白色念珠菌細(xì)胞壁β-葡聚糖升白細(xì)胞藥效學(xué)作用的研究

1、白色念珠菌細(xì)胞壁-葡聚糖升白細(xì)胞藥效學(xué)作用的研究    【摘要】  目的  研究白色念珠菌（Candida Albicans）細(xì)胞壁不同溶解性的-葡聚糖（-glucan）對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致小鼠外周血白細(xì)胞減少的回升作用。方法  采用CTX所致的小鼠外周血白細(xì)胞減少模型，研究白色念珠菌細(xì)胞壁-葡聚糖對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響。結(jié)果  三種溶解性的白色念珠菌細(xì)胞壁-葡聚糖均能升高小鼠外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)。各組小鼠脾臟指數(shù)增加，脾臟、

2、骨髓巨核細(xì)胞系增生。不溶性的-葡聚糖作用更明顯。結(jié)論  白色念珠菌-葡聚糖尤其是不溶性-葡聚糖對(duì)CTX所致的白細(xì)胞減少有回升作用，是一種很有前途的免疫調(diào)節(jié)劑?！娟P(guān)鍵詞】  白色念珠菌；-葡聚糖；生物學(xué)活性；提取分析；免疫藥理作用【Abstract】  Objective  To study the pharmacological effect of the basic -glucan，acidic -glucan and insoluble -glucan extracts of Candida albicans on the leukocytopoie

3、sis-promoting in the leukopenia mice.Methods  Mice of each group except the untreated control group were administered cyclophosphamide intraperitoneally 100 mg/(kg·d) for three days to develop leucopenia.The experimental group were administered three kinds of Candida albicans -glucan intra

4、venously for six days separately.The peripherial leukocytes of all mice were counted before treated CTX，and 1，3，5，7 days after treated CTX.Results  Three kinds of Candida albicans -glucan can increase the numbers of leukocytes，neutrophilic granulocytes and monocytes in the peripheral blood.The

5、spleen index in each group animal are increased，and megakaryocytes are increased in spleen and marrow.Conclusion  Candida albicans -glucan specially insoluble -glucans is a kind of immunomodulator which can increase the numbers of leukocytes in the peripheral blood.【Key words】  -glucan；Can

6、dida albicans；leukocyte；immunomodulator-葡聚糖（-glucan）是白色念珠菌細(xì)胞壁中含量最高的多糖。作為一類條件致病真菌多糖，白色念珠菌-葡聚糖有著多種生物學(xué)活性和免疫藥理學(xué)作用，在抗炎、抗腫瘤、刺激造血等方面都有很高的藥效學(xué)作用1，但有關(guān)不同性質(zhì)的白色念珠菌-葡聚糖升白細(xì)胞作用的研究甚少。本研究制備三種溶解性的-葡聚糖，觀察其對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白細(xì)胞減少的回升作用，為進(jìn)一步確證白色念珠菌-葡聚糖刺激造血系統(tǒng)使白細(xì)胞升高的作用機(jī)制，和進(jìn)一步研究白色念珠菌-葡聚糖有效成分或

7、有效因子，為確立藥物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和量效關(guān)系提供理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  動(dòng)物與試劑  昆明種小白鼠，46周齡，體重20±2g，昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科（云南省實(shí)驗(yàn)質(zhì)量合格證0000481號(hào)）。沙氏液體培養(yǎng)基（Sabourauds dextrose agar）：蛋白胨10g、葡萄糖40g、溶于1000ml蒸餾水，高壓滅菌后備用；淀粉酶：分子量9600，酶活力：50/mg（上海伯奧生物科技有限公司）；白色念珠菌堿溶性-葡聚糖（Candida albicans basic -glucan， CABBG）、酸溶性-葡聚糖（Candida albicans ac

8、idic -glucan， CAABG)和不溶性-葡聚糖（Candida albicans  insoluble -glucan， CAIBG）：均按文獻(xiàn)方法制備2。1.2  儀器  LRH-250Z型震蕩培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠）；81-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）。1.3  白念珠菌的培養(yǎng)和三種白色念珠菌-葡聚糖的制備  取少量保存于密封無菌容器中的純白色念珠菌菌落，接種于沙氏液體培養(yǎng)基，接種后37恒溫?fù)u床160次/min震蕩培養(yǎng)67天，3000rpm離心30min，收集菌體，冷凍保存。提取葡聚糖的流程，見圖1。1.4  小

9、鼠白細(xì)胞減少模型的建立  除空白對(duì)照組外，各組小鼠腹腔注射CTX 100mg/(kg·d)，連續(xù)3天，建立小鼠外周血白細(xì)胞減少模型。1.5  確定三組-葡聚糖的給藥劑量  參照急性毒性實(shí)驗(yàn)摸索LD50值，各組給藥劑量最后如表1。1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  急性毒性學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Bliss法計(jì)算LD50值。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，所有指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，以P0.05為差異有顯著性。圖1  從白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流

10、程示意圖Table 1  Dose design of experiment2  結(jié)果2.1  急性毒性學(xué)實(shí)驗(yàn)  通過急性毒性實(shí)驗(yàn)得到LD50值分別為：CABBG 36.8937mg/kg，CAABG 89.23549mg/kg，CAIBG 767.7753mg/kg；95%可信區(qū)間分別為CABBG組32.005242.5289mg/kg，CAABG組76.7182103.8025mg/kg，CAIBG組663.748888.106mg/kg。各實(shí)驗(yàn)組小鼠肉眼觀察，除肝臟增大外未見明顯變化，病理HE切片顯示肝細(xì)胞有不同程度的腫脹和空泡變。2.2 

11、; 外周血白細(xì)胞變化  實(shí)驗(yàn)第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)均顯著增高，其中第7天、第9天，CAIBG組白細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)較陽(yáng)性對(duì)照組rhG-CSF升高，差異有顯著性。Table 2  Numbers of leukocyte of peripheral blood in each group animal  (x±s)注：Note：*P0.05，compared with the normal control；*P0.05，compared with the positive contro

12、lTable 3  Numbers of neutrophilic granulocyte of peripheral blood in each group animal  (x±s)注：Note：*P0.05，compared with the normal control；*P0.05，compared with the positive controlTable 4  Numbers of monocyte of peripheral blood in each group animal  (x±s)注：Note：*P0.05

13、，compared with the positive control2.3  脾臟、胸腺指數(shù)變化  實(shí)驗(yàn)第5、7、9天，各組小鼠胸腺指數(shù)比較，差異無顯著性(P0.05)。各組小鼠給藥后，脾臟指數(shù)均增加。Table 5  The effect of -glucan on the spleen index in each group animal  (x±s)注：Note：*P0.05，compared with the positive control2.4  藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)病理組織學(xué)改變  脾臟：白髓、紅髓分界不甚清楚，紅髓內(nèi)

14、細(xì)胞數(shù)增多，與空白對(duì)照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組脾竇出現(xiàn)較多的巨核細(xì)胞；骨髓：實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓細(xì)胞增生活躍，與空白對(duì)照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組的巨核細(xì)胞數(shù)增多，提示巨核細(xì)胞系增生活躍。3  討論多能造血干細(xì)胞具有多向分化的潛能，成年小鼠體內(nèi)的多能造血干細(xì)胞主要分布在脾臟和骨髓3。本研究顯示，實(shí)驗(yàn)第7天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)都較rhG-CSF高(P0.05)；實(shí)驗(yàn)第7天、第9天，CAIBG升高外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)明顯高于CABBG、CAABG和rhG-CSF(P0.05)，說明-葡聚糖，尤其是CAIBG可刺激血液系統(tǒng)白細(xì)胞、中性粒細(xì)

15、胞、單核細(xì)胞數(shù)不同程度的升高。實(shí)驗(yàn)第7天，CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠脾臟指數(shù)均與rhG-CSF差異有顯著性(P0.05)；第9天，CAIBG脾臟指數(shù)較rhG-CSF、CABBG、CAABG組高，統(tǒng)計(jì)學(xué)表明差異均具有顯著性(P0.05)。與成年小鼠體內(nèi)造血干細(xì)胞的分布一致，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠的組織病理學(xué)改變主要體現(xiàn)在骨髓和脾臟。與空白對(duì)照組比較，三組小鼠脾臟、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)增多，CAIBG組要更明顯。因此，綜合外周血細(xì)胞數(shù)、脾臟指數(shù)、組織改變，我們推測(cè)-葡聚糖在刺激小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)升高的過程中可能與刺激CFU-S增殖，向粒系、巨核系組細(xì)胞分化，進(jìn)而

16、生成粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。造血器官中基質(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境中重要的成分，與造血有關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞涉及到巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和載脂肪細(xì)胞。其中，巨噬細(xì)胞被證明是在造血發(fā)生過程中有重要作用的一個(gè)微環(huán)境因素。巨噬細(xì)胞可通過細(xì)胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE和IL-1因子，調(diào)節(jié)所有四系血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化4。以往研究證實(shí)念珠菌多糖可刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF等5，6。這些細(xì)胞因子可調(diào)控造血細(xì)胞的增殖活動(dòng)：IL-1、TNF可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF），G-CSF 和G

17、M-CSF是使粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的母細(xì)胞增殖分化的特異性誘導(dǎo)劑，并能刺激骨髓向外周血液釋放成熟的中性粒細(xì)胞，縮短中性粒細(xì)胞的成熟期7。同時(shí)，CSF可作用于粒-單系祖細(xì)胞（CFU-GM），誘導(dǎo)其增殖分化。IL-1還能激活干細(xì)胞從G0期進(jìn)入增殖周期，擴(kuò)大干細(xì)胞池；可為早期干細(xì)胞對(duì)CSF起反應(yīng)做準(zhǔn)備，并誘導(dǎo)輔助細(xì)胞產(chǎn)生CSF及其他CK，從而間接調(diào)節(jié)造血。-葡聚糖是念珠菌重要的抗原決定簇8，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上都存在-葡聚糖的特異性受體9。白色念珠菌的三種溶解性的-葡聚糖，在結(jié)構(gòu)上都是符合單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上-葡聚糖受體對(duì)于配體的要求，即能被特異識(shí)別-（13）和-（16）糖苷鍵10。巨噬細(xì)胞作為一類抗原

18、遞呈細(xì)胞（APC）攝取-葡聚糖抗原，隨后誘導(dǎo)性的表達(dá)高水平MHC，MHC與Th細(xì)胞上的TCR和CD4相互作用。使Th細(xì)胞功能增強(qiáng)，IL-2分泌增多，IL-2又能保持T細(xì)胞的存活與增殖Th細(xì)胞被激活后刺激B細(xì)胞分化、增殖11。實(shí)驗(yàn)中，小鼠脾臟指數(shù)的明顯增加、脾臟、骨髓細(xì)胞增生，說明了-葡聚糖在升高外周血白細(xì)胞的同時(shí)，也對(duì)激活機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)活性產(chǎn)生影響。因此，CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的作用可能與各組-葡聚糖能不同程度的被單核、巨噬細(xì)胞識(shí)別從而產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子，刺激造血系統(tǒng)和促進(jìn)中性粒細(xì)胞增殖有關(guān)。免疫調(diào)節(jié)劑作為一種免疫治療的藥物已經(jīng)廣泛

19、應(yīng)用于臨床。多糖作為一類免疫調(diào)節(jié)劑，不僅毒副作用小，資源豐富，而且具有明顯的調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用。本研究說明白色念珠菌-葡聚糖尤其是不溶性的-葡聚糖能顯著增加小鼠脾重，并能對(duì)抗由CTX所致的小鼠脾臟萎縮及白細(xì)胞水平降低，是一種較好的免疫增強(qiáng)物質(zhì)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1  Kouki Ishitani.Antitumor activity of polygalactosamine isolated from Paecilomyces sp.I-1 strain.J Pharmacobio Dyn，1988，11：58.2  Gopal PK，Sullivan PA，ShepHerd

20、 MG.Analysis of wall glucans from yeast，hypHal and germ-tube forming cells of Candida albicans.J Gen Microbiol，1984，130：3295-310.3  祝彼得.造血干細(xì)胞研究進(jìn)展.重慶醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985，10：295.4  徐豐彥，張鏡如.人體生理學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1989，952-970.5  LI Min，CHEN Yun，SHAO Feng，et al.Isolation and Purification of the Alkali-soluble glucan from Cell Wall of Candida albicans.Chin J Dermatol，2000，33(5)：311-313.6  Manners D J，Masson A J，Patterson J C，et al.The structur