質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告0001

1、題目：質(zhì)粒DNA的提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和方法；2. 學(xué)習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。二. 實(shí)驗(yàn)原理1. 質(zhì)粒(Plasmid):一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從l-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DA分子，并以 超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，常常編碼一些對(duì)宿 主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性，產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等。2. 載體(Vector):要把一個(gè)有用的外源基因通過(guò)基因工程手段，轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)，需要運(yùn) 載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體。LI前除了大腸桿菌中的質(zhì)粒、X

2、噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母人工染色體載體以及動(dòng)、植物病毒載體等。3. 分離質(zhì)粒DNA：(1) 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；(2) 收集和堿裂解細(xì)菌；(3) 分離和純化質(zhì)粒DA。4. 堿裂解法(1) 溶液 I： 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/EDTA-Na, 25mmol/LTris-HCl作用：分散細(xì)胞，螯合金屬離子使酶失活，防止DA的降解(2) 溶液II ： L NaOH, 2% SDS,臨用前1： 1配制作用：細(xì)胞在aOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與染色體DA發(fā)生變性(3) 溶液III : 5mol/L醋酸鉀60ml,冰酷酸，雙蒸水作用：酸性條件上質(zhì)粒DYA復(fù)性，留在上清

3、液。大腸桿菌DYA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等發(fā)生沉 淀。5. 電泳帶電荷的物質(zhì)，在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為電泳。DNA的瓊脂糖凝膠電泳可以分離長(zhǎng)度為 200bp至近50kb的DNA分子。DA的遷移率(U)的對(duì)數(shù)與凝膠濃度(T)之間存在反平行線 性關(guān)系。因此，要有效地分離不同大小的DA片段，選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度是非常重要 的。6. 提取質(zhì)粒在質(zhì)粒提取的過(guò)程中，由于操作原因，提取的質(zhì)?？赡苡腥N：線性DA、開(kāi)環(huán)DNA、 閉環(huán)超螺旋DA。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí)，同一質(zhì)粒DYA泳動(dòng)速度：閉環(huán)超螺旋線狀 開(kāi)環(huán)。但有時(shí)也有也會(huì)出現(xiàn)相反情況，因?yàn)榕c瓊脂糖濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及核酸染料 含量有關(guān)。三. 實(shí)

4、驗(yàn)材料及設(shè)備1. 實(shí)驗(yàn)材料：(1) 含質(zhì)粒PUC18大腸桿菌，塑料離心管，EP管架，微量取液器和 取液器吸頭，常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、試劑瓶等)；(2) 提取的pUC18,瓊脂糖，錐形瓶，一次性手套，膠鏟，封口膜, 剪刀，取液器吸頭。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：2. 實(shí)驗(yàn)儀器：(1) 恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)，10、100、1000 nL取液 器各一支，臺(tái)式高速離心機(jī)，制冰機(jī)，漩渦器；(2) 電泳儀，電泳槽，樣品槽模板(梳子)，有機(jī)玻璃內(nèi)槽，水平儀， 取液器，微波爐，凝膠成像系統(tǒng)。3. 實(shí)驗(yàn)試劑：(1)質(zhì)粒的提取培養(yǎng)液：胰蛋白月東(Tryptone) 10g,酵母提取物(Yeast extract

5、)5g, NaC15g,瓊脂(固體培養(yǎng)基)15g,用IN N&0H調(diào);b溶液I ,溶液II,溶液III；c.氨節(jié)青霉素(50mg/mL)；d抽提液(飽和酚:氯仿：異戊醇=25:24:1)作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性，有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。異戊醇防止抽提液起泡。e無(wú)水乙醇 作用：除去DNA水化層，使DNA沉淀。%乙醇作用：純化質(zhì)粒DNA。緩沖液或ddH20作用：溶解DNA（2） DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)a. Gold view （DNA 染料）XTAE緩沖液c上樣緩沖液（6X）四. 實(shí)驗(yàn)方法及步驟1. 質(zhì)粒DNA的提取a）將帶有質(zhì)粒PUC18的大腸桿菌接種在液體

6、培養(yǎng)基中（加氨節(jié)青霉 素50ng/mL）, 370C培養(yǎng)過(guò)夜；b）取培養(yǎng)菌液置Eppendorf小管中,10000rpmX2min,棄上清液；c）加入100 UL溶液I,漩渦器上充分混勻，在室溫下放置10 min；d）加入200 uL新配制的溶液II,輕輕翻轉(zhuǎn)23次，使之混勻，冰 上放置5 min；e）加入150 uL冰冷的溶液III,蓋緊后，溫和顛倒3-5次使混勻， 產(chǎn)生白色絮狀物，冰上放置15 min；f）lOOOOrpmX 5 min,取上清液于另一干凈的離心管中；g）向上清液中加入等體積（約400 UL）酚：氯仿/異戊醇（25： 24:1, v/v）,振蕩混勻，lOOOOtpni X

7、10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離 心管中；h）加入等體積（約370 pL）氯仿/異戊醇（24:1）,混勻,lOOOOrpm X 2min，取上清液于新離心管中；i）向上清液加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，-200C放置lh；j）12000rpm X 5 min,倒去上清液，吸干液體；k）加800 u L70%乙醇，離心12000rpm X 1 min,倒盡上清液，吸 水紙吸干液體，室溫自然干燥30min,直至變得透明無(wú)乙醇味；l）加20uL ddH20 ,混勻使DNA溶解完全，取5uL做電泳檢測(cè)， 剩余的溶液放置-200C保存?zhèn)溆谩?. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)a）瓊脂糖凝膠板的制備b）稱(chēng)取瓊脂

8、糖，置于錐形瓶中，加入30mLlXTAE緩沖液，微波爐加 熱直至瓊脂糖溶解；c）待膠液冷卻到650C （不燙手為宜），加入luL Gold view混勻, 攪拌器上攪拌排除氣泡，緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機(jī)玻璃槽（插入樣品槽模板梳子）內(nèi)，靜置30min左右，輕輕晃動(dòng)拔出 梳子；3. 加樣膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負(fù)極），注入1XTAE緩沖液 淹沒(méi)過(guò)膠板5mm,用取液器將提取的質(zhì)粒DNA5 u L與1 P L上樣緩 沖液（6X ）混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。4. 電泳將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的 藍(lán)色指示劑移動(dòng)到距離膠板邊沿約r2cm處，停止電泳。5. 觀察和拍照將

9、膠板小心取岀，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中DNA存在處顯示出熒光條帶。五. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果A 帶:15000bpB 帶 lOOOObpPEGFP-N3 pET-28acC 帶 7500bpD 帶 5000bpE 帶 3000bpF 帶 lOOObpG 帶 250bp圖1堿裂解法提取pEGFP-N3與pET-28A-c質(zhì)粒凝膠電泳紫外熒光檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明：從左到右依次為：pEGFP-N3、pET-28A-c. DLlSOOOMaker所提取的質(zhì)粒DNA可通過(guò)瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。一般情況下， 提取的質(zhì)粒為3條帶。在細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒DNA是共價(jià)閉合壞狀DNA,常 以超

10、螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處缺刻，分 子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫做開(kāi)壞DNA；若兩 條鏈在同一處或相近的部位斷裂，則變成線性DNA分子。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒的電泳速度因DNA的構(gòu)型不同而異，其速度 從大到小的次序?yàn)椋篶ccDNA線性ocDNA,共價(jià)閉環(huán)DNA的泳動(dòng)速度 最快，電泳速度最快的條帶顯色最深。但在優(yōu)化條件下，如在冰浴中 或使用試劑盒提取時(shí)，可以只出現(xiàn)一條帶或主要出現(xiàn)一條帶，即超螺 旋帶。由圖可知，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了明顯的三條帶，表明該樣品中同 時(shí)出現(xiàn)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA、開(kāi)環(huán)DNA和線性DNA分子。與Marker比 照，分子量基本符合對(duì)應(yīng)的分子量條帶

11、。實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。六. 結(jié)果討論與結(jié)論：1.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：通過(guò)堿裂解方法，我們將細(xì)菌的質(zhì)粒變性提出，又通過(guò)多個(gè)洗 滌、純化步驟，得到了提純的質(zhì)粒，在最后的本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了明 顯的三條帶，表明該樣品中同時(shí)出現(xiàn)共價(jià)閉合壞狀DNA、開(kāi)環(huán)DNA和 線性DNA分子。與Marker比照，分子量基本符合對(duì)應(yīng)的分子量條帶,實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。2.討論一：溶液II為什么現(xiàn)配現(xiàn)用而且需放置在常溫下答:溶液中NaOH放置過(guò)久會(huì)與空氣中C02反應(yīng)變質(zhì),導(dǎo)致溶液II pH下 降，無(wú)法達(dá)到很好的裂解效果；溶液中SDS成分在溫度較低環(huán)境 下由于溶解度下降導(dǎo)致析出，溶液失去效果。3.討論二：抽提液（飽和酚：氯仿:異戊醇）的作用。氯仿:異戊醇為什么加兩次作用：使樣品中雜質(zhì)蛋白變性析出，被抽提出樣品；第二次加入異 戊醇目的為洗凈上一步抽提中樣品殘留的飽和酚。4討論三：實(shí)驗(yàn)中無(wú)水乙醇與70%乙醇的作用。用無(wú)水乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法. 乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化 學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑.DNA溶液是DNA以 水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪DNA周?chē)乃肿? 使DNA失水而易于聚合；70%乙醇的作用不是沉淀DNA,而是