鏈霉菌室實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)

1、鏈霉菌室實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)(2003年第一章培養(yǎng)基抗生素生長(zhǎng)因子 (3常用抗生素及其使用濃度 (3LB(Luria-Bertani培養(yǎng)基 (3LA (3基本培養(yǎng)基(MM (3R5(1L鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)用 (4YEME(酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基 1L(液體培養(yǎng)鏈霉菌 (4TSBY (1L(液體培養(yǎng)鏈霉菌 (4MS培養(yǎng)基 (52CMY培養(yǎng)基(用于井崗的接合轉(zhuǎn)移 (5YMS培養(yǎng)基(阿維,井崗產(chǎn)孢 (5YD培養(yǎng)基 (5生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的使用濃度 (6第二章DNA基本操作 (7大腸桿菌質(zhì)粒的抽提 (7酶連反應(yīng) (7DNA片段凝膠回收 (8DNA純化 (9E.coil總DNA的提取 (9鏈霉菌質(zhì)粒DNA的小量提取

2、(還需改進(jìn) (10去磷酸化處理(詳見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南以及Takara的CIAP使用說(shuō)明 (10AT克隆(詳見說(shuō)明書 (10Southern Blot (11第三章PCR及相關(guān)技術(shù) (13PCR (13PCR重組(詳見PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南p429 重疊延伸技術(shù) (14PCR定點(diǎn)誘變(DpnI法 (14第四章基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù) (15大腸桿菌CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞及DNA轉(zhuǎn)化 (15DNA轉(zhuǎn)化 (15大腸桿菌質(zhì)粒的快速檢測(cè) (15接合轉(zhuǎn)移(詳見英文手冊(cè)249頁(yè) (16鏈霉菌原生質(zhì)體的制備 (16鏈霉菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 (17PCR-Targeting技術(shù)中E.coli電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化 (1

3、7第五章RNA操作技術(shù) (19鏈霉菌總RNA的抽提 (19鏈霉菌的RT-PCR(promega RT kit (19第六章蛋白質(zhì)基本操作技術(shù) (21SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)染色 (21大腸桿菌可溶性蛋白表達(dá)及抽提(用于由IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)體系: (21鏈霉菌總蛋白抽提: (22大腸桿菌目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)及總蛋白檢測(cè)(含T7表達(dá)系統(tǒng)如BL21菌株中的pET系列表達(dá)體系: (22Western Blot (23第七章遺傳作圖相關(guān)技術(shù) (25鏈霉菌孢子懸液的制備 (25鏈霉菌中NF的證明 (25孢子雜交 (25在遺傳圖譜上兩個(gè)標(biāo)記基因之間定位新的基因 (25第八章其他技術(shù) (27鏈霉菌菌種保藏 (2

4、7檢測(cè)鏈霉菌淀粉酶的活性 (27第一章培養(yǎng)基抗生素生長(zhǎng)因子常用抗生素及其使用濃度抗生素英文名稱及縮寫抗性基因貯藏液濃度(mg/ml使用終濃度(g/ml鏈霉菌大腸桿菌M M2CM Y E M E L A或L B氨芐青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壯觀霉素鏈霉素硫鏈絲菌素紅霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aph

5、aadAstrtsrerm Eaac(3IV10025(無(wú)水乙醇配5025505025(DMSO配10050R10102?5010510010R-2550502510-50R-50-2.5-5050-1002550505025不敏感2030-50*表示無(wú)記錄或不能使用,貯存液除特別說(shuō)明外均用無(wú)菌水配制*此表僅供參考!*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性,所以同時(shí)具有這兩種抗性基因時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高抗生素的量,并作好對(duì)照。*Hyg易見光分解,應(yīng)用錫箔紙包好。*有些抗生素需要在低鹽的環(huán)境(如DNA培養(yǎng)基下篩選效率較高,如Hyg, Km, VioLB(Luria-Bertani培養(yǎng)基胰蛋白胨10g,酵母

6、抽提物5g,NaCl 5g,葡萄糖1g,蒸餾水加至1000ml,pH7.3左右(滅菌后第一次用時(shí)還要調(diào)一次LALB中加入終濃度為 1.5-2%的瓊脂粉(不同的瓊脂加的量不同,如青島瓊脂大概需1.5%,而華美的需要2%。*做藍(lán)白斑篩選時(shí)不加葡萄糖基本培養(yǎng)基(MM溶液:L-天冬酰胺0.5g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸餾水至1000ml將每250ml溶液分裝到裝有2.5g瓊脂的500ml三角瓶中,滅菌,使用時(shí)每瓶加入50%葡萄糖(8磅滅菌5ml,調(diào)pH7.0。配置MM的瓊脂有l(wèi)ab agar、Ice agar(IA

7、R5(1L鏈霉菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)用蔗糖103gK2SO4 0.25gMgCl2·6H2O 10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES 5.73g加蒸餾水至1000ml稱取5.5g Difco瓊脂放入500ml三角瓶中,倒入250ml上述溶液,然后塞上塞子后8磅滅菌(114度15分種。使用時(shí),將培養(yǎng)基融化,每瓶中加入:KH2PO4(0.5% 2.5mlCaCl2·2H2O(5M 1mlL-脯氨酸(20% 3.75mlNaOH(1M調(diào)pH至7.3對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株加入適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)因子(請(qǐng)參考手冊(cè)YEME(酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基

8、 1L(液體培養(yǎng)鏈霉菌Oxoid酵母提取物3gOxoid蛋白胨Tryptone 5g麥芽提取物(BD公司原Difco公司2186303g葡萄糖10g蔗糖*340g蒸餾水至1000ml高壓滅菌后加入:(8磅滅菌,113-114C,15min,自動(dòng)滅菌鍋一次不能滅過(guò)多東西,否則會(huì)滅不徹底。MgCl2·6H2O(2.5M 2ml/L制備原生質(zhì)體時(shí),還要加入:甘氨酸(20%*25ml/L*蔗糖的主要作用是維持鏈霉菌生長(zhǎng)時(shí)的滲透壓。*甘氨酸被認(rèn)為能干擾鏈霉菌細(xì)胞壁的形成,使菌絲體片段更短,利于溶菌,有利于外源DNA的導(dǎo)入。TSBY (1L(液體培養(yǎng)鏈霉菌Oxoid胰胨豆湯粉(TSB30g蔗糖*

9、340gOxoid酵母抽提物5g蒸餾水至1000ml*不同菌株培養(yǎng)需要不同濃度的蔗糖,蔗糖的主要作用是維持鏈霉菌生長(zhǎng)時(shí)的滲透壓。MS培養(yǎng)基將黃豆餅粉加蒸餾水煮2到3小時(shí),用紗布過(guò)濾得到濾液,將每250ml濾液分裝到裝有5g 瓊脂,5g 甘露醇的500ml三角瓶中,10磅滅菌,使用時(shí)調(diào)pH7.2-7.3。2CMY培養(yǎng)基(用于井崗的接合轉(zhuǎn)移可溶性淀粉10g胰蛋白胨2gNaCl 1g(NH4 2SO4 2gK2 HPO4 1gCaCO3 2g無(wú)機(jī)鹽溶液* 1 ml瓊脂20g蒸鎦水1000 mlPH7.2無(wú)機(jī)鹽溶液(每升FeSO4 .7H2 O 1gMgCl.6 H2 O 1gZnSO4. 7H2 O

10、 1gYMS培養(yǎng)基(阿維,井崗產(chǎn)孢酵母抽提物4g可溶性淀粉4g麥芽糖10gCoCl. .6 H2 O 5mg瓊脂20g蒸鎦水1000 mlPH7.2YD培養(yǎng)基酵母抽提物4g麥芽糖10g葡萄糖4gMgCl 2gCaCl 1.5g瓊脂15g蒸鎦水1000 mlPH7.2生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的使用濃度天藍(lán)色鏈霉菌1258 、J1501等都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,培養(yǎng)這些菌株時(shí)一般需向培養(yǎng)基中補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)因子,使用濃度如表生長(zhǎng)因子補(bǔ)充物的使用濃度表化合物儲(chǔ)存液(mg/ml1終作用濃度(g/ml組氨酸(Histidine10 50其它氨基酸27.5 371.5 7.5腺嘌呤,鳥嘌呤,胸腺嘧啶,尿嘧啶維生素0.1 0.5

11、1.儲(chǔ)存液用無(wú)菌去離子水配置,8磅滅菌后4o C保存。2.對(duì)于半胱氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,補(bǔ)充光氨酸。第二章DNA基本操作大腸桿菌質(zhì)粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法1.接種5ml LB,37搖床過(guò)夜培養(yǎng)(12小時(shí)2.離心,3000rpm,5min去上清3.振蕩混勻沉淀,分裝在2個(gè)離心管中,spin一下,吸去上清,加入150l的溶液I(50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0, 10mmol/L EDTA(PH8.0 在10lbf/in2(6.895×104Pa高壓蒸氣下滅菌15min(8磅,貯存于4,劇烈振蕩5分鐘打散菌體(菌體不打散容易在產(chǎn)物中出現(xiàn)較

12、多蛋白。4.加入300l溶液II(0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液現(xiàn)配現(xiàn)用后立即振蕩混合均勻,處理2分鐘后加入225l溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml混合均勻,12000rpm離心5min,取上清液中于新的離心管。5.加120l酸性苯酚/氯仿溶液,振蕩混勻,12000rpm離心5min,再取上清液中于新的離心管中。6.用120ul氯仿重復(fù)操作5。7.加等體積的異丙醇或2倍體積的乙醇,混勻,12000rpm離心7min。8.沉淀用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50烘干后加適量無(wú)菌去離子水(ddH2O溶解,-20保存。氯化鋰抽提

13、法1.前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法(用Solution I II III處理2.加等體積的異丙醇,混勻,沉淀DNA,12000rpm離心7min。去上清,盡量去干凈。3.用少量70%乙醇洗一下(洗去異丙醇,離心去盡酒精,50烘干沉淀,用適量ddH2O(100ul充分溶解(可在50度水浴中助溶后加入4/5體積的氯化鋰溶液(濃度約10mol/L處理1min沉淀RNA和蛋白。4.12000rpm離心5min,取上清液于新的離心管中,用等體積的異丙醇混勻,12000rpm離心8min,去上清。5.將沉淀用70%乙醇洗滌兩次,每次10min。50烘干后加一定量的無(wú)菌去離子水(ddH2O溶解,-20保存。

14、酶連反應(yīng)一般采用10l反應(yīng)體系:T4連接酶1l ,連接酶緩沖液1l ,外源片段與載體按DNA 摩爾含量3:1加入即可。如果是粘端連接,則需把外源片段和載體的混合物在50度處理10分鐘使粘端變性,然后立即放入冰中5分鐘。平端連接采用14度,粘端連接采用16度,連接4小時(shí)以上(一般可過(guò)夜。*外源片段與載體按DNA 摩爾含量為3:1或外源更多。DNA片段凝膠回收1試劑盒回收 (離心法(詳見說(shuō)明書(1在長(zhǎng)波紫外燈下切下含有目標(biāo)DNA的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸干凝膠表面的液體并切小.計(jì)算凝膠的重量,該重量作為一個(gè)凝膠體積(如1oomg=1ooul(2根據(jù)凝膠的濃度,加DE-A 液凝膠濃度DE-A溶液體積1.

15、0% 3個(gè)凝膠體積1.5% 4 個(gè)凝膠體積2.0% 5 個(gè)凝膠體積混勻后于75o C加熱,(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于45o C加熱,間斷混合,直到凝膠熔化(6-8分鐘. (3加0.5個(gè)DE-A體積的DE-B溶液,混勻(是否需調(diào)整PH值,見注意事項(xiàng)1;當(dāng)分離的DNA片段小與400bp 時(shí),加入異丙醇至終濃度為20%;(4吸3中的混合液,轉(zhuǎn)移到DNA制備管,3600rpm離心1分鐘.如制備管中有殘留,適當(dāng)提高速度,再離心1分鐘,去濾液;(5將制備管置回離心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm離心30,棄濾液;(6將制備管置回離心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm離心30,棄濾液,重復(fù)一次;

16、 (W2中含有酒精,應(yīng)保證瓶子密封。(7將制備管置回離心管,最高速度離心1分鐘;(8將制備管置潔凈的1.5 ml 離心管中,在DNA制備膜正中央加25ul水或洗脫液,室溫靜置1分鐘.最高速度離心1分鐘洗脫DNA.注意事項(xiàng);1.此法適合從TAE或TBE瓊脂糖凝膠中回收DNA,用其他緩沖液時(shí),加DE-B溶液后,溶液的PH要調(diào)整到6.5以下.2.勿將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫下,線型DNA于高溫條件下易水解.勿將凝膠長(zhǎng)時(shí)間暴露在紫外燈,減少紫外燈對(duì)DNA的損傷.3.2步驟中的凝膠必須完全熔化,否則將嚴(yán)重影響DNA的回收效率.4.步驟4中吸回濾液到DNA制備管中再吸附一次,可提高回收效率.將洗脫液或水加熱

17、到60C,可提高回收效率。(重要5.DNA分子呈酸性,建議在洗脫液中保存。(試劑盒中提供的洗脫液好像對(duì)PCR有某種抑制作用。2 silica回收1 在長(zhǎng)波紫外燈下切下含有目標(biāo)DNA的瓊脂糖凝膠, 用紙巾吸干凝膠表面的液體并切小.計(jì)算凝膠的重量;2. 加入2-3倍體積的6M KI或NaI(避光4度保存;1.65 o C溫浴, 間斷混合,直到凝膠熔化;2.加適量的振勻的silica懸液(10ul充分混勻, 冰上放置15分鐘(或更長(zhǎng),間斷混合;3.5000rpm離心3分鐘, 棄上清;4.加1ml預(yù)冷的NEW buffer(先用100ul打散沉淀,再用900ul混勻,冰上洗鹽2 分鐘,間斷混合;5.1

18、2000 rpm離心10s, 棄上清;6.重復(fù)6,7步驟1次;7.于50 o C烘箱烘干;8.加10ul的去離子水用槍頭打勻,65 o C水浴15分鐘,間斷混勻;9.12000 rpm離心10 s,把上清轉(zhuǎn)移到另外潔凈的離心管中;10.跑膠檢測(cè)回收效率.注意事項(xiàng)*4-8步均在冰上操作,防止解吸附,silica只在低溫下對(duì)DNA有吸附作用。*NEW Buffer:(100ml1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去離子水加至100ml。(-20度保存*Silica配法見:TIG January 1

19、995 V ol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.DNA純化用苯酚:氯仿抽提1.把樣品至置于離心管中,加入等體積的苯酚:氯仿,2.混勻,使之成為乳濁狀;3.12000rpm離心, 5 分鐘:4.用槍頭把水相移到另一離心管中.5.加入等體積氯仿并重復(fù)246.用2/3體積的異丙醇(或2倍無(wú)水乙醇,1/10體積的3M醋酸鈉,沉淀10分鐘(-20度長(zhǎng)時(shí)間沉淀可提高產(chǎn)量7.12000rpm離心5分鐘,棄液體8.70%的乙醇洗鹽10分鐘,去上清,9.重復(fù)8一次,再12000rpm離心棄液體.10

20、.50度烘干.11.去離子水溶解。LiCl 抽提1把樣品至置于離心管中,加4/5體積10M LiCl2 室溫下靜置1分鐘3 12000rpm離心5分鐘4把液體轉(zhuǎn)移到另一離心管中5.加2/3體積的異丙醇沉淀10分鐘往下的步驟同于上面的8-12E.coil總DNA的提取1 將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌離心去上清。2 加500l水重懸浮,加入500l 2% SDS, 混合振蕩約1min,55溫育15min,直到溶液的粘度顯著下降。3 加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉(自然pH。4 加入150l中性苯酚,混合振蕩均勻后,12000rpm離心5min,移取上清液,棄去白色中間層。5 用中性苯酚/氯仿重復(fù)抽提

21、直至看不見(或非常少中間層為止,6 加入1倍體積的異丙醇(或2倍體積的無(wú)水乙醇,上下顛倒混合直至出現(xiàn)白色絮狀DNA 沉淀團(tuán),用吸頭挑出DNA沉淀團(tuán)。7 用70%乙醇洗滌DNA沉淀團(tuán)兩次。8 烘干,溶解DNA沉淀。鏈霉菌質(zhì)粒DNA的小量提取(還需改進(jìn)1 將適量的菌體懸浮于500l溶菌酶溶液(2%中,37溫育1hr 左右至完全溶菌,2 加入500l堿性SDS溶液(0.3mol/L NaOH, 2%SDS,立即振蕩混合完全,3 打開管蓋,在70放置15min(對(duì)大于20kb的質(zhì)粒則最好放在55, 30min,然后于水浴中冷卻至室溫,4 加入100l酸性苯酚/氯仿溶液,用混合器振蕩至液體徹底混合均勻,

22、12000rpm離心5min,移取上清液,棄去白色中間層。5 用中性苯酚/氯仿重復(fù)抽提直至看不見(或非常少中間層為止。6 在上清液中加入1/10體積的3M NaAc溶液和1倍體積的異丙醇沉淀5分鐘(或2.2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀1h,12000rpm離心8min,7用70%乙醇洗滌沉淀兩次,8干燥后加一定量的TE(d2H2O緩沖液溶解。另:可使用抽提總DNA的試劑盒,將總DNA與質(zhì)粒DNA一起抽提。去磷酸化處理(詳見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南以及Takara的CIAP使用說(shuō)明注:CIAP一般為原酶,酶量過(guò)大會(huì)失去粘性末端,因此應(yīng)適當(dāng)減小酶的用量,一般0.5 ul即可。也可減少溫浴時(shí)間,如37,1020mi

23、n即可。AT克隆(詳見說(shuō)明書所用的載體:pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor System1. 酶連(1體系10ulstandard Reation Positive control Background control2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligation 5ul 5ul 5ul pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor(50ng 1ul 1ul 1ulPCR product Xul - - Control insert DNA - 2ul -T4 DNA Ligase(3 weiss untis/ul 1ulDeion

24、ized water to a final volume of 10ul 10ul 10ul (2.反應(yīng)4o C過(guò)夜注:PCR產(chǎn)物和載體的摩爾比為:(ng of vector x kb size of insert/(kb size of vector*(insert: vector ration=ng of insert一般外源和載體的摩爾比例為3:1T載體大小為3bkb 50ng2. 轉(zhuǎn)化(1取大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞100ul, 連接產(chǎn)物2-5 ul 加入1.5ml的離心管中,混勻.冰上放置20分鐘.(242o C熱激90秒.(不要搖動(dòng)(3立即置冰上3-5分鐘.(4加1ml SOC培養(yǎng)基(室溫

25、(537o C培養(yǎng)1.5小時(shí)(約150rpm搖動(dòng).(6離心,去上清,余下的混勻涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal.(737o C培養(yǎng)1624小時(shí),挑白斑.*所用的培養(yǎng)基:SOC培養(yǎng)基胰蛋白胨2g酵母抽提物0.5g1M NaCl 1ml1M KCl 0.25ml2M Mg2+儲(chǔ)液1ml2M 葡萄糖1ml* Mg2+儲(chǔ)液MgCl.6H2 O 20.33 gMgSO4.7 H2 O 24.65g加雙蒸水到100ml,過(guò)濾滅菌* 葡萄糖過(guò)濾滅菌Southern Blot轉(zhuǎn)膜1. DNA經(jīng)酶切后,用Agarose凝膠電泳分離,切去多余的膠塊并在右下角切去一角以便于識(shí)別方向,接著EB染色并拍照。(注

26、意:TAE需新配,凝膠濃度視片段大小而定,一般為0.8%1.0%,電壓150v/cm2. 拍照后的凝膠先用無(wú)菌的去離子水輕輕搖晃,洗2次,5min/次。3. 去嘌呤:在室溫下,把凝膠置于盛有0.25M HCl的大平皿中輕輕搖動(dòng),直到溴酚藍(lán)由藍(lán)變黃(如果雜交的目標(biāo)片段小于5kb,此步可省略,再用無(wú)菌水搖動(dòng)洗5min 。4. DNA變性:把凝膠放入盛有變性液的平皿中,輕輕搖動(dòng),洗2次,15min/次,再用無(wú)菌水洗5min。5. 中和:把凝膠放入盛有中和緩沖液的平皿中,輕輕搖動(dòng),洗2次,15min/次。6. 把凝膠放入盛有20x SSC的平皿中,平衡10min。7. 印跡:用一玻璃板橫放于盛有20x

27、 SSC的搪瓷盤上作為橋,把一張用20x SSC浸潤(rùn)的3MM 的Whatman濾紙鋪在玻璃板上,其兩端放入瓷盤的20x SSC液體中,用玻璃棒趕盡氣泡。把凝膠(點(diǎn)樣孔面朝下放在濾紙上,避免氣泡產(chǎn)生,凝膠周圍用膠板封住。剪一張比凝膠略大的帶正電的尼龍膜平鋪在凝膠上,避免氣泡產(chǎn)生,(使凝膠濕潤(rùn)再放膜。再在尼龍膜上放兩張與尼龍膜大小一致的3MM濾紙,然后放一疊吸水紙?jiān)跒V紙上,再在吸水紙上一平板,平板上放一500g的重物,印跡時(shí)間大于2h。8. 紫外交聯(lián):取下重物及吸水紙拿出尼龍膜放在一濾紙上,與膠接觸面朝上,放入紫外膠膜儀中膠聯(lián)。9. 用無(wú)菌水洗膜10min,如不立即雜交,自然烘干保存。預(yù)雜交及雜交

28、1. 裁剪一張比尼龍膜稍大的雜交袋,把尼龍膜放入袋中,用封口機(jī)先封住三邊,放入10ml 預(yù)雜交液,趕盡氣泡,封口。把雜交袋放入雜交筒中,預(yù)雜交時(shí)間大于4h,溫度65C 。2. 加探針:把探針先煮沸15min后立即放入冰中,至少10min ,然后把探針加入1ml預(yù)雜交液中,剪去雜交袋一角,除去絕大部分預(yù)雜交液,加入雜交液,除盡氣泡封口,放入雜交筒中65C 雜交620h。洗膜1. 用2 x SSC, 0.1%SDS室溫下輕輕搖動(dòng)洗2 次,5min/次2. 用0.5 x SSC, 0.1%SDS在68C條件下洗膜2 次,5min/次,輕輕搖動(dòng)(可在雜交筒中進(jìn)行Dig檢測(cè)1. 洗膜后,用washing

29、 buffer 搖動(dòng)潤(rùn)洗5min。2. 用100ml Blocking solution 溫育30min,輕輕搖動(dòng)。3. 用20ml Antibody solution 溫育30min,輕輕搖動(dòng)。4. 用washing buffer 輕輕搖動(dòng)洗2 次,每次15min。5. 在20ml Detection buffer 中平衡5min。6. 把膜轉(zhuǎn)到用鉑紙包裹的盛有新配置的Colorsubtrate solution的平皿中顯色。7. 用PH 8.0 TE終止反應(yīng)。第三章PCR及相關(guān)技術(shù)PCR不同公司不同的酶要求的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件會(huì)有不同,PCR反應(yīng)可參考該酶的產(chǎn)品說(shuō)明上的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

30、一般的反應(yīng)體系如:引物(50pmol/l 各1l 反應(yīng)終濃度: 各1pmol/l模板(約30ng/l 1l 約30ngBuffer(10, 含Mg2+ 5l 1dNTPs(10mM 1l 0.2M高溫聚合酶(5U/l 0.21l 1-5UddH2O總體積50lPCR反應(yīng)參考程序:時(shí)間Step 1 預(yù)變性95-963-8minStep2 變性9450secStep3 復(fù)性*50secStep4 延伸72*Step5 2、3、4步驟循環(huán)(25次左右;Step6 延伸7210 min4結(jié)束反應(yīng)(4度長(zhǎng)時(shí)間保溫對(duì)PCR儀有較大損傷,一般不超過(guò)1小時(shí)便及時(shí)取出,絕對(duì)不允許過(guò)夜保溫。注:引物應(yīng)該用專門的軟

31、件(如Primer Premier認(rèn)真設(shè)計(jì),注意兩條引物的Tm值大致相等,GC含量較均一,引物自身以及之間不形成強(qiáng)的二級(jí)結(jié)構(gòu),特別是引物的3 端,引物不和模板其他位置形成強(qiáng)的配對(duì)(主要看引物3端。MgCl2濃度依不同的模板和引物而定。MgCl2的濃度對(duì)PCR結(jié)果影響很大。鏈霉菌的PCR因模板的GC含量高,可加DMSO(能降低復(fù)性溫度其濃度可在010%之間變化。模板為環(huán)形質(zhì)粒時(shí)若一次沒有擴(kuò)增出來(lái),可以考慮先用酶將其切成線性再作。對(duì)高GC含量的模板,預(yù)變性的時(shí)間也可適當(dāng)延長(zhǎng),甚至先在沸水中煮5分種,然后迅速放入冰中。如果使用預(yù)變性溫度高或時(shí)間長(zhǎng),一般要使用“熱啟動(dòng)”,即在預(yù)變性后再加入酶,這樣一是

32、可以保護(hù)酶,二是可以避免低溫時(shí)酶的非特異性擴(kuò)增?，F(xiàn)在的PCR儀一般都有“熱蓋”裝置,可以代替原來(lái)使用的礦物油,避免PCR過(guò)程中水份蒸發(fā)到管蓋上。復(fù)性溫度依引物Tm值及引物與模板的匹配程度而定,提高復(fù)性溫度可提高擴(kuò)增的特異性,而當(dāng)無(wú)擴(kuò)增條帶時(shí),可適當(dāng)降低復(fù)性溫度。延伸時(shí)間可根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域的長(zhǎng)度確定,擴(kuò)增區(qū)域越長(zhǎng),延伸時(shí)間越長(zhǎng)。不同的聚合酶的延伸速度不一樣,具體看說(shuō)明書,一般高保真聚合酶平均每分鐘延伸600bp,普通Taq酶每分鐘延伸1kb。根據(jù)不同需要使用不同的聚合酶,尤其當(dāng)用于擴(kuò)增表達(dá)的基因序列時(shí),一定要使用高保真的酶,作普通的PCR驗(yàn)證時(shí)就可用普通Taq酶。以鏈霉菌或其他高GC含量的DNA作模

33、板時(shí),由于GC含量越高,模板和引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,延伸和配對(duì)越難,PCR反應(yīng)不好做,可以暫時(shí)(2003年7月-用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR,保真度不敢保證,但擴(kuò)增效果很好。酶的用量可參考說(shuō)明書,并不是越多越好。LA Taq酶的GC buffer往往能用于別的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest,使它們也能很容易地?cái)U(kuò)出高G+C的模板來(lái)。PCR重組(詳見PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南p429 重疊延伸技術(shù)注:1. 兩條模板的量無(wú)需太大,因盡量保證1:1。2. 保證引物之間不會(huì)有干擾3. 四條引物的PCR重組比三條引物的PCR橋重組容易操作。即分別設(shè)計(jì)引物對(duì)兩個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增,使擴(kuò)增后兩個(gè)

34、模板有35-40bp的重疊序列,分別回收兩個(gè)模板在只有兩條外引物的條件下進(jìn)行常規(guī)PCR.PCR定點(diǎn)誘變(DpnI法1. 引物設(shè)計(jì):每條引物都要攜帶有所需的突變位點(diǎn),引物一般長(zhǎng)2545bp,設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)需位于引物中部。2. PCR反應(yīng):使用高保真的pyrobest DNA聚合酶;循環(huán)次數(shù)少,一般為12個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系:10x pyrobest Buffer 5 uldNTP Mixture(10mM 1ul模板DNA(550ng 1ulprimer 1 (125ng 1ulprimer 2 (125ng 1ulpyrobest DNA polymerase(TaKaRa(5U/ul 0.25u

35、l加無(wú)菌蒸餾水至50ul3. PCR產(chǎn)物沉淀純化:加1/10 體積的醋酸鈉,1倍體積的異丙醇,混勻置冰上(或-20C 冰箱5min,離心棄上清,7075%乙醇洗鹽兩次,烘干后溶于無(wú)菌水中。(此步可省略,直接用DpnI酶切4. DpnI酶切:Buffer 2ulBSA(1000.2ulDNA x ulDpnI 0.5ul加無(wú)菌去離子水至20ul30C酶切14 h ;65C 水浴15min 終止反應(yīng)。5. 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 菌株,利用抗生素篩選突變子。6. 測(cè)序驗(yàn)證第四章基因片段轉(zhuǎn)移技術(shù)法制備感受態(tài)細(xì)胞及DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌CaCl21.挑取保存的感受態(tài)細(xì)胞在LA平板上劃單菌落。2.挑取

36、長(zhǎng)好的單菌落接入到裝有5ml LB的universal瓶中,搖床過(guò)夜培養(yǎng)。3.從universal中取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)接于裝有20ml LB(用SOC或SOB可提高感受態(tài)效率的250ml三角瓶中,培養(yǎng)2.53小時(shí)至OD600=0.64.將培養(yǎng)物倒入50ml已預(yù)冷的大離心管中,置于冰上待冷卻5.離心,4.5000rpm.3分鐘6.倒去上清液,先加少量0.1M CaCl2 ,打散沉淀,再加10ml,混勻,于冰上放置至少30分或過(guò)夜。7.離心,4.5000rpm.3分鐘8.棄上清,加1ml 0.1M CaCl2,在冰上輕輕打散沉淀,即可使用。以上步驟均需注意無(wú)菌和低溫操作。DNA轉(zhuǎn)化1.取100

37、l感受態(tài)細(xì)胞和5l的酶連產(chǎn)物或1-2ul質(zhì)粒混合2.冰上靜置30分鐘3.42熱激90秒,然后在冰上放置5min4.加0.75ml LB培養(yǎng)基,在37度搖床上培養(yǎng)45分鐘。然后3600轉(zhuǎn)離心2分鐘,去掉大部分上清。(此步不作為快轉(zhuǎn),作為慢轉(zhuǎn),慢轉(zhuǎn)可提高效率,有些抗生素如Kan篩選時(shí)用慢轉(zhuǎn)較好5.涂布于有抗生素的篩選平板,一般12小時(shí)可有轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。大腸桿菌質(zhì)粒的快速檢測(cè)1.從轉(zhuǎn)化子平板上挑取單菌落,在另一平板上劃小方塊,37擴(kuò)大培養(yǎng)12小時(shí)2.刮取適量(偏少的菌體懸浮于30l快檢液I溶液中振蕩均勻3.加入15l堿性SDS溶液(0.3mol/L NaOH, 2%SDS(天冷時(shí)先使該溶液預(yù)熱,立即振

38、蕩混合完全。4.在70放置15min(對(duì)大于20kb的質(zhì)粒則最好放在55, 30min水浴時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。5.冷卻至室溫,直接上樣跑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(如果菌體過(guò)多,則點(diǎn)樣時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)樣品很粘,所以掌握不好時(shí)可以在第4步之后加上一部5ul苯酚抽提,離心的步驟。*如果沒有用苯酚處理,看膠時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)很明顯的總DNA的條帶,但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。*點(diǎn)樣時(shí)注意點(diǎn)上質(zhì)粒載體質(zhì)粒對(duì)照,一般在快檢時(shí)會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒CCC構(gòu)型的條帶,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)OC構(gòu)型的。*快檢液I:0.3M蔗糖,25mM pH8.0 Tris-HCl,0.5mM EDTA,0.02%溴甲酚綠接合轉(zhuǎn)移(詳見英文手冊(cè)249頁(yè)1.帶有oriT的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

39、進(jìn)入大腸桿菌ET12567( pUZ8002,得到轉(zhuǎn)化子;2. 將轉(zhuǎn)化子的過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在LB中,在合適抗生素下,37 o C培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子,到合適濃度(OD600:0.4-0.6收集菌體;3. 用等體積新鮮的LB洗滌菌體兩次(洗掉抗生素, 0.1倍體積的LB懸浮.備用;4. 鏈霉菌孢子的熱激和預(yù)萌發(fā)(一般的接合轉(zhuǎn)移只須做熱激(1新鮮孢子懸浮于5ml 0.05M PH8.0 的TES;(250ºC水浴熱激10分鐘;(3冷卻到室溫后加入等體積2X孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基;(437ºC搖床分別培養(yǎng)2-3小時(shí);(5離心收集孢子并重新懸浮于適量的水或TES中;(6在振蕩器上打散孢子或只作熱激按

40、下面步驟:將適量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培養(yǎng)基,50度處理10分鐘,離心,去大部分上清。5. 按(1*e-8:(1*e-9與3中的大腸桿菌混勻(不一定6. 30ºC培養(yǎng)13-20小時(shí)左右用適當(dāng)濃度的抗生素和萘啶酮酸(抑制大腸桿菌覆蓋6. 30ºC培養(yǎng)數(shù)天(一般2天可得到接合轉(zhuǎn)移子.7. 挑選接合轉(zhuǎn)移子到含適當(dāng)抗生素和萘啶酮酸的平板上, 驗(yàn)證;(作篩選雙交換菌株時(shí)繼續(xù)作下面步驟8. 直接將得到的接合轉(zhuǎn)移子作影印,尋找單抗的菌株即為雙交換菌株。如果得不到,就要通過(guò)單交換菌株的松弛培養(yǎng)來(lái)得到雙交換菌株。得到的單交換接合轉(zhuǎn)移子劃線于合適的培養(yǎng)基(含萘啶酮酸,不含別的抗生素

41、松弛培養(yǎng);9. 得到的孢子或菌體稀釋涂皿或劃單菌落(for Bld菌株, 影印篩選雙交換.注意事項(xiàng):1 不同的孢子熱激的溫度和時(shí)間不同,預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間不同.2 不同的鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移所用的培養(yǎng)基不同預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基Difco 酵母膏1%Difco 酪蛋白氨基酸1%CaCl2 0.1M(需配制5M的原液,分開滅菌后加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去鏈霉菌原生質(zhì)體的制備1. 在裝有不銹鋼彈簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1(一定要加Glycine,接種100ul的孢子懸液,于30度搖床中培養(yǎng)3640 hr(視具體情況,有時(shí)培養(yǎng)24h已足夠。2. 將培養(yǎng)物倒入universal中,用無(wú)菌水

42、涮洗三角瓶,收集洗液于同一universal中,然后3000 rpm離心10 min。3. 棄上清,將菌絲體懸浮于15 ml的10.3%的蔗糖溶液中,3000 rpm離心10 min,棄上清。同此法洗兩次。4. 取1 ml菌絲體,加入4 ml的溶菌酶溶液(溶菌酶母液為50mg/ml P Buffer,終濃度為2 mg/ml,用P Buffer稀釋,于30度水浴3060 min(間隔七八分種輕輕搖動(dòng)至上清呈乳狀。5. 加入5 ml的P Buffer并用5 ml的吸管吹吸幾次,繼續(xù)溫浴10 min。(使大量的原生質(zhì)體釋放出來(lái)。6. 用裝有脫脂棉的試管過(guò)濾,濾液轉(zhuǎn)入無(wú)菌干凈的universal中,3

43、000 rpm離心7 min(不用brake檔防止其破裂。原生質(zhì)體沉淀呈黃色。7. 棄上清,輕柔打散原生質(zhì)體,用P Buffer洗兩次(洗去溶菌酶。每次仍使用3000 rpm 離心7 min。(此步可省略8. 棄上清,用槍將原生質(zhì)體打散,分裝,于-70度保存。注:1. P緩沖液(原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用(Okanishi, 1974蔗糖103g,K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液2ml,蒸餾水800ml滅菌后每80ml上述溶液中加入:0.5% KH2PO4 1ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 緩沖液(pH

44、7.2 10ml2.溶菌時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),否則會(huì)使原生質(zhì)體破裂。離心后若看到很粘的絮狀物,則說(shuō)明原生質(zhì)體破裂。鏈霉菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化1. 將最多5 ul的DNA(質(zhì)?；蛎高B產(chǎn)物加于已經(jīng)裝有50 ul原生質(zhì)體的指型管(1.5 ml的管壁上(不與原生質(zhì)體接觸。2. 吸取200ul的25% PEG4000(PEG應(yīng)先滅菌,再用P Buffer配置,將DNA沖入原生質(zhì)體中,小心抽吸幾次使之混勻。3. 將混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素。4. 30度培養(yǎng)1420 hr后(待原生質(zhì)體再生后,即平板呈霧狀,用含有適當(dāng)抗生素的1 ml 無(wú)菌水溶液覆蓋。5. 再培養(yǎng)12 d后,可以看到小的轉(zhuǎn)化子菌落長(zhǎng)出。PCR

45、-Targeting技術(shù)中E.coli電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化1. 將天藍(lán)色鏈霉菌庫(kù)斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BW25113/pIJ790*菌株中,此步可用常規(guī)的CaCl2法。(pIJ790帶有cat基因和對(duì)溫度敏感的復(fù)制區(qū),培養(yǎng)時(shí)溫度要嚴(yán)格控制在30C 以下2. 培養(yǎng)含庫(kù)斯質(zhì)粒的BW25113/pIJ790菌株:從平板上挑取大腸桿菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 (不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM 中,30C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。3. 取一部分過(guò)夜培養(yǎng)物至25ml新鮮的SOB-MgSO4 培養(yǎng)基(含25ug/ml Cml,10

46、0ug/ml Amp中,菌體終濃度為1% ,添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導(dǎo)/red重組系統(tǒng)。4. 30C ,200rpm搖床培養(yǎng)3-5h 至OD6000.6 。5. 將培養(yǎng)物倒入預(yù)冷的30ml離心管中,冰上置10min(從此細(xì)胞溫度要保持在04C。4000rpm 4C離心5min。6. 棄掉上清,加1ml預(yù)冷的10%甘油,在冰上打散沉淀,再加9ml 10%甘油,搖勻。7. 4000rpm 4C離心5min,棄掉上清,用10%甘油洗滌。重復(fù)上面操作:4000rpm 4C 離心5min,盡量棄去上清,用殘留液將細(xì)胞打散。(感受態(tài)細(xì)胞濃度越高電轉(zhuǎn)效果越好 8. 在預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中

47、混合50ul感受態(tài)細(xì)胞與1-2ul PCR產(chǎn)物(經(jīng)純化,可盡量濃,但不能加得過(guò)多,混勻后立即電擊,電擊條件:200,25uF,2.5kv, 電擊結(jié)果為4.54.9ms較理想。(電轉(zhuǎn)化杯在70%乙醇中保存,用前先在無(wú)菌環(huán)境下用無(wú)水乙醇洗一下,再吹干,放冰上預(yù)冷,無(wú)水乙醇能加快吹干的速度。也可以選擇0.1cm的電轉(zhuǎn)化杯,但電擊的參數(shù)就得變?yōu)?1.8 k V,?,?uF9. 立即加1ml預(yù)冷的SOC,37C誘導(dǎo)培養(yǎng)40min(如需在同一庫(kù)斯質(zhì)粒上中斷基因,則30C誘導(dǎo)培養(yǎng)。10. 涂LA(含100ug/ml Amp及與電轉(zhuǎn)片段攜帶的抗性標(biāo)記相應(yīng)的抗生素平板,37C過(guò)夜培養(yǎng)。(轉(zhuǎn)化子中含有兩種質(zhì)粒,分

48、別是重組前和重組后的質(zhì)粒,所以要抽質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化一次DH5 第五章RNA操作技術(shù)鏈霉菌總RNA的抽提1. 在MS平板上鋪上已滅菌的玻璃紙,接種適量的孢子懸液,涂布均勻,30度培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間,刮取菌絲體,在預(yù)冷的碾缽中加入液氮碾磨23次。收集粉末狀菌絲體小半勺于1.5 ml 的指型管中。加入250 ul的懸浮緩沖液混勻置于冰上。2*.收集液體培養(yǎng)物(洗過(guò)的, 加入溶菌酶溶液(溶菌酶的終濃度為2 mg/ml,用P Buffer 稀釋使終體積250 ul。于30度水浴15 min(原生質(zhì)體剛開始形成。3. 加入70 ul EDTA(0.25M , 混勻。4. 加入375 ul的裂解緩沖液充分混勻,溶液呈清

49、亮狀。5. 加入等體積的熱酚, 用手震蕩混勻, 于65度水浴5 min。(a.水飽和酚應(yīng)提前于65度加熱, 高溫下, 酚的溶解度加大。b. RNA在堿性環(huán)境中易分解。6. 13,000 rpm離心5 min, 取上清。(室溫下, 酚仍有少量與水混溶, 因而上清為乳白色。7. 再次加入等體積的熱酚, 震蕩混勻, 于65度水浴5 min. 13,000 rpm離心5 min, 取上清。8. 加入等體積酚/氯仿(1:1, 震蕩混勻, 13,000 rpm離心5 min, 取上清。9. 加入等體積的氯仿, 震蕩混勻, 13,000 rpm離心5 min, 取上清。(一定要充分震蕩, 以除盡殘余的酚,

50、否則, 酚會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不良影響。10.加入1/5體積的LiCl(10M, 兩倍體積的無(wú)水乙醇, 混勻, 于-20度放置2 hr。11.于4度, 13,000 rpm, 30 min, 有白色沉淀。12.用80%的冰乙醇洗兩次(在冰上進(jìn)行,以將鹽離子去除干凈。13.冷凍真空干燥。14.溶于適當(dāng)?shù)腄EPC處理過(guò)的水中,于-70度保藏。注:1. 所有的槍頭、指型管均需用DEPC(0.1%(Takara水處理。DEPC為油狀,不溶于水,應(yīng)充分?jǐn)嚢?使其均勻分散。2. 所有操作必須戴上手套,而且手套要經(jīng)常換。3. 水飽和酚:將重蒸酚適量裝于一密閉瓶中,加入酚的1/2體積的去離子水,混勻,于65溫浴,

51、使酚充分溶解于水。鏈霉菌的RT-PCR(promega RT kit反轉(zhuǎn)錄:1. 反應(yīng)體系(50 ul模板(去除了DNA的RNA* ul引物(可以只是下游引物(50 pmol/ul 1 uldNTP (10 mM 1 ulMgSO4 2 ul5* buffer 10 ulAMV 1 ulH2O 至50 ul2. 反應(yīng)程序:模板、引物和水混合后60(或65度保溫4 min(保證mRNA的強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)完全打開,取出置于冰上再加入其他成分(避免AMV高溫失活。4845 min95 2 min4 5 min產(chǎn)物于-20保藏。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。注:1. 引物設(shè)計(jì)見常規(guī)PCR擴(kuò)增。

52、但要保證引物之間不會(huì)有干擾。2. 模板中的DNA要去除干凈,做好陰性對(duì)照。(即以RNA為模板進(jìn)行相同的反應(yīng)。第六章蛋白質(zhì)基本操作技術(shù)SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)染色(1將干凈的膠板裝好,用瓊脂糖膠(至少1%濃度封邊。(2配分離膠,配方如下:(1.5mm厚的膠需要10ml10%分離膠(5ml:去離子水1.25ml,30%丙烯酰胺1.7ml,1M This-HCl(pH=8.81.95ml, 10% SDS 50ul,10%過(guò)硫酸胺100ul,TEMED 2ul。(倒膠前才加入TEMED催化劑(3用去離子水密封液面,左右輕輕搖擺使液面水平(聚丙烯酰胺的聚合不能接觸氧氣,所以用水封液面,水還能使聚丙

53、烯酰胺的上液面保持平整。(4室溫聚合或放溫箱中加速聚合,傾斜膠板吸出水,倒?jié)饪s膠(1.5mm厚的膠需要3ml。濃縮膠配方如下:濃縮膠1ml:去離子水0.68ml,1M This-HCl(pH=6.80.13ml,30%丙烯酰胺0.17ml,10% SDS 10ul,10%過(guò)硫酸胺10ul,TEMED 1ul。(倒膠前才加入TEMED催化劑(5插上梳子,等膠凝固后,拔掉梳子,如果膠孔里有很多氣泡,需要用濾紙剪成小條吸去氣泡。(6加入電泳緩沖液點(diǎn)樣電泳,蛋白在濃縮膠時(shí)可以用150V電壓,在分離膠時(shí)可以用250V電壓,注意觀察蛋白的濃縮效果,如果濃縮效果不好說(shuō)明電泳緩沖液或配膠時(shí)的緩沖液用的次數(shù)過(guò)多

54、,或已經(jīng)不能用了,電泳緩沖液可用4-5次。(7電泳完畢后用染色液染膠至少1小時(shí),脫色2至5小時(shí)(根據(jù)膠的厚度,其間換脫色液2-3次,可用水繼續(xù)脫色和短期保存膠,或制備干膠長(zhǎng)期保存。試劑:30%丙烯酰胺:29g丙烯酰胺,1g N,N-亞甲雙丙烯酰胺,溫去離子水定容到100ml(請(qǐng)先在棕色瓶子上做好記號(hào)定容,丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺都有毒,要帶手套和口罩操作,不要污染量桶Tris-Gly電泳緩沖液(5倍,1L:15.1g Tris,94g Glycine,pH8.3,50ml 10%SDS,去離子水定容。10%過(guò)硫酸胺:0.5g過(guò)硫酸胺,去離子水定容到5ml。4度保存。(此物容易失活,最好

55、每次少量配置。膠凝不了,凝的時(shí)間長(zhǎng)或凝得不充分多半是它的問題。過(guò)硫酸胺在聚合反應(yīng)過(guò)程中提供自由基。脫色液(0.5L:50ml冰醋酸,225ml甲醇,225ml去離子水。(甲醇有毒(或50ml冰醋酸,235ml 95%乙醇,215ml去離子水。(防止揮發(fā),密閉保存。染色液:0.25%(染色效果不好就加大的考馬斯亮藍(lán)溶于脫色液中。大腸桿菌可溶性蛋白表達(dá)及抽提(用于由IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)體系:可溶性蛋白的表達(dá)沒有固定的方法,對(duì)不同的蛋白會(huì)有不同的方法,如果抽出的可溶性蛋白不多,可用基本培養(yǎng)基代替LB,用30或25度培養(yǎng)代替37度,IPTG(誘導(dǎo)物的量也可減少,誘導(dǎo)時(shí)間也可變化。下面的方法僅供參考:1.將菌接種于5ml LB(含抗生素培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),2.將過(guò)夜培養(yǎng)物全部接種到200ml含抗生素的MM培養(yǎng)基中,37度培養(yǎng)4-5小時(shí),加IPTG至終濃度0.5mM(可變,37度培養(yǎng)13小時(shí)。3.將細(xì)胞培養(yǎng)物用20mM的冰冷的Tris-HCl(pH=7.5濃縮10倍,4.在冰上用超聲波處理(power lever為4-5,duty設(shè)為40-50%,60-120次脈沖,每30次