鐘振東- 尼莫地平注射液對線栓法致大鼠局灶性腦缺血再灌注模型

1、尼莫地平注射液對線栓法致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型腦組織形態(tài)學(xué)的影響研究鐘振東【作者簡介】鐘振東（1974-），男，助理研究員，在職碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理學(xué)E-mail：511738602【通訊作者】王紅星（1953-），男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，E-mail：whx6633 許躍忠1鐘浩1楊玲1李韻2王紅星1·（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，成都610212;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，成都610041）【摘要】目的：研究尼莫地平注射液對線栓法致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型腦組織形態(tài)學(xué)及尼氏小體的影響。方

2、法：應(yīng)用經(jīng)典的線栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈(MCAO)，2h后適當(dāng)抽出線栓進(jìn)行再灌注。腦缺血后第0h、24h、47h時(shí)經(jīng)靜脈給予尼莫地平注射液(1.0mg/kg/d)，并觀察動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)、腦梗死比率（TTC染色法）、腦組織形態(tài)學(xué)和尼氏小體數(shù)量。結(jié)果：尼莫地平注射液能夠明顯改善MCAO模型大鼠腦缺血24h48h時(shí)的神經(jīng)功能缺失體征，可使模型動(dòng)物的腦梗死比率由18.32%降低至9.29%，能改善腦組織形態(tài)學(xué)病變和增加海馬區(qū)神經(jīng)元胞漿內(nèi)的尼氏小體數(shù)目。結(jié)論：尼莫地平注射液對腦缺血急性期嚴(yán)重的腦組織形態(tài)學(xué)病變有改善作用，對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，進(jìn)而對腦梗死后的神經(jīng)功能康復(fù)有促進(jìn)作用?！娟P(guān)鍵詞】尼莫地平注

3、射液；腦缺血再灌注損傷模型；腦組織形態(tài)學(xué)；尼氏小體The Effect of Nimotop Vial on Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury of MCAO Rat in Morphology AbstractObjective:to study the effects of nimotop vial on rat focal cerebric ischemia-reperfusion injury model in the sections of craniocerebral tissue morphology and Nissl's bod

4、y; Method: we employed classical cerebric ischemia-reperfusion injury model of MCAO, intravenous injected nimotop vial (1.0mg/kg/d) at the time points of 0h, 24h and 47h after being cerebral ischemia, and observed the changes of model animals in praxiology, cerebral infraction ratio(by TTC staining)

5、, craniocerebral tissue morphology and the number of Nissls body ; Results: nimotop vial can improve the nervous afunction symptoms of MCAO rats of being cerebral ischemia in 24h to 48h, can reduce the cerebral infraction ratio from 18.32% to 9.29%, can improve the craniocerebral tissue morphology a

6、nd can increase the number of Nissls body in the cytoplasma of hippocampus neuron; Conclusion: nimotop vial can improve the serious pathological changes of cerebral ischemia in acute stage, can protect nerve cells , and can improve the convalescence of nervous function after cerebral infraction.Keyw

7、ord: nimotop vial; cerebral ischemia-reperfusion injury model; craniocerebral tissue morphology; Nissl's body尼莫地平注射液在臨床上常用于預(yù)防和治療動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣引起的缺血性神經(jīng)損傷，但未見其對線栓法阻塞大腦中動(dòng)脈致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型（MCAO）中動(dòng)物腦組織和神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用的研究，故本文較深入地研究了尼莫地平注射液對線栓法致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型腦組織形態(tài)學(xué)及尼氏小體的影響，為尼莫地平注射液的作用機(jī)制研究提供參考。1、材料和方法1.1試

8、驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，120只，全雄，247±46g；由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供, 生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2004-16。1.2尼莫地平注射液（尼膜同，NimodipineInjection） 由德國拜耳醫(yī)藥保健股份公司(Bayer HealthCare AG)生產(chǎn)，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20050154。在本試驗(yàn)中確定尼莫地平注射液的臨床成人用量為12mg/60kg/d，故大鼠的等效劑量為1.0mg/kg/d。1.3試驗(yàn)試劑及工具藥 紅四氮唑（Red tetrazolium）：分子式為C19H15N4CL，上海靈錦精細(xì)化工有限公司，批號(hào)

9、：20080501。4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉溶液的配制：稱取多聚甲醛 160g、NaH2PO4·2H2O 67.52g、NaOH 15.44g，加入4000ml蒸餾水，水?。ú怀^60）溶解，不斷攪拌，仍有大量不溶解的固體；放置過夜，水?。ú怀^60）中滴加1M的NaOH溶液，至其中的可見物溶解為止，溶液仍不清晰，可取上層液使用。1.4試驗(yàn)器材 魚線（2.5號(hào)，直徑0.26mm，基本要求為：直徑合格、有一定的硬度和曲度、韌性適度；由東洋南馬銀燕魚鰾廠生產(chǎn)）。線栓的制備：取2.5號(hào)、直徑0.26mm的優(yōu)質(zhì)淺綠色尼龍魚線，剪取約7cm線段，將一端插入熔化石蠟中并迅速提起，垂吊晾

10、干，讓石蠟自然下滴均勻覆蓋前端線身。成品線栓顯微鏡下線頭呈水滴狀，線身直徑達(dá)0.28mm。自此端始20mm處用白色修正液作一標(biāo)記備用。1.5實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠分為假手術(shù)組、模型對照組和尼莫地平注射液對照組，每組40只動(dòng)物（因?yàn)樵搫?dòng)物模型的死亡率較高，故在實(shí)驗(yàn)之初設(shè)置較多動(dòng)物），每組再分為兩個(gè)亞組，即TTC染色用亞組和腦組織形態(tài)學(xué)研究用亞組。參考文獻(xiàn)1-3方法，腹腔注射水合氯醛將大鼠麻醉，仰臥位固定，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，頸正中線偏右切口，用止血鉗鈍性分離其下的淋巴組織及腺體。用眼科直鑷和彎鑷分離肌肉筋膜及右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），于近分叉處繞線；繼續(xù)分離頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），于分叉處結(jié)扎

11、ECA。再沿ICA往內(nèi)約4mm處小心分離翼腭動(dòng)脈，并齊分叉處結(jié)扎之；ICA近分叉處備線。然后在距CCA分叉處3mm用眼科剪剪一小口，在自制挑針的輔助下將拴線插入到ICA，用眼科鑷輕輕送入約10mm，再順勢插入到20mm左右，以有抵觸感為度，即實(shí)現(xiàn)對大腦中動(dòng)脈的阻斷(MCAO)。系牢ICA及CCA遠(yuǎn)心端的備線以固定線栓。滴加適量的慶大霉素稀釋溶液，逐層縫合切口并消毒。術(shù)中保持肛溫37±0.5，術(shù)后保溫至動(dòng)物清醒。MCA阻斷2h后，動(dòng)物開始有意識(shí)，適當(dāng)抽出線栓約10mm，剪去漏出于皮膚外的線栓，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組動(dòng)物，僅在CCA、ECA、ICA及翼腭動(dòng)脈處備線處理，待給予生理鹽水后去線

12、即可。給藥次數(shù)為三次，即腦缺血后第0h、24h、47h。具體方案為：用線栓阻斷MCA成功后及縫合前，經(jīng)右側(cè)頸總靜脈或其分支給予尼莫地平注射液溶液(0.2mg/ml)，假手術(shù)組和模型對照組給予等體積生理鹽水。再連續(xù)給藥兩天，均將動(dòng)物麻醉后經(jīng)舌下靜脈給藥。給藥體積均為5ml/kgd。1.6觀察指標(biāo)4（1）神經(jīng)行為學(xué)觀察 參考Longa 及Bederson 的5 分制法，在動(dòng)物麻醉清醒后第2h、24h、48h時(shí)進(jìn)行評(píng)分。分值越高，說明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。（2）腦梗死比率的測定 取“各組的腦TTC染色用亞組”的動(dòng)物，在腦缺血后48小時(shí)，處死動(dòng)物立即取全腦，進(jìn)行TTC染色，測定腦指數(shù)和腦梗死比率。（3）

13、腦組織形態(tài)學(xué) 取“各組的腦組織形態(tài)學(xué)研究用亞組”的動(dòng)物，在腦缺血后48小時(shí)，麻醉狀態(tài)下經(jīng)心臟灌流（4%多聚甲醛），取右腦做病理組織學(xué)研究，觀察右側(cè)大腦海馬區(qū)的形態(tài)變化。（4）特殊染色（尼氏小體） 上述腦組織形態(tài)學(xué)研究用組織再同時(shí)進(jìn)行石蠟切片，脫蠟，蒸餾水洗。1甲苯胺藍(lán)水溶液至5060溫箱染色2040min；蒸餾水稍洗；95乙醇迅速分化；無水乙醇脫水，二甲苯透明。中型樹膠封固，光鏡400倍下觀察一個(gè)視野下的神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體數(shù)目。1.7統(tǒng)計(jì)方法 平均值間的差異應(yīng)用SPSS 10.0 for windows軟件提供的單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行處理。2、結(jié)果2.1神經(jīng)行為學(xué) 結(jié)果詳見表1。MCAO

14、模型大鼠主要在腦缺血后2h前后出現(xiàn)不能完全伸展右側(cè)前爪及向左側(cè)轉(zhuǎn)圈等典型的腦缺血神經(jīng)功能缺失體征（P<0.05），在腦缺血48h時(shí)基本恢復(fù)正常（P<0.01）。尼莫地平注射液能夠明顯改善MCAO模型大鼠腦缺血24h48h時(shí)的神經(jīng)功能缺失體征（P<0.01）。表1 尼莫地平注射液對MCAO模型大鼠不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)神經(jīng)行為學(xué)的影響 ()組 別給藥劑量(mg/kg/d)動(dòng)物數(shù)（只）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（分）腦缺血2h腦缺血24h腦缺血48h假手術(shù)組350.00±0.00*0.00±0.000.00±0.00模型對照組312.37±0.911.27

15、77;0.590.36±0.15#尼莫地平注射液組1.0321.05±0.570.13±0.37#0.00±0.00#注：與模型對照組比較，*P<0.05，*P<0.01；與腦缺血2h比較，P<0.05，P<0.01。2.2腦梗死比率（TTC染色） 結(jié)果詳見表2。MCAO模型大鼠腦缺血48h時(shí)腦梗死明顯，腦梗死比率高達(dá)18.32%（P<0.01）；尼莫地平注射液經(jīng)靜脈連續(xù)給藥三次具有明顯的治療作用，可使腦梗死比率明顯降低至9.29%（P<0.05）。表2 尼莫地平注射液對MCAO模型大鼠腦梗死比率的影響 ()組 別給藥

16、劑量(mg/kg/d)動(dòng)物數(shù)（只）腦梗死比率腦指數(shù)假手術(shù)組190.0000±0.0000*0.0054±0.0010模型對照組130.1832±0.11520.0058±0.0005尼莫地平注射液組1.0150.0929±0.0624*0.0061±0.0011注：與模型對照組比較，* P<0.05，* P<0.01。2.3腦組織形態(tài)學(xué) 除模型對照組外，其余各組送檢腦組織結(jié)構(gòu)基本正常，大致可見細(xì)胞層次，主要病變?yōu)椴煌潭饶X實(shí)質(zhì)內(nèi)血管充血、出血，或血管周水腫，不同程度腦細(xì)胞水腫、或灶性溶解；腦膜及室管膜水腫、血管充血、出血。

17、部分腦內(nèi)灶性間質(zhì)細(xì)胞增生。模型對照組部分腦實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊，上述病變重。詳見圖13。應(yīng)用“病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)”和“病理評(píng)分方法”將上述描述性結(jié)果轉(zhuǎn)換為計(jì)量數(shù)據(jù)，以便進(jìn)行組間比較分析，結(jié)果如表3所示。MCAO造模成功，可引起較嚴(yán)重的腦組織形態(tài)學(xué)病變（P<0.01），而尼莫地平注射液經(jīng)靜脈連續(xù)給藥三次具有明顯的治療腦組織形態(tài)學(xué)病變的作用（P<0.01）。表3 燈盞細(xì)辛注射液對MCAO模型大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 ()組 別給藥劑量(mg/kg/d)動(dòng)物數(shù)（只）病理學(xué)評(píng)分（分）尼氏小體數(shù)（個(gè)）假手術(shù)組105.26±1.45*11.17±2.14*模型對照組1022.01±

18、;5.623.47±0.12尼莫地平注射液對照組1.01012.38±3.28*9.01±2.91*注：與模型對照組比較，* P<0.05，* P<0.01。附：病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)+：小灶性灰、白質(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)輕度水腫，小灶性細(xì)胞溶解；灶性少許細(xì)胞增生（增生細(xì)胞主要為膠質(zhì)細(xì)胞）；腦實(shí)質(zhì)內(nèi)輕度血管周水腫；輕度血管充血、出血；輕度腦膜或室管膜水腫、充血、出血。符合其中一項(xiàng)者，即判定為“+”。+：多灶性灰、白質(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)水腫，細(xì)胞溶解；腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管中度充血、出血；中度血管周水腫。腦膜或室管膜水腫、充血、出血較重。符合其中一項(xiàng)者，即判定為“+”。+：彌漫性灰、白質(zhì)細(xì)胞

19、或間質(zhì)水腫，大片細(xì)胞溶解；腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管重度充血、出血、血管周水腫。腦膜或室管膜水腫、充血、出血明顯加重。符合其中一項(xiàng)者，即判定為“+”。附：病理評(píng)分方法灰質(zhì)病變分為細(xì)胞水腫、溶解壞死、血管周水腫、充血、出血、間質(zhì)細(xì)胞增生六項(xiàng)，白質(zhì)病變分為細(xì)胞水腫和灶性溶解兩項(xiàng)，腦膜及室管膜病變分為水腫、充血和出血三項(xiàng)，觀察每個(gè)樣本上述各項(xiàng)病變情況，參照上述分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，“+”記1分，“+”記2分，“+”記3分，每個(gè)樣本各項(xiàng)指征累積計(jì)分，作為該樣本最終病理學(xué)評(píng)分。2.4尼氏小體 結(jié)果詳見表3和附圖46（照片中的黃色箭頭所指為尼氏小體）。腦缺血假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多深藍(lán)色顆粒狀的尼氏小體，著色均勻，

20、神經(jīng)元形態(tài)正常；與假手術(shù)組比較，模型對照組動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏小體少見或消失（P<0.01），著色淺淡不均勻，神經(jīng)元胞體輕度腫脹。與模型對照組比較，尼莫地平注射液組動(dòng)物海馬區(qū)神經(jīng)元胞漿有相對較多的尼氏小體分布（P<0.05），著色較均勻，染色較深。（見附圖）3、結(jié)論和討論MCAO模型大鼠主要在腦缺血后2h前后出現(xiàn)不能完全伸展右側(cè)前爪及向左側(cè)轉(zhuǎn)圈等典型的腦缺血神經(jīng)功能缺失體征，在腦缺血48h時(shí)基本恢復(fù)正常。尼莫地平注射液和燈盞細(xì)辛注射液中劑量能夠明顯改善MCAO模型大鼠腦缺血24h48h時(shí)的神經(jīng)功能缺失體征。腦組織形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明，MCAO造模能夠引起較嚴(yán)重的腦組織形態(tài)學(xué)病變，

21、主要為不同程度腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管充血、出血，或血管周水腫，不同程度腦細(xì)胞水腫、或灶性溶解；腦膜及室管膜水腫、血管充血、出血；部分腦內(nèi)灶性間質(zhì)細(xì)胞增生。尼莫地平注射液對MCAO大鼠腦組織形態(tài)學(xué)病變具有明顯的治療作用。尼氏小體(Nissls Body, Nissl granules)是指神經(jīng)細(xì)胞中特異性嗜堿性顆粒群，呈粒狀、微粒狀或虎斑狀，分散在神經(jīng)元除軸突和軸丘以外的胞漿中，又稱為虎斑樣物質(zhì)。尼氏小體是糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體中的核蛋白，其化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸及蛋白質(zhì)，其主要作用是合成蛋白質(zhì)。尼氏小體是神經(jīng)細(xì)胞功能活性的形態(tài)指標(biāo)，其功能與神經(jīng)元的功能具有非常密切的關(guān)系，故常作為判斷神經(jīng)細(xì)胞存貨的標(biāo)志，以及是否發(fā)生病理生理變化，觀察尼氏小體的變化基本能反映海馬神經(jīng)細(xì)胞的情況。尼氏小體是對缺血、缺氧等損害反應(yīng)非常敏感的細(xì)胞器，特別是當(dāng)軸突受到損害時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的尼氏小體趨向溶解或消失，以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元最明顯。腦缺血48h后大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏小體的數(shù)目明顯減少，而尼莫地平注射液治療能減輕腦梗死后尼氏小體減少，并且進(jìn)一步促進(jìn)尼氏小體的數(shù)量的增加，從而提高神經(jīng)軸突再生及神經(jīng)生長錐的延長，提示尼莫地平注射液對腦缺血急性期的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，對腦梗死后的神經(jīng)功能康復(fù)有促進(jìn)作用。綜上所述，普通腦組織形態(tài)學(xué)研究和特殊染色的尼氏小