淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測

1、淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺的高效液相色譜檢測         【摘要】  目的：建立預處理淋巴細胞樣品后經高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測淋巴細胞合成和釋放兒茶酚胺（catecholamines，CAs）的方法，并為淋巴細胞合成和釋放CAs提供直接的證據。方法：淋巴細胞培養(yǎng)液上清經氧化鋁吸附，高氯酸洗脫；淋巴細胞經破細胞，去蛋白，高氯酸提取；采用AtlantisC18反相色譜柱分離淋巴細胞培養(yǎng)液上清以及細胞中的CAs，電化學檢測器

2、檢測。結果：CAs分離效果良好，22 min內完成測定，各峰形對稱，雜質峰少。用刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）誘導的淋巴細胞培養(yǎng)液上清中去甲腎上腺素含量最高，其次是多巴胺，腎上腺素最少；而Con A刺激的淋巴細胞內多巴胺的含量最高，其次為去甲腎上腺素，腎上腺素最少。結論：對淋巴細胞樣品進行預處理能提高HPLC檢測的靈敏度、減少干擾，這種方法可直接檢測到淋巴細胞合成和釋放CAs。 【關鍵詞】  淋巴細胞；兒茶酚胺；高效液相色譜法   Abstract   Objective: To establish an improve

3、d method in order to effectively determine levels of catecholamines (CAs) including norepinephrine (NE), epinephrine (E) and dopamine (DA) in the cultured lymphocytes and in the supernatants of the cultures by high performance liquid chromatography(HPLC). Methods: The CAs were extracted from lymphoc

4、ytes by ultrasonication and from the extracellular medium by alumina absorption. Atlantis C18 column with electrochemical detection to was used simultaneously determine NE, E and DA in lymphocytes and the extracellular medium. Results: CAs including DA, NE and E in the concanavalin A(Con A)-activate

5、d lymphocytes and their supernatants were able to be determined. Among the three kinds of CAS, DA had the highest content(1.922×10-19 mol/L·cell), E had the lowest content (0.612×10-19 mol/L·cell), and NE had intermediate (1.452×10-19 mol/L·cell). In the supernatants, N

6、E content was the highest (2.44×10-9 mol/L), DA medium(1.436×10-9 mol/L) and E the lowest (1.14×10-9 mol/L). Conclusion: The improved HPLC method can effectively detect CA levels including NE, E and DA in the cultured lymphocytes and the cultured supernatants, and it shows that lympho

7、cytes have the ability to synthesize and secrete CAs.   Key words   Lymphocyte; Catecholamines; High performance liquid chromatography   機體內兒茶酚胺（catecholamines，CAs）包括去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、腎上腺素（epinephrine，E）和多巴胺（dopamine，DA）。近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞也能合成CAs，發(fā)揮免疫調節(jié)作用1，2，3。但關于淋巴細胞

8、合成和分泌CAs的直接證據目前仍未見報道。CAs的測定方法主要有三羥基吲哚法、乙二胺縮合法、放射酶學法、氣相色譜法、色質聯(lián)用法及稀土離子熒光探針法等，但存在成本高、步驟繁瑣，靈敏度低等缺點。隨著色譜技術的發(fā)展及日趨完善，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）以其靈敏度高、重復性好的優(yōu)點正逐漸取代其它檢測方法，成為臨床上檢測生物樣品中CAs含量最可靠的方法之一。然而，由于淋巴細胞合成和釋放的CAs極微量，本研究對淋巴細胞樣品進行前期預處理，去除干擾因素，然后再采用HPLC經AtlantisC18反相色譜柱分離，電化學檢測法檢測，能

9、很好地優(yōu)化檢測條件，取得了滿意的分離檢測效果。   1   材料與方法   1.1   淋巴細胞培養(yǎng)   SD大鼠（SPF級），體重200250 g，雌雄兼用，由南通大學實驗動物中心提供。大鼠行頸椎脫臼法處死，無菌條件下取腸系膜淋巴結，以RPMI-1640基礎培養(yǎng)液洗滌，碾碎，過濾，并以RPMI-1640基礎培養(yǎng)液離心（200 g，5 min）洗滌3次。以完全培養(yǎng)液將細胞沉淀重懸，混勻。滴于計數板上計數，調整細胞濃度為（12）×106個細胞/ml，每ml細胞懸液中加入刀豆蛋白A（con

10、canavalin A，ConA）5 l，置于37、5CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48小時。   1.2   樣品預處理   取培養(yǎng)48小時后的淋巴細胞懸液，離心（200 g，5 min），將細胞與培養(yǎng)液分離。取分離出的培養(yǎng)液上清，加入等體積的0.5 mol/L的Tris（pH=10）、50 mg氧化鋁（預先在105中烘烤至少3小時）、適量的3,4-二羥基芐胺（dihydroxybenzylamine，DHBA）作為內標，輕搖15 min，離心去上清，用超純水洗滌沉淀3遍，再加入0.5 ml 0.5 mol/L的高氯酸，充分振蕩，離心2

11、00 g×8 min后取上清，用于HPLC測定。每毫升細胞沉淀中加入150 l的0.1N高氯酸，置于超聲波細胞粉碎儀上對細胞進行破碎，后加入150 l的0.8 N高氯酸，離心（200 g，4，10 min）后取上清，其中加入適量的DHBA，用于HPLC測定。   1.3   儀器和試劑   高效液相色譜儀，1525泵，2465電化學檢測器，717自動進樣器，Empower工作站；AtlantisC18，4.6×250 mm 柱，5 m色譜柱；玻璃碳工作電極，即位參比電極（ISAAC電極）均為美國Waters公司生產

12、。NE、E和DA均為美國Sigma公司產品，B8為天津試劑二廠進口分裝，甲醇HPLC級，偏重亞硫酸鈉等其它試劑均為國產優(yōu)級純產品。   1.4   色譜條件   （1）標準品配置：分別稱取一定量的NE、E、DA，用溶解液（0.05 N HCl，偏重亞硫酸鈉0.1%，EDTA·2Na 50 mg/L）溶解，配成濃度為1 mg/100 ml的儲備液，分裝后80保存。儲備液用流動相稀釋1000倍，配成10 pg/l的CAs標準品，并加適量的DHBA，限當日使用;（2）流動相配置：NaH2PO4 50 mmol/L，檸檬酸鈉50 m

13、mol/L，EDTA·2Na 20 mg/L，NaCl 2 mmol/L，B8 0.25 mmol/L，用H3PO4調pH值4.3，用0.22 m膜過濾備用。儀器工作條件：流動相流速為1 ml/min，工作電壓為0.42 V，電極工作電壓為600 V，電極工作室溫度為37。   1.5   統(tǒng)計學方法   本實驗數據都用x±s表示，采用Stata 7.0統(tǒng)計軟件中Students t檢驗和方差分析進行數據的處理，以P0.05示差異具有統(tǒng)計學意義。      

14、;      2   結   果   2.1   色譜圖   按照NE、E、DHBA、DA順序出峰，22 min內完成測定。淋巴細胞培養(yǎng)液上清中NE、E、DHBA、DA的保留時間分別為5.8 min、9.4 min、11.1 min、18.8 min；淋巴細胞裂解液中NE、E、DHBA、DA的保留時間分別為5.3 min、8.5 min、9.9 min、16.6 min。各組出峰時間因受流動相流速、柱溫、流動相的離子強度等的影響而略有差異。圖1、2中可見各

15、峰形對稱，分離效果良好。   2.2   線性范圍與最低檢測限   在本色譜條件下, NE、E、DA樣品量 202000 pg之間與峰面積有良好線性關系。最低檢測限分別為: NE 0.91 pg、E 1.26 pg、DA 2.43 pg。   2.3   樣品測定結果   用Con A誘導的淋巴細胞培養(yǎng)液上清中CAs含量及用Con A誘導的淋巴細胞裂解液中CAs含量見圖3、4。   3   討   論 &#

16、160; CAs作為神經遞質和激素與人們的健康和疾病有密切關系1。傳統(tǒng)觀點認為，CAs主要由神經細胞和內分泌細胞合成和釋放，近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫細胞也能合成和釋放CAs，并通過自分泌和旁分泌途徑作用于自身，發(fā)揮免疫調節(jié)作用25。我們以往的研究證明淋巴細胞內存在合成CAs的酶TH2，3。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，Con A刺激的淋巴細胞培養(yǎng)液上清中NE含量最高，其次是DA，E含量最少；而Con A刺激的淋巴細胞內DA的含量最高，其次為NE，E最少。   目前臨床上建立的高效液相色譜電化學檢測法主要是檢測血中和尿中CAs的含量，而高效液相色譜法又包括電化學檢測、紫外檢測和熒光檢測法等，

17、其中高效液相色譜電化學檢測法靈敏度最高，方法簡單、快速、重復性好。以往我們檢測之前對樣品不做特殊處理并使用外標法進行分析2，3，7，由于淋巴細胞培養(yǎng)液上清及細胞裂解液中包含許多復雜成分，所以結果雖能檢測到DA、NE、E，但DA、NE、E 3種物質檢測峰之間可見許多雜質峰，只能靠與同等色譜條件下檢測出的標準品中3種檢測峰位置的對比來確定DA、NE、E的位置。因此我們選用內標法分析，并對樣品進行濃縮和純化5, 6, 8。淋巴細胞培養(yǎng)液上清先經氧化鋁吸附CAs、以去除培養(yǎng)液中的復雜成分，然后用高氯酸洗脫CAs，以便上樣檢測；細胞中加入低滲的高氯酸進行裂解，再用高濃度的高氯酸去除蛋白，得到純化的樣品。

18、經過這樣的處理，淋巴細胞培養(yǎng)液上清以及細胞裂解液中的CAs得到了濃縮和純化，去除了雜質峰。同時，我們在標準品和樣品中添加DHBA作為內標，根據DHBA檢測峰的位置，再結合標準品，使DA、NE、E檢測峰的位置一目了然，以便于結果的統(tǒng)計分析。   本研究一方面為淋巴細胞合成和釋放CAs提供了直接的證據，另一方面通過對樣品進行預處理，使測定CAs的高效液相色譜電化學檢測法更穩(wěn)定、干擾更少，方法更準確、可靠。樣品預處理方法比較簡單、快速，能滿足細胞樣品中低含量或微量CAs的檢測，適用于臨床診斷和科研工作中生物樣品微量CAs的測定?！緟⒖嘉墨I】  1 Qiu YH, Che

19、ng C, Dai L, et al. Effect of endogenous catecholamines in lymphocytes on lymphocyte functionJ. J Neuroimmunol, 2005, 167(1): 45-47. Qiu YH, Peng YP, Jiang JM, et al. Expression of tyrosine hydroxylase in lymphocytes and effect of endogenous catecholamines on lymphocyte functionJ. Neuroimmunomodulation, 2004, 11(1): 75-76. Jiang JL, Qiu YH, Peng YP, et al. Immunoregulatory role of endogenous catecholamines synthesized by immune cells J. Acta Physiologica Sinica, 2006, 58(4): 309-310. Cosentino M, Marino F, Bombefli R