第四章+抗體人工制備

1、第四章 抗體的人工制備章節(jié)安排章節(jié)安排第一節(jié)第一節(jié) 多克隆抗體多克隆抗體第二節(jié)第二節(jié) 單克隆抗體單克隆抗體第三節(jié)第三節(jié) 基因工程抗體基因工程抗體第四節(jié)第四節(jié) 催化抗體催化抗體目的與要求目的與要求 1、掌握單克隆抗體和多克隆抗體的概念、制備、掌握單克隆抗體和多克隆抗體的概念、制備原理及其制備的具體過程原理及其制備的具體過程 。 2、了解基因工程抗體與催化抗體的概念及意、了解基因工程抗體與催化抗體的概念及意義義 。難點(diǎn)與重點(diǎn)難點(diǎn)與重點(diǎn) 重點(diǎn)與難點(diǎn)：單克隆抗體和多克隆抗體的概念、重點(diǎn)與難點(diǎn)：單克隆抗體和多克隆抗體的概念、制備原理及其制備的具體過程制備原理及其制備的具體過程 。 為了研究抗體的理化性質(zhì)

2、、分子結(jié)構(gòu)與功能，及應(yīng)用抗體于臨床疾病的診斷、治療及預(yù)防都需要人工制備抗體。目前，根據(jù)制備的原理和方法可分為四類： 多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體 催化抗體大多數(shù)天然抗原物質(zhì)(如細(xì)菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機(jī)體產(chǎn)生一種特異性抗體。多克隆抗體：多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體后，由多個(gè)免疫淋巴細(xì)胞分泌的多種抗體的混合物。 第1節(jié) 多克隆抗體一、概念二、多克隆抗體制備的基本過程試血測定抗體效價(jià)血清的分離與保存多抗的純化與標(biāo)記多抗的親和層析 抗體的保存緩沖體系防腐劑穩(wěn)定劑濃度存儲(chǔ)時(shí)間（多頭加樣槍）（多頭加樣槍）排槍ELISA板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

3、第二節(jié) 單克隆抗體一、單克隆抗體的概念1、概念：由一個(gè)B細(xì)胞分化增殖的子代細(xì)胞(漿細(xì)胞)產(chǎn)生的針對(duì)單一抗原決定簇的抗體。2、特點(diǎn)：抗體的重鏈、輕鏈及其V區(qū)獨(dú)特型的特異性、親和力、生物學(xué)性狀及分子結(jié)構(gòu)均完全相同。 這種雜交瘤細(xì)胞：既具有骨髓瘤細(xì)胞能大量無限生長繁殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞合成和分泌抗體的能力。 10:1雜交瘤細(xì)胞一般采用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）、氨基喋呤（Aminoopterin，A）及胸腺嘧啶（Thymidine，T），利用A阻斷核酸的主要生物合成途徑。代謝缺陷型細(xì)胞株缺失旁路DNA合成所需的酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷酸轉(zhuǎn)移

4、酶（HGPRT），不能利用外源性的核苷酸前體，如H和T，喪失DNA合成的旁路途徑；只能通過以葉酸為媒介，由氨基酸和其它小分子化合物合成核苷酸進(jìn)行DNA合成。一旦葉酸衍生物的合成被HAT培養(yǎng)液中的A阻斷，這些細(xì)胞因?yàn)槭NA合成的主通道，又無能力從旁路合成DNA而死亡。正常細(xì)胞在H和T存在的情況下，可利用旁路途徑繼續(xù)合成核酸。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞株為代謝缺陷型細(xì)胞株，融合后在HAT培養(yǎng)基中不能生長，而融合細(xì)胞由于含有來自正常細(xì)胞的HGPRT酶，在HAT培養(yǎng)基中可以存活。 單克隆抗體的制備過程：在細(xì)胞內(nèi)DNA合成一般有兩條途徑，主途徑是在細(xì)胞內(nèi)由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，而氨

5、基喋呤可以阻斷此途徑。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤細(xì)胞的DNA合成沒有此輔助途徑。 在用HAT選擇培養(yǎng)12d內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，34d后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持710d后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每23d換一半培養(yǎng)液。單克隆抗體的制備過程：（1）天然抗原的制備；（2）免疫動(dòng)物的確定、免疫劑量及免疫次數(shù)的確定；（3）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備；（4）小鼠采血測定抗體效價(jià)；（5

6、）小鼠脾細(xì)胞的制備及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備；（6）小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合；（7）陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選；（8）抗體的篩選；（9）陽性雜交瘤細(xì)胞腹腔注射小鼠，大量制備單克隆抗體。單克隆抗體的制備過程：在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells）。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)

7、胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。飼養(yǎng)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖細(xì)胞密度過低不利于細(xì)胞生長繁殖常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞常用小鼠腹腔細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞其中還有清除死亡細(xì)胞的作用其中還有清除死亡細(xì)胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過飼養(yǎng)存活一般不超過2 2周，不影響雜交瘤細(xì)胞周，不影響雜交瘤細(xì)胞的純化的純化飼養(yǎng)細(xì)胞：腹腔巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞：腹腔巨噬細(xì)胞或脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞-漿母細(xì)胞，處于增殖狀態(tài)的B細(xì)胞。漿母細(xì)胞又稱原漿細(xì)胞，為未成熟的漿細(xì)胞前體。 漿細(xì)胞：能夠合成和分泌免疫球蛋白的終末分化階段的B細(xì)胞。正

8、常機(jī)體漿細(xì)胞存在在脾、淋巴結(jié)的相應(yīng)組織結(jié)構(gòu)處。 B淋巴細(xì)胞的增殖分化：原B細(xì)胞 前B細(xì)胞 不成熟B細(xì)胞 成熟B細(xì)胞出現(xiàn)膜型IgM出現(xiàn)IgM，IgD在骨髓中：抗原刺激漿母細(xì)胞（免疫脾細(xì)胞）漿細(xì)胞，存在時(shí)間短，2-3d分泌抗體記憶型B細(xì)胞，表達(dá)膜型Ig，存活幾周或幾個(gè)月抗原刺激較高水平免疫應(yīng)答高親和力識(shí)別抗原抗原刺激更高親和力注意免疫學(xué)相關(guān)知識(shí)：1、免疫小鼠的日齡及性別： SPF Balb/c小鼠 ，612周齡，體重為 1822g，雌 性（便于操作），分成3組，每組4只 。2、免疫程序：一免，二免（15d），三免(29d)。3、免疫方式： 體內(nèi)免疫：免疫原性強(qiáng)、來源充分的抗原 體外免疫：免疫原性很

9、弱或?qū)C(jī)體有害（如引起 免疫抑 制）的抗原。 體外免疫體外免疫：將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。 其基本方法：取48 周齡BALB/c 小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌23次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.55ug/ml，細(xì)胞抗原105106 個(gè)細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c 小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；37 5%CO2 濃度下培養(yǎng)3-5 天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。4、免疫途徑：最常用腹腔多點(diǎn)注射。常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹 腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、

10、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者。5、免疫佐劑：首免，弗氏完全佐劑（油包水的乳濁 液，含有結(jié)合分枝桿菌的細(xì)胞壁成分）；等體積 二免、三免，弗氏不完全佐劑（不含結(jié)合分枝桿菌）。等體積注意免疫學(xué)相關(guān)知識(shí)：腹腔注射3、優(yōu)點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)（1）制備時(shí)不需純化抗原就可得到純抗體； （2）有很高的效價(jià) （3）有高度的單一性、均一性； （4）產(chǎn)量高，且可連續(xù)生產(chǎn) 。5 5、單克隆抗體的應(yīng)用、單克隆抗體的應(yīng)用（1）診斷試劑：用于各種病原體以及腫瘤的診斷。 避免了多克隆抗體的交叉反應(yīng)（2）治療試劑：獸醫(yī)臨床上傳染病的治療；醫(yī)學(xué)臨床上抑制器官移植排斥、治療自身免疫疾病、制備生物導(dǎo)彈。（3

11、）檢測試劑：各種病原體毒力因子的檢測；各種免疫細(xì)胞及其它組織細(xì)胞表面分子的檢測。（4）抗原純化：利用單克隆抗體的特異性，可將單克隆抗體與瓊脂糖等偶聯(lián)制成親和層析柱，可從混合組分中提取某種抗原成分。 制備疫苗“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼，是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動(dòng)素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動(dòng)導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。 自1975年單克隆抗體雜交瘤技術(shù)

12、問世以來，單克隆抗體在醫(yī)學(xué)中被廣泛地應(yīng)用于疾病的診斷及治療。但目前絕大數(shù)單克隆抗體是鼠源的，臨床重復(fù)給藥時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體，使臨床療效減弱或消失。因此，醫(yī)學(xué)臨床上最理想的單克隆抗體應(yīng)是人源的,但人-人雜交瘤技術(shù)目前尚未突破。第三節(jié) 基因工程抗體 目前較好的解決辦法是能研制基因工程抗體，以代替鼠源單克隆抗體用于臨床?；蚬こ炭贵w興起于80年代早期，是利用DNA重組技術(shù)，在分子水平對(duì)抗體基因進(jìn)行切割、拼接或修飾，或人工合成后導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)，從而產(chǎn)生的新型抗體，也稱為第三代抗體。 研究成功的基因工程抗體有：嵌合抗體、重構(gòu)抗體、小分子抗體等。一、概念利用基因工程技術(shù)制備的抗體分子 。 按人類設(shè)計(jì)所重

13、新組裝的新型抗體分子，可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)(如Fc片段)，從而可克服單克隆抗體在臨床應(yīng)用方面的缺陷(如鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)使用會(huì)引起抗體產(chǎn)生而降低其效果，F(xiàn)c片段的無效性和副作用)，更具有廣闊的應(yīng)用前景。二、特點(diǎn)嵌合抗體(chimeric antibody)是指在同一抗體分子中含有不同種屬來源抗體片段的抗體，又稱雜種抗體。 重構(gòu)抗體 ：將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)的編碼基因中，再將此DNA片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。 單鏈抗體(single-chain antibody)又稱Fv分子，由VL

14、區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物(1inker)連接而成。 噬菌體抗體：噬菌體抗體：將抗體可變區(qū)基因與編碼噬菌體外將抗體可變區(qū)基因與編碼噬菌體外殼蛋白的基因融合而成的一種基因工程抗體殼蛋白的基因融合而成的一種基因工程抗體 。催化抗體催化抗體 (catalytic antibody) ： 也叫抗體酶也叫抗體酶(abzyme)，是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。性和酶的高效催化性。第四節(jié) 催化抗體一、催化抗體的概念 催化抗體(catalytic antibody)也叫抗體酶(abzyme)，是具有催化活性的免

15、疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。 抗體制備技術(shù)的開發(fā)預(yù)示著可以人為生產(chǎn)適應(yīng)各種用途的，特別是自然界不存在的高效的催化劑，對(duì)生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)藥等多種學(xué)科有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。二、催化抗體的制備二、催化抗體的制備 目前，催化抗體的制備采用化學(xué)和免疫相結(jié)合的方法，首先模擬酶作用于底物時(shí)的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，化學(xué)合成相應(yīng)的類似物，即半抗原，用以免疫動(dòng)物，再用單克隆技術(shù)，篩選獲得單克隆抗體。 對(duì)催化抗體的研究，開創(chuàng)了一條人工設(shè)計(jì)酶的新途徑，為尋找新型、高效、高選擇性催化劑創(chuàng)造了條件。1、細(xì)胞融合法、細(xì)胞融合法 首先通過化學(xué)反應(yīng)合成反應(yīng)物的過渡態(tài)類似物（通常是半抗原），經(jīng)與載體蛋白偶聯(lián)，制

16、成抗原免疫BALBc小鼠，應(yīng)用B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制針對(duì)該過渡態(tài)類似物的特異性單抗，亦即抗體酶。這種單抗與反應(yīng)物的過渡態(tài)結(jié)合降低了反應(yīng)的活化能，從而加速該反應(yīng)的進(jìn)行。2、抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法 抗體酶和酶一樣可用化學(xué)修飾法加以改造。對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團(tuán)。游離巰基就是適合的基團(tuán)之一，它具有高親和性、易于氧化、及能通過二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。 3、引入輔助因子法引入輔助因子法 很多天然酶活性中心都含有金屬離子。將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵的選擇性水解，且通過羧酸根及仲胺基與金屬離子相連。將此半抗原通過共價(jià)鍵連接在載體蛋白上免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵。 4、基因工程抗體技術(shù)、基因工程抗體技術(shù) 該技術(shù)在抗體酶制備中具有誘人的前景。應(yīng)用噬菌體抗體展示技術(shù)或全套抗體基因庫，并輔以計(jì)算機(jī)模擬，為篩選特定目的高效催化抗體提供了豐富的資源和技術(shù)支撐。三、催化抗體的應(yīng)用三、催化抗體的應(yīng)用1、抗體酶為切割蛋白質(zhì)和核酸提供一系列特異性高的工具，為疾病的治療和預(yù)防開辟新途徑。 2、抗體酶在戒毒方面亦有重要應(yīng)用價(jià)值。 用病毒特