。 3. 將溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存。4. 溴乙錠的工作濃度為0.5 g/ml。注意：溴乙錠是一種致癌物質(zhì)，必須小心操作。配制方法 1. 配制適量的電泳及制膠用的緩沖液（通常是0.5×TBE 或1×TAE 。2. 根椐制膠量及凝膠濃度，準(zhǔn)確稱量瓊脂糖粉，加入適當(dāng)?shù)腻F形瓶中。

19、3. 加入一定量的電泳緩沖液（總液體量不宜超過錐形瓶的50%容量。注：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。4. 在錐形瓶的瓶口上蓋上保鮮膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時(shí),當(dāng)溶液沸騰后，請(qǐng)戴上防熱手套，小心搖動(dòng)錐形瓶，使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復(fù)數(shù)次，直至瓊脂糖完全溶解。必須注意，在微波爐中加熱時(shí)間不宜過長，每次當(dāng)溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱，否則會(huì)引起溶液過熱暴沸，造成瓊脂糖凝膠濃度不準(zhǔn)，也會(huì)損壞微波爐。溶解瓊脂糖時(shí)，必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。5. 使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴乙錠溶液（終濃度0.5 g/ml,并充分

20、混勻。注：溴乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴好手套。6. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3 5 mm之間。7. 在室溫下使膠凝固（大約30分鐘 1小時(shí)，然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。注：凝膠不立即使用時(shí)，請(qǐng)用保鮮膜將凝膠包好后在4下保存，一般可保存25天。 瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA 的最佳分辨范圍 6×Loading Buffer (DNA電泳用組份濃度配制量 配制方法 10×Loading Buffer (RNA電泳用組份濃度配制量 配制方法 10 ml 1. 稱量下列試劑，置于10 ml離心管中。 2. 向離心管中加入

21、約4 ml的DEPC 處理水后，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加入5 ml的甘油（Glycerol ）后，充分混勻。4. 用DEPC 處理水定容至10 ml后，室溫保存。 核酸、蛋白質(zhì)雜交用相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法20×SSC 組份濃度配制量 配制方法 3.0 M NaCl, 0.3 M 檸檬酸鈉1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 滴加14 N HCl，調(diào)節(jié)pH 值至7.0后，加去離子水將溶液定容至1 L。4. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。20×SSPE Buffer 組份濃度配制量 配制方法 3.0 M N

22、aCl, 0.2 M NaH2PO 4, 0.02 M EDTA 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至7.4（約6.5 ml的10 N NaOH。4. 加去離子水將溶液定容至1 L。5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。50×Denhardt's 溶 液 500 ml 1. 稱量下列試劑，置于500 ml燒杯中。 2. 加去離子水約400 ml，充分?jǐn)嚢枞芙?. 加去離子水將溶液定容至500 ml。4. 用0.45 m 濾膜過濾后，分裝成每份25 ml。5. -20保存。組份濃度配

23、制量 配制方法 0.5 M Na2HPO 4 1 L 1. 稱量134 g Na2HPO 4·7H 2O 置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水充分?jǐn)嚢枞芙狻?3. 加入85%的H 3PO 4（濃磷酸）調(diào)節(jié)溶液pH 值至7.2。4. 加去離子水定容至1 L。5. 高溫高壓滅菌后，室溫保存。組份濃度配制量 配制方法 10 mg/ml Salmon DNA 約100 ml 1. 稱取鮭魚精DNA 2 g置于500 ml燒杯中，加入約200 ml的TE Buffer。 2. 用磁力攪拌器室溫?cái)嚢?4小時(shí)，溶解后加入4 ml的5 M NaCl，使其終濃度為0.1 M。 3.

24、用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。4. 回收水相溶液后，使用17號(hào)皮下注射針頭快速吸打溶液約20次，以切斷DNA 。5. 加入2倍體積的預(yù)冷乙醇進(jìn)行乙醇沉淀。6. 離心回收DNA 后，溶解于100 ml的去離子水中，測定溶液的OD 260值。7. 計(jì)算溶液的DNA 濃度后，稀釋DNA 溶液至10 mg/ml。8. 煮沸10分鐘后，分裝成小份（1 ml/份。-20保存。9. 使用前在沸水浴中加熱5分鐘后，迅速冰浴冷卻。組份濃度配制量 配制方法 100 ml 1. 稱量下列試劑，置于200 ml燒杯中。 2. 充分混勻后，使用0.45 m 濾膜濾去雜質(zhì)后使用。 100 ml 1. 稱量下列試劑，置于2

25、00 ml燒杯中。 2. 充分混勻后，使用0.45 m 濾膜濾去雜質(zhì)后使用。組份濃度配制量 配制方法 39 mM Glycine, 48 mM Tris, 0.037% (W/V SDS, 20% (V/V 甲醇 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加去離子水將溶液定容至800 ml后，加入200 ml的甲醇。 4. 室溫保存。組份濃度配制量 配制方法 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05%（V/V）Tween 20 1 L 1. 稱量下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 向燒杯中加入約80

26、0 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加入0.5 ml Tween 20后充分混勻。4. 加去離子水將溶液定容至1 L后，4保存。組份濃度配制量 配制方法 5%（W/V）脫脂奶粉/TBST Buffer 100 ml 1. 稱量5 g脫脂奶粉加入到100 ml的TBST Buffer中，充分?jǐn)嚢枞芙狻?2. 4保存待用（本封閉液應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用。 Ampicillin(100 mg/ml 組份濃度配制量 配制方法 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 1. 稱量5 g Ampicillin置于50 ml離心管中。 2. 加入40 ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3

27、. 用0.22 m 過濾膜過濾除菌。4. 小份分裝（1 ml/份）后，-20保存。IPTG(24 mg/ml 組份濃度配制量 配制方法 24 mg/ml IPTG 50 ml 1. 稱量1.2 g IPTG置于50 ml離心管中。 2. 加入40 ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3. 用0.22 m 過濾膜過濾除菌。4. 小份分裝（1 ml/份）后，-20保存。X-Gal(20 mg/ml 組份濃度配制量 配制方法 組份濃度配制量 配制方法 組份濃度 配制量 配制方法 1 L 1. 稱取下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 滴加5

28、 N NaOH（約0.2 ml，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L。5. 高溫高壓滅菌后，冷卻至室溫。6. 加入1 ml Ampicillin（100 mg/ml）后均勻混合。7. 4保存。組份濃度 配制量 配制方法 1 L 1. 配制磷酸鹽緩沖液（0.17 M KH2PO 4，0.72 M K2HPO 4）100 ml。溶解2.31 g KH2PO 4和12.54 g K2HPO 4于90 ml的去離子水中，攪拌溶解后，加去離子水定容至 100 ml ，高溫高壓滅菌。2. 稱取下列試劑，置于1 L燒杯中。 3. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加去離

29、子水將培養(yǎng)基定容至1 L后，高溫高壓滅菌。5. 待溶液冷卻至60以下時(shí)，加入100 ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖液。6. 4保存。組份濃度 配制量 配制方法 組份濃度 配制量 配制方法 1 L 1. 配制250 mM KCl溶液。在90 ml的去離子水中溶解1.86 g KCl后，定容至100 ml。 2. 配制2 M MgCl2溶液。在90 ml去離子水中溶解19 g MgCl2后，定容至100 ml，高溫高壓滅菌。3. 稱取下列試劑，置于1 L燒杯中。 4. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 量取10 ml 250 mM KCl溶液，加入到燒杯中。6. 滴加5 N NaOH溶液

30、（約0.2 ml，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。7. 加入去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L。8. 高溫高壓滅菌后，4保存。9. 使用前加入5 ml滅菌的2 M MgCl2溶液。組份濃度 配制量配制方法 100 ml 1. 配制1 M葡萄糖溶液。將18 g葡萄糖溶于90 ml去離子水中，充分溶解后定容至100 ml，用0.22 m 濾膜過濾除菌。2. 向100 ml SOB培養(yǎng)基中加入除菌的1 M葡萄糖溶液2 ml，均勻混合。3. 4保存。組份濃度配制量 配制方法 組份濃度配制量 配制方法 組份濃度 配制量 配制方法 1 L 1. 稱取下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)?/p>

31、拌溶解。3. 滴加5 N NaOH（約0.2 ml，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L。5. 高溫高壓滅菌后，4保存。組份濃度 配制方法 NZYM 培養(yǎng)基除不含Casamino Acid（酪蛋白氨基酸）外，其他成份與NZCYM培養(yǎng)基相同。 組份濃度 配制方法 NZM 培養(yǎng)基除不含Yeast Extract（酵母提取物）外，其他成份與NZYM培養(yǎng)基相同。 配制方法 1.按照液體培養(yǎng)基配方準(zhǔn)備好液體培養(yǎng)基，在高溫高壓滅菌前，加入下列試劑中的一種。 2. 高溫高壓滅菌后，戴上手套取出培養(yǎng)基，搖動(dòng)容器使瓊脂或瓊脂糖充分混勻（此時(shí)培養(yǎng)基溫度很高，小心燙傷。3. 待培養(yǎng)基冷卻至50

32、60時(shí)，加入熱不穩(wěn)定物質(zhì)（如抗生素等，搖動(dòng)容器充分混勻。 組份濃度 配制量 配制方法 1 L 1. 稱取下列試劑，置于1 L燒杯中。 2. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 滴加5 N NaOH（約0.2 ml，調(diào)節(jié)pH 值至7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L后，加入15 g Agar。5. 高溫高壓滅菌后，冷卻至60左右。6. 加入1 ml Ampicillin（100 mg/ml、1 ml IPTG（24 mg/ml、2 ml X-Gal（20 mg/ml）后均勻混合。 組份濃度 配制量 配制方法 1 L 1. 配制磷酸鹽緩沖液（0.17 M KH2PO 4，0.

33、72 M K2HPO 4）100 ml。溶解2.31 g KH2PO 4和12.54 g K2HPO 4于90 ml的去離子水中，攪拌溶解后，加去離子水定容至 100 ml ，高溫高壓滅菌。2. 稱取下列試劑，置于1 L燒杯中。 3. 加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L后，加入15 g Agar。5. 高溫高壓滅菌后，冷卻至60左右。6. 加入100 ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖液、1 ml Ampicillin（100 mg/ml、1 ml IPTG（24 mg/ml、2 ml X-Gal（20 mg/ml）后均勻混合。 抗生素的貯存溶液及其工作濃度

34、 *1 以水為溶劑的抗生素貯存液應(yīng)通過0.22 m 濾器過濾除菌。以乙醇為溶劑的抗生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應(yīng)保存于不透光的容器中。*2 鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應(yīng)使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基（如LB 培養(yǎng)基。SDS-PAGE 濃縮膠（5% Acrylamide）配方表 SDS-PAGE 分離膠配方表 PAGE 凝膠配方表（核酸電泳用） 各種緩沖液的性質(zhì)對(duì)照表 離心機(jī)轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速與相對(duì)離心力RCF(g間的換算關(guān)系相對(duì)離心力RCF 值（g 值）取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速（rpm ）和旋轉(zhuǎn)半徑（r ，以mm 計(jì)算，可用如下公式表示： 此外，根據(jù)RCF 值（g 值、rpm 值、r 值之間的

35、關(guān)系，可從圖A 、圖B 中大致讀出各種數(shù)值。 圖A 高速轉(zhuǎn)子的相對(duì)離心力列線圖要確定某一列上的未知值時(shí)，用尺子排列其他兩列的已知值，所需值落在尺子與第三列的交切處。如：轉(zhuǎn)子速度為80,000 rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為20 mm時(shí)，相對(duì)離心力RCF 值約為150,000 g。 圖B 低速轉(zhuǎn)子的相對(duì)離心力列線圖要確定某一列上的未知值時(shí)，用尺子排列其他兩列的已知值，所需值落在尺子與第三列的交切處。 如：轉(zhuǎn)子速度為5,000 rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為40 mm時(shí)，相對(duì)離心力RCF 值約為1,100 g。 密碼子表密碼子的5' 末端從左開始 色素在聚丙烯酰胺凝膠中的移動(dòng)速度* 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 變性

36、聚丙烯酰胺凝膠電泳* Maniatis, T., et al. (1982 Molecular Cloning.* bp數(shù)是指和色素移動(dòng)相同距離的DNA 片段長度。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA 的最佳分辨 放射能單位換算表 大腸桿菌的基因型野生的大腸桿菌（E.coli ）的基因組DNA 中有470萬個(gè)堿基對(duì)（bp ，內(nèi)含4288個(gè)基因。E.coli 基因組中還包含有許多插入序列，如-噬菌體片段和一些其他特殊組份的片段，這些插入的片段都是由基因的水平轉(zhuǎn)移和基因重組而形成的，由此表明了基因組具有它的可塑造性。利用大腸桿菌基因組的這種特性對(duì)其進(jìn)行改造，使其中的某些基因發(fā)生突變或缺失，從而給大腸桿菌帶來

37、可以觀察到的變化，這種能觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型 (Phenotype ，把引起這種變化的基因構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型（Genotype 。具有不同基因型的菌株表現(xiàn)出不同的特性。這些不同基因型特性的菌株在基因工程的研究和生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。大腸桿菌基因型的表示方法有如下幾種：1根據(jù)基因產(chǎn)物或其作用產(chǎn)物的英文名稱的第一個(gè)字母縮寫成三個(gè)斜體字母來表示。例如：DNA Adenine Methylasedam 。2變異基因不同，導(dǎo)致的結(jié)果相同時(shí)，用其作用結(jié)果的英文名稱的前三個(gè)字母斜體后加上一個(gè)大寫字母來表示區(qū) 別。例如：Recombination recA 、recB 、recC 。3某

38、個(gè)基因或某個(gè)領(lǐng)域缺失時(shí)，在其基因型前面加上“”表示。例如：lac-proAB 基因缺失時(shí)它的基因型表示為(lac-proAB 。4野生的大腸桿菌具有F 因子（質(zhì)粒）和噬菌體插入片段，當(dāng)這些質(zhì)?；蚴删w片段變異或缺失時(shí)，用“( ”或 “/”等以區(qū)別。例如：/F' traD36、proAB 、lac I q 、lacZ M15。5由于某種基因的變異導(dǎo)致大腸桿菌可以明顯觀察到特征變化，有時(shí)也用其表現(xiàn)型代替基因型進(jìn)行表示。例如：某些抗藥性的獲得或喪失，用如下方式表示：Streptomycin 抗性Str +或Str r ，Ampicillin 敏感性Amp -。 (第一個(gè)字母要大寫,“+”或“

39、r ”表示有抗性,“-”表示無抗性或敏感。6根據(jù)某些特異性蛋白的變異及其導(dǎo)致的結(jié)果變化進(jìn)行表示。例如：TH 2菌株上有一種基因型表示如下：hsdS20 (rB -、mB - ，其中S20代表特異性識(shí)別蛋白發(fā)生變異，(中的 rB -、mB -表示由于S20的變異而導(dǎo)致B 株來源的hsdR 和hsdM 的功能缺失。使用時(shí)注意： 基因工程中，經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于K-12菌株，最近也經(jīng)常使用由B 株及C 株來源的大腸桿菌。 大腸桿菌B 株原來就為lon -，另外MV1184株不具有琥珀抑制基因 (Amber supperssor free，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中

40、加以表示，要注意。主要的基因型說明 基因重組相關(guān)的基因型recA (Recombination Map position: 58 min功能：recA 基因表達(dá)ATP 依賴型DNA 重組酶，它在-噬菌體與基因組DNA 的溶原重組時(shí)起作用，同時(shí)具有對(duì)DNA放射性損傷的修復(fù)功能。由recA 基因的變異所產(chǎn)生的基因型使同源或異源DNA 的重組不能進(jìn)行，保持插入DNA 的穩(wěn)定性，對(duì)DNA 的轉(zhuǎn)化有利。recB (RecombinationMap position: 61 min功能：recB 基因表達(dá)ATP 依賴型DNase 和核酸外切酶V 的一個(gè)亞基，對(duì)recA 的DNA 重組酶起輔助和促進(jìn)作用。D

41、Nase 催化雙鏈DNA 的解旋和解鏈，核酸外切酶V 催化單鏈DNA 的裂解，在DNA 的重組和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。recB 基因的變異導(dǎo)致其DNA 重組和修復(fù)功能喪失，保證了外源DNA 的穩(wěn)定，有利于DNA 轉(zhuǎn)化。recC (RecombinationMap position: 61 min功能：recC 基因表達(dá)四種酶，即核酸外切酶V ，ATP 依賴型的核酸內(nèi)切酶，解旋酶及ATP 酶，它們和recA , recB 所表達(dá)的酶相互協(xié)調(diào)作用，在DNA 的重組及放射性損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。recC 基因的變異導(dǎo)致DNA 重組功能缺失，保證外源DNA 的穩(wěn)定性。甲基化相關(guān)的基因型dam (DN

42、A adenine methylaseMap position: 74 min 功能：dam 基因表達(dá)DNA 腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列GATC 中A 的甲基化，保證DNA 免受限制性核酸內(nèi) 切酶Mbo I 的切斷，同時(shí)在DNA 復(fù)制時(shí)也起一定的輔助作用。dam 基因的變異導(dǎo)致腺嘌呤（A ）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤 (A 不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。下一頁 dcm (DNA cytosine methylaseMap position: 43 min功能：dcm 基因表達(dá)胞嘧啶甲基化酶，它能特異性識(shí)別DNA 雙鏈上的CCWGG 序列，并使第二個(gè)C 甲基化，即C m CWGG ，

43、避免DNA 受到相關(guān)限制酶的切斷。dcm 基因的變異導(dǎo)致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA 上的C 不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。mcrA (Modified cytosine restriction protein aMap position: 26 min功能：mcrA 基因表達(dá)大腸桿菌防御體系中起重要作用的mcrA 酶，這種酶能特異性地作用于外來DNA 上的被甲基化的 胞嘧啶序列，即C 5m CGG 特異序列，使之分解，對(duì)大腸桿菌本身起保護(hù)作用。mcr A 基因的變異，導(dǎo)致上述功能缺失，對(duì)外來DNA 中被甲基化的胞嘧啶特異序列（C 5m CGG ）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的

44、克隆體的穩(wěn)定。mcrB , C (Methyl cytosine-specific restrictionMap position: 98 min功能：mcrB , C 基因表達(dá)兩種特異性蛋白，即mcrB 蛋白和mcrC 蛋白，它們?cè)诖竽c桿菌的防御系統(tǒng)中起重要作用。一般情況下，只有這兩種蛋白同時(shí)存在時(shí)才表現(xiàn)出活性，mcrC 具有識(shí)別和調(diào)節(jié)功能，它能特異性的結(jié)合到外源DNA 上被甲基化的胞嘧啶（C ）的特異序列G 5m C 上，然后由mcrB 蛋白切斷（mcrB 蛋白是特異性切斷外來DNA 中G 5m C 序列的限制性核酸內(nèi)切酶，防御外來DNA 的侵入。mcrB, C基因的變異，使上述的對(duì)外來D

45、NA 的防御作用缺失，對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化有利。 mrr (Methylation requiring restrictionMap position: 98 min功能：mrr 基因是大腸桿菌細(xì)胞防御系統(tǒng)中重要的基因之一，它能嚴(yán)格限制被甲基化的外源DNA 的介入。另外， 它對(duì)限制酶Acc I ，Cvi R I ，Hin f I (Hha II ，Nla II ，Pst I 以及N 6-腺嘌呤甲基化酶和C 5-胞嘧啶甲基化酶活性有明顯的抑制作用。mrr 欠損株（基因型）可用于含有N 6-m A 和C 5-m C 的DNA 的轉(zhuǎn)化。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆體。hsdM (H

46、ost specificitive defectiveMap position: 99 min功能：hsdM 基因所表達(dá)的DNA 甲基化酶是I 型限制酶復(fù)合體（具有對(duì)DNA 切斷和修補(bǔ)的雙重功能）的一部分，它能使DNA 雙鏈上的AA (雙腺嘌呤 甲基化，保護(hù)宿主DNA 不被分解。hsdM 的變異使細(xì)胞內(nèi)的DNA 不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。點(diǎn)突變相關(guān)的基因型mutS (MutatorMap position: 59 min 功能：mutS 基因表達(dá)的蛋白具有識(shí)別DNA 上錯(cuò)配序列的功能，并能修復(fù)其錯(cuò)配序列（GC AT ，防止基因突變。 mutS 基因的變異導(dǎo)致DNA 的錯(cuò)配序列不能得到修

47、復(fù)，容易發(fā)生基因突變，這對(duì)于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造是有利的。 mutT （Mutator ）Map position: 3 min功能：野生大腸桿菌在進(jìn)行DNA 復(fù)制時(shí)，細(xì)胞中的8-OXO-dGTP 插入模板DNA 中的DA 位點(diǎn)的效率幾乎與插入DC位點(diǎn)的效率相同，導(dǎo)致A-T 轉(zhuǎn)換成G-C ，使DNA 產(chǎn)生變異。而mutT 蛋白就是特異性地降解8-OXO-dGTP 成為單磷酸鹽（8-OXO-dGMP ，這種單磷酸鹽狀態(tài)的G (鳥嘌呤 不能作為底物進(jìn)行DNA 合成，從而防止了上述的基因突變。mutT 基因的變異使細(xì)胞中8-OXO-dGTP 濃度增高，A C 的突變幾率增大，有利于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基

48、因改造。dut (dUTPaseMap position: 82 min功能：dut 基因表達(dá)脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase ，它能水解dUTP 成為dUMP ，使細(xì)胞體內(nèi)dUTP 的濃度維持在較低的水平，尿嘧啶（U ）就不易摻入到DNA 中，避免了基因發(fā)生A U 的突變。dut 基因發(fā)生突變使dUTPase 活性缺失，導(dǎo)致dUTP 濃度升高，堿基U （尿嘧啶）極易摻入到DNA 中，使其發(fā)生A U 的基因突變，有利于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造。ung (Uracil DNA glycosylaseMap position: 56 min功能：ung 基因表達(dá)尿嘧啶-N-糖苷酶，這種酶

49、能特異性識(shí)別DNA 單鏈或雙鏈上發(fā)生突變的尿嘧啶殘基，并從DNA 上水解去除尿嘧啶殘基，防止DNA 發(fā)生突變。ung 基因的變異導(dǎo)致上述功能缺失， 有利用點(diǎn)突變。uvrB (UltravioletMap position: 18 min功能：uvrB 基因表達(dá)核酸外切酶中的b 亞基，這種核酸外切酶具有DNA 的切補(bǔ)功能，對(duì)紫外線損傷的DNA 有修補(bǔ) 作用。uvrB 基因的變異使細(xì)胞中核酸外切酶切除變異堿基的活性缺失，有利于點(diǎn)突變。下一頁 核酸內(nèi)切酶相關(guān)的基因型hsdR (Host specificity defective Map position: 99 min功能：hsdR 基因表達(dá)I 型

50、限制酶Eco K (K12株 或Eco B (B株 ，在大腸桿菌細(xì)胞中起到一種“抗體”的作用，對(duì)外 來的各種 DNA 有嚴(yán)格的限制。HsdR 基因的變異導(dǎo)致菌株細(xì)胞內(nèi)的I 型限制酶Eco K 或Eco B 活性缺失，這對(duì)于外來基因的導(dǎo)入及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化是有利的。hsdS (Host specificitive defectiveMap position: 99 min功能：hsdS 所表達(dá)的特異性蛋白是I 型限制酶Eco K 或Eco B 復(fù)合體中的一部分，它專門負(fù)責(zé)hsdR 酶和hsdM 酶對(duì) DNA 序列的特異識(shí)別。hsdS 基因的變異使hsdR 和hsdM 不能正確識(shí)別其作用的特異DNA 序列

51、，可以保持插入DNA 的穩(wěn)定性。end A (EndonucleaseMap position: 64 min功能：endA 基因表達(dá)非特異性核酸內(nèi)切酶I ，它能使所有DNA 雙鏈解開，在DNA 的復(fù)制和重組中起重要作用。endA 基因的變異將使插入的外源DNA 更加穩(wěn)定，提取的質(zhì)粒純度更高。停止密碼子相關(guān)的基因型supE (SuppressorMap position: 16 min 功能：supE 基因表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子UAG 結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。supE 基因發(fā)生變異時(shí)，不能表達(dá) 正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密碼子UAG ，蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使UAG 作為一個(gè)密碼子來編碼

52、谷氨酰胺（Glutamine ，從而使發(fā)生了琥珀突變（AAG UAG ）的基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)表達(dá)得以延續(xù)，因此稱supE 為琥珀突變抑制因子。 supF (SuppressorMap position: 27 min功能：supF 基因表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子UAG 結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。supF 基因變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密碼子UAG ，蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使UAG 作為一個(gè)密碼子編碼酪氨酸 (Tyrosine ，彌補(bǔ)了由于琥珀突變 (AAGUAG 帶來的蛋白合成停止，因此也稱supF 為琥珀突變抑制因子。抗藥性相關(guān)的基因型gyrA （Gyrase ）Map posit

53、ion：48 min功能：gyrA 基因表達(dá)DNA 促旋酶A 亞基。DNA 促旋酶在DNA 復(fù)制時(shí)具有使DNA 解旋和回旋的作用。萘啶酮酸 (Nalidixic acid、4-喹啉（4-Quinoline ）等抗生素抑制DNA 促旋酶的活性是通過與促旋酶復(fù)合體 (A 2B 2）中的A 亞基的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。gyrA 基因的變異使DNA 促旋酶A 亞基不能正常表達(dá)，萘啶酮酸和熒光喹啉等失去結(jié)合目標(biāo)，從而使該基因型的菌株具有了對(duì)萘啶酮酸（Nal r 和熒光喹啉的抗性。rpsL （Ribosomal protein small subunit）Map position：73 min功能：細(xì)胞中的核糖體是

54、蛋白質(zhì)生物合成的場所，大腸桿菌細(xì)胞中的核糖體包含兩個(gè)亞基，即50S 亞基（23SrRNA 、 5SrRNA 、34種蛋白質(zhì)）和30S 亞基 16SrRNA、21種蛋白質(zhì)（S1S21 。rpsL 基因就是表達(dá)核糖體30S 亞基中的S12蛋白質(zhì)，S12蛋白作用于翻譯的開始階段。鏈霉素（Streptomycin ）等抗生素的作用位點(diǎn)就是核糖體30S 亞基上的S12蛋白質(zhì)，正常情況下鏈霉素與S12蛋白結(jié)合使蛋白質(zhì)的生物合成不能進(jìn)行，細(xì)胞停止生長。rpsL 基因的變異使鏈霉素失去結(jié)合位點(diǎn)，從而使該基因型的菌株具有了對(duì)鏈霉素的抗性（Str r 。Tn5（Transposon ）Map position：轉(zhuǎn)

55、座子功能：在原核生物和真核生物基因組中都存在有可移動(dòng)的DNA 序列，一般稱這段序列為轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)位基因，轉(zhuǎn)座子上通常帶有抗藥性基因。Tn5是載有卡那霉素（Kanamycine ）抗性基因的轉(zhuǎn)座子，當(dāng)Tn5轉(zhuǎn)位到大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲得卡那霉素的抗性（Km r 。Tn10（Transposon ）Map position：轉(zhuǎn)座子功能：Tn10是載有四環(huán)素（tetracycline ）抗性基因的轉(zhuǎn)座子。當(dāng)Tn10轉(zhuǎn)位至大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲 得四環(huán)素的抗性 (Tet r 。能量代謝相關(guān)的基因型lacZ （Lactose ）Map position：8 min功能：lacZ 基因是大腸桿菌中l(wèi)ac 操縱子的結(jié)構(gòu)基因，表達(dá)-半乳糖苷酶，分解乳糖為半乳糖苷。-半乳糖苷酶是由四個(gè)相同的亞基組成的，每個(gè)亞基又包含兩個(gè)片斷，即片斷和片斷，只有這兩種片斷同時(shí)存在時(shí)，-半乳糖苷酶才表現(xiàn)出活性。lacZ 基因的變異或缺失將直