反轉(zhuǎn)錄PCR-步驟和方法(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上反轉(zhuǎn)錄PCR科技名詞定義中文名稱：反轉(zhuǎn)錄PCR 英文名稱：reverse transcription PCR;RT-PCR 定義：擴增mRNA的一種實驗技術(shù)。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。 應用學科：（一級學科）；（二級學科） 以上內(nèi)容由審定公布 目錄 RT-PCR反應原理1反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又稱為。其原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cD

2、NA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞/組織中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 一、反轉(zhuǎn)錄

3、酶的選擇1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37。 2 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42。 3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。 4MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript 和SuperScript。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA

4、模板合成較長cDNA。 二、合成cDNA引物的選擇1 隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。 2 Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDN

5、A在數(shù)量和復雜性方面均要小。 3 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。 三、操作步驟1. 總RNA的提取。 2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synth

6、esis 試劑盒為例。 （1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5g，補充適量的DEPC H2O使總體積達11l。在管中加10M Oligo（dT）12-18 1l，輕輕混勻、離心。 （2）70加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列試劑的混合物： 10×PCR buffer 2l 25mM MgCl2 2l 10mM dNTPmix 1l 0.1M DTT 2l 輕輕混勻，離心。42孵育2-5min。 （3）加入Superscript1l ，在42水浴中孵育50min。 （4）于70加熱15min以終止反應。 （5）將管插入冰中，加入RNas

7、e H 1l ，37孵育20min，降解殘留的RNA。-20保存?zhèn)溆谩?3PCR： （1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑： 第一鏈cDNA 2l 上游引物（10pM） 2l 下游引物（10pM） 2l dNTP(2mM) 4l 10×PCR buffer 5l Taq 酶（2u/l） 1l （2） 加入適量的ddH2O，使總體積達50l。輕輕混勻，離心。 （3） 設定PCR程序。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內(nèi)參DNA，作為對照。 （4） 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。 （5） 密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。 四、注意事項1 在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。 2 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。 3 內(nèi)參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、-Actin（-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。 4 PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標DNA