涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)微小RNA的篩選

1、·基礎(chǔ)研究·涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)微小RNA的篩選林釗宇李勁松武東輝張偉黃洪章潘朝斌陳偉良黃志權(quán)王友元【摘要】目的探討不同轉(zhuǎn)移能力涎腺腺樣囊性癌(ACC表達(dá)微小RNA(miRNA的差異,以期篩選與ACC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA及其所調(diào)控的靶基因。方法以ACC高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(ACC-M為實(shí)驗(yàn)組,低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(ACC-2為對(duì)照組,采用高通量miRNA微陣列初步篩選兩株細(xì)胞中差異表達(dá)的內(nèi)源性miRNA,然后挑選幾個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR進(jìn)一步加以驗(yàn)證,同時(shí)運(yùn)用miRNA靶基因預(yù)測軟件預(yù)測其可能調(diào)控的靶基因。結(jié)果芯片初篩顯示,與AC

2、C-2相比,ACC-M中表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA 分子有23個(gè),其中上調(diào)表達(dá)的有14個(gè)(miR-15a、miR-16、miR-509-3p等,下調(diào)表達(dá)的有9個(gè)(miR-24、miR-98、miR-320等。qRT-PCR驗(yàn)證與miRNAs芯片結(jié)果相符合。靶基因軟件預(yù)測顯示,miR-98的靶基因?yàn)镽as和高遷移率蛋白A2,miR-320的靶基因?yàn)檎纤?,miR-509-3p 的靶基因?yàn)镃D164,它們均與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)論不同轉(zhuǎn)移能力的ACC存在差異表達(dá)的miRNA、miR-98、miR-320和miR-509-3p可能與ACC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān),可能通過調(diào)控相關(guān)靶基因參與ACC的

3、侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程。【關(guān)鍵詞】微小RNA;涎腺腺樣囊性癌;侵襲;轉(zhuǎn)移;靶基因Screening of differentially expressed microRNA related with invasion and migration in salivary gland adenoid cystic carcinoma LIN Zhao-yu*,LI Jin-song,WU Dong-hui,ZHANG Wei,HUANG Hong-zhang,PAN Chao-bin,CHEN Wei-liang,HUANG Zhi-quan,WANG You-yuan.*Department of Ora

4、l&Maxillofacial Surgery,Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou510120,ChinaCorresponding author:LI Jin-song,Email:lijinsong1967【Abstract】Objective To investigate the differentially expressed microRNAs and their target genes related with invasion and migration in salivary g

5、land adenoid cystic carcinoma (ACC.Methods ACC-M(experimental groupand ACC-2(control groupcells were cultivated, and their endogenous different microRNAs were screened by high-throughput microRNA microarray,and then several significant different microRNAs were selected to be verified by qRT-PCR assa

6、y.Meanwhile,their target genes were predicted by miRNA target gene predictionDOI:10.3877/cma.j.issn.1674-1366.2010.06.005基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(81072225;廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(10251008901000022;廣東省自然科學(xué)基金(915100890100 0201;廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008Z1-E201作者單位:510120廣州,中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面外科(林釗宇、李勁松、張偉、潘朝斌、陳偉良、黃志權(quán)、王友元;廣州市海珠區(qū)口腔醫(yī)院(武東輝;中

7、山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)研究所(黃洪章通信作者:李勁松,電子郵箱:lijinsong1967programs.Results MicroRNA microassay showed that23microRNAs were changed in ACC-M compared with that in ACC-2,including a set of14overexpressed microRNAs(miR-15a,miR-16,miR-509-3p,et al.and9downexpressed miRNAs(miR-24,miR-98,miR-320,e

8、t al., which was accordant with the results of qRT-PCR assay.Ras and HMGA2were the predicted target genes of miR-98,and ITG3and CD164were the target gene of miR-320and miR-509-3p respectively,which were all related with invasion and migration.Conclusions There are differentially expressed microRNAs

9、between ACC-M and ACC-2.MiR-98,miR-320and miR-509-3p might involve in the process of invasion and migration of ACC by regulating the expression of its target genes.【Key words】MicroRNA;Adenoid cystic carcinoma;Invasion;Migration;Target gene涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC是涎腺中常見的惡性腫瘤,具有嗜神經(jīng)侵襲性,其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)

10、移發(fā)生率可高達(dá)26%40%,主要轉(zhuǎn)移部位是肺1。目前針對(duì)ACC主要采取外科手術(shù)為主,放療和化療為輔的治療方式。但是,對(duì)于已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,由于尚無分子靶向治療藥物,所以療效較差,五年生存率較低。目前,微小RNA(microRNA,miRNA與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。miRNA是一類長度為1825個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA,通過與靶基因的mRNA堿基配對(duì),使mRNA降解或抑制mRNA 的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因2。有研究表明,惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移與miRNA的異常表達(dá)有關(guān)系3。ACC既然具有高侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性,miRNA是否在其侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用呢?國

11、內(nèi)外未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用miRNA芯片檢測,qRT-PCR驗(yàn)證,靶基因軟件預(yù)測,篩查出一組可能與ACC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異miRNA及其靶基因,為進(jìn)一步研究相關(guān)miRNA在涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制打下基礎(chǔ)。材料與方法一、材料ACC的肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-M和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-2均購自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院。二、實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)胞培養(yǎng):將凍存的細(xì)胞株復(fù)蘇后,置于含10%胎牛血清的BPMI1640培養(yǎng)基,375%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔12d換液,46d傳代1次。2.細(xì)胞總RNA提取和質(zhì)量檢測:取對(duì)數(shù)生長期的2株細(xì)胞Trizol裂解后進(jìn)行總RNA抽提,提取的總RNA采用瓊脂

12、糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測。3.miRNA的分離、富集、標(biāo)記和純化:對(duì)提取后的總RNA,采用mirVana TM RNA(Ambion,美國分離試劑盒抽提并富集miRNA,然后采用mirVana TM RNA標(biāo)記試劑盒(Ambion,美國,向miRNA樣品中加入Poly(A酶聚合反應(yīng)的混合物,對(duì)富集的miRNA進(jìn)行單色CY3熒光標(biāo)記,再采用QIAgene PCR純化試劑盒(QIAGEN,德國對(duì)標(biāo)記的miRNA進(jìn)行純化并收集。4.miRNA檢測微陣列制作:miRNA探針文庫購自Invitrogen公司,所有探針長度在3444堿基長度,Tm值一致。共有1199個(gè)探針,包括703個(gè)人類已知的成熟miRN

13、A分子、393個(gè)已名稱miR-98 miR-24 miR-320a miR-320c miR-23b miR-509-3p 引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物RT引物PCR引物正向反向正向反向正向反向正向反向正向反向正向反向序列(53GTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACAACAATCTGAGCGGTGAGGTAGTAAGTTGTAATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTGTCGCATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGTCAACGAATGCGACCTGTTCACTAAGCTGGC

14、TCAGTTCAGCAGGATTCGTTGAGAGATCCCAAGCGTGTCGCATTCGTTGAGAGATCACAAGCGTCAACGAATGCGACTCGCCCACTATGGAAAAGCTGGGTTGAGAGATTCGTTGAGAGATCACAAGCGTGTCGCATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTCATGGAATGCGACACCCTCACTAAGCGAAAAGCTGGGTTGAGATTCCATGAGAGATCCCTAGCGTGTCGCATTGCATGAGAGATCACTAGCGTCATGCAATGCGACGGTAATACTAAGATCACATTGCCAGGGAATTGCATG

15、AGAGATCACTAGCGTGTCGCATTCCTTGAGAGATGACTACCGACAAGGAATGCGACCTACCCACTTAGGTGATTGGTACGTCTGTGATTCCTTGAGAGATGACTACCGA表1miRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR的引物測序的預(yù)測的miRNA分子以及其他為各種陰性、陽性對(duì)照和外參照分子。關(guān)于此文庫的詳情,可參見Invitrogen公司的網(wǎng)站( 3。采用GE AMERSHAM公司的芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)制在FULLMOON公司提供的PowerMatrix標(biāo)準(zhǔn)Oligo芯片片基上,按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行固定,干燥保存或用于芯片實(shí)驗(yàn)。每張芯片包括左右2個(gè)重復(fù)的點(diǎn)樣區(qū),最后可以產(chǎn)

16、生2組重復(fù)的數(shù)據(jù)。每個(gè)區(qū)域包括從上而下共12個(gè)小方陣,每個(gè)小方陣分為8行16列共128個(gè)探針點(diǎn),點(diǎn)間距約為350nm,點(diǎn)的直徑約為230nm。5.芯片雜交、芯片掃描和圖像結(jié)果分析:按照實(shí)驗(yàn)要求將變性的探針加到芯片上,蓋上蓋玻片,放入雜交艙并封好,放置于37空氣浴搖床中以300r/min速度晃動(dòng)1824h。雜交結(jié)束后,洗片干燥,玻片完全干燥后,放入掃描片夾中,利用掃描儀(Generationarray scanner,Amersham Pharmacia進(jìn)行掃描;掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)(Imagequant5.0;Array Vision6.0,隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。6.qR

17、T-PCR驗(yàn)證:采用MX-3000P實(shí)時(shí)RT-PCR儀(Stratagen,美國,相應(yīng)的PCR引物見表1。7.生物信息學(xué)分析:應(yīng)用3種miRNA靶基因預(yù)測軟件(Targetscan、Pictar、MiRand的在線服務(wù)站點(diǎn),輸入顯著差異表達(dá)的miRNA,為了減少假陽性率,挑選至少出現(xiàn)在2個(gè)靶基因預(yù)測軟件中的基因作為其可能的靶基因。結(jié)果一、總RNA提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果電泳結(jié)果顯示,兩組樣品總RNA均可見清晰的18S和28S條帶,樣品質(zhì)量較好(圖1。對(duì)分離純化獲得的miRNA進(jìn)行吸光度(A值測定表明miRNA總量及質(zhì)量符合miRNA微陣列的檢測要求(表2。編號(hào)12345678910111213141

18、51617181920212223miRNA hsa -miR -15a hsa -miR -16hsa -miR -181c hsa -miR -22hsa -miR -222hsa -miR -801hsa -miR -561hsa -miR -29a hsa -miR -342-3p hsa -miR -378hsa -miR -509-3p hsa -miR -299-5p hsa -miR -514hsa -miR -518b hsa -miR -24hsa -miR -23b hsa -miR -98hsa -miR -320hsa -miR -126hsa -miR -187hs

19、a -miR -214hsa -miR -29b hsa -miR -877ACC -M/ACC -22.113.072.403.112.582.033.102.492.072.073.753.113.125.520.500.430.450.500.260.200.300.220.31表3芯片上存在表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA 樣品ACC -M ACC -2A 2601.0071.216A 2800.5620.665A 260/A 2801.791.83總RNA 濃度(g/l 0.80560.9728RNA 總量(g 80.5697.28miRNA 濃度(g/l 0.09120.1576

20、miRNA 總量(g 9.1215.76表2兩組樣品總RNA 和miRNA 的濃度及總量二、miRNA 芯片篩選結(jié)果對(duì)于miRNA 分子表達(dá)變化的顯著性,按照通常的判斷標(biāo)準(zhǔn)是校正后的兩個(gè)樣品間雜交信號(hào)強(qiáng)度的比值(ACC-M /ACC-2大于2為上調(diào)或小于0.5為下調(diào)。與ACC-2相比,在ACC-M 中具有顯著性表達(dá)變化的miRNA 分子有23個(gè),上調(diào)表達(dá)14個(gè),下調(diào)表達(dá)9個(gè)(表3 。圖1兩組樣品總RNA 電泳圖三、miRNA 芯片篩選數(shù)據(jù)圖以每個(gè)樣品中miRNA 表達(dá)水平的校正數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),表達(dá)水平高低以顏色梯度變化顯示,沒有檢測到表達(dá)的數(shù)據(jù)以0表示,構(gòu)成數(shù)據(jù)圖(圖2。四、qRT-PCR 驗(yàn)證結(jié)

21、果挑選miR-98、miR-24、miR-320a 、miR-320c 、miR-23b 、miR-509-3p ,通過熒光定量RT-PCR 方法來驗(yàn)證,與芯片篩選結(jié)果基本一致(圖3。五、靶基因預(yù)測結(jié)果miR-24與細(xì)胞周期和增殖有關(guān)的靶基因?yàn)镸KK4、MYC 、E2F2,與DNA 修復(fù)相關(guān)的靶基因?yàn)镠2AX ;miR-23b 與細(xì)胞增殖有關(guān)的靶基因?yàn)镾mads ;miR-98與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的靶基因?yàn)镽as 和高遷移率蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2;miR-320與細(xì)胞周期有關(guān)的靶基因?yàn)镃DK6,與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶基因?yàn)镃D71,與血管生成有關(guān)的靶基因?yàn)橐葝u

22、素樣生長因子1(insulin-like growth factors-1,IGF-1,而與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因?yàn)檎纤?(integrin 3,ITG 3;miR-509-3p 與侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的靶基因?yàn)镃D164。討論侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性,是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的一個(gè)重要原因。惡性圖2miRNA 芯片篩選數(shù)據(jù)圖圖3qRT-PCR 驗(yàn)證ACC-M 中幾種miRNA 相對(duì)ACC2 的表達(dá)量變化568 中華口腔 醫(yī)學(xué)研 究雜志（電 子版） 2010 年 12 月第 4 卷第 6 期 Chin J Stomatol Res （ Electronic Edition ） , Decembe

23、r 2010, Vol4, No6 腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移通常被認(rèn)為與基因表達(dá)的改變有關(guān) ， 由于 miRNA 在腫瘤組織中常常呈現(xiàn)異常 表達(dá) ， 因此它在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用成為腫瘤生物學(xué)行為研究的一大熱點(diǎn) 。 近年來研究 miRNA 在不同組織 、 不同疾病狀態(tài)下表達(dá)的報(bào)道日漸增多 ， 證實(shí)了 miRNA 參與生命 過 程 中 一 系 列 的 重 要 進(jìn) 程 ， 包 括 發(fā) 育 、 造 血 、 器 官形成 、 細(xì)胞增殖凋亡 、 腫瘤發(fā)生和發(fā)展 ， 一些作為促癌基因和 腫瘤抑制基因的 miRNA 被鑒定出來 。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn) ，miR-21 在舌鱗癌中異常高表 達(dá) ，通過抑制癌細(xì)胞凋亡而扮演著促癌

24、基因的角色 4-5。 最近的研究發(fā)現(xiàn) ，miRNA 在參與腫瘤的 侵襲轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要的作用 6。 Ma 等 7在對(duì)具有侵襲轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞株的研究中發(fā) 現(xiàn) miR-10b 異常高表達(dá) ，Tsai 等 8發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移的肝癌中 miR-122 呈低表達(dá) 。 目前 miRNA 參與涎 腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究尚未見報(bào)道 。 本研究采用高通量的 miRNA 芯片技術(shù)篩選獲得不 同轉(zhuǎn)移能力的涎腺腺樣囊性癌細(xì) 胞 中 差 異 表 達(dá) 的 一 組 miRNA ， 然 后 結(jié) 合 預(yù) 測 的 靶基因是否 與 腫 瘤 侵 襲 轉(zhuǎn) 移 相 關(guān) ， 采 用 熒 光 實(shí) 時(shí) 定 量 RT-PCR 進(jìn) 一 步 驗(yàn)

25、 證 ， 基 本 確 定 miR-98 、 miR-24 、 miR-320a 、 miR-320c 、 miR-23b 、 miR-509-3p 可能與涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān) 。 miRNA 是一組非編碼 RNA，并不直接編碼蛋白 ，主要通過降解靶基因的 mRNA 和抑制靶基 因 mRNA 的 翻 譯 這 兩 種 方 式 調(diào) 控 基 因 的 表 達(dá) ， 因 此 篩 選 和 分 析 miRNA 的 靶 基 因 是 研 究 miRNA 生物學(xué)功能的起點(diǎn) 。 Ma 等 9的研究顯示在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的 miR-9 通過直接作 用于抑癌的 E-cadherin 蛋白 ， 上 調(diào) 編 碼 基 因

26、 VEGF 的 表 達(dá) 促 進(jìn) 了 血 管 生 成 ， 導(dǎo) 致 小 鼠 肺 部 微 小轉(zhuǎn)移灶形成 。 Valastyan 等 10檢測到高表達(dá)的 miR-31 可以通過多種機(jī)制抑制乳腺癌細(xì)胞的 轉(zhuǎn)移 。 Sachdeva 等 11在乳腺癌動(dòng)物模型的侵襲轉(zhuǎn)移研究中發(fā)現(xiàn) ，miR-145 作為一種抑癌基因 ， 不但可以抑制腫瘤的生長 ， 還可以通過沉默腫瘤轉(zhuǎn)移相 關(guān) 基 因 MUC1 ， 從 而 抑 制 腫 瘤 的 侵 襲 和肺轉(zhuǎn)移 。 這些研究提示 ，miRNA 分子廣泛參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的基因表達(dá)調(diào)控 。 隨 著計(jì)算機(jī) RNA 組學(xué) 和 生 物 信 息 學(xué) 的 發(fā) 展 ， 現(xiàn) 在 已 經(jīng)

27、 可 能 逐 一 找 到 miRNA 的靶基因 ， 從而揭 示它們的功能 12。 通過應(yīng)用 Pictar、Targetscan、MiRanda 等 miRNA 靶基因預(yù)測軟件，本研究發(fā)現(xiàn) miR-98 的 靶 基 因 為 Ras 和 HMGA2，miR-320 的 靶 基 因 為 ITG3 ，miR-509-3p 的 靶 基 因 為 CD164 ， 這些編碼基因均與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān) ， 進(jìn)一步的干預(yù)實(shí) 驗(yàn)將 明 確 這 些 miRNA 在 涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制 。 參 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 考 文 獻(xiàn) Shi H ，Wang J ， Dong F ，

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