多聚體的表達(dá)

1、hCGCTP37 多聚體的表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備*中國(guó)生物工程雜志China Biotechnology, 2005, 25(11):2126喻光榮1,2蔣俶2馮文華1,2沈衛(wèi)英2蔣文玨2申慶祥2*(1 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院上海2000322 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所上海200032)摘要目的：研究重組hCGCTP37(CTP) 多聚體編碼基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物多克隆抗體的制備。方法：分別將3、4個(gè)CTP編碼基因通過(guò)串聯(lián)的方式連接起來(lái)組成多聚體編碼基因，進(jìn)而將多聚體基因亞克隆入載體pGEX 4T2中獲得含目的基因的表達(dá)質(zhì)粒pGEX 4T2（CTP）n(n=3,4)。表達(dá)

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，目的蛋白在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)親和層析柱純化、凝血酶酶解去除GST后，獲得多肽CTP3和CTP4。將其用于免疫家兔以制備多克隆抗體，并用ELISA法檢測(cè)抗體滴度。結(jié)果：菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生了大量可溶性的融合蛋白GSTCTPn(n=3,4)，SDSPAGE分析表明融合蛋白GSTCTP3和GSTCTP4的表觀分子量分別為38.0kDa和 42.2kDa，純化后的融合蛋白的純度達(dá)到了90以上；純化的融合蛋白經(jīng)牛凝血酶酶解，利用制備型SDSPAGE純化，回收獲得的多肽CTP3和CTP4的純度均大于80；將多肽CTP3和CTP4多次免疫

3、家兔后，ELISA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)產(chǎn)生了滴度較高的多克隆抗體。結(jié)論：CTP多聚體能刺激家兔產(chǎn)生特異性抗體，這提示CTP多聚體有可能作為避孕疫苗或腫瘤疫苗的免疫原。關(guān)鍵詞hCGCTP37大腸桿菌基因表達(dá)抗體收稿日期：20050610修回日期：20050805*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30472087），上海市科技攻關(guān)重大項(xiàng)目（03DZ19229）* 通訊作者，電子信箱：qxshen00人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG）是一種由胎盤(pán)滋養(yǎng)層合體細(xì)胞合成和分泌的糖蛋白激素，在妊娠早期起促進(jìn)胚泡發(fā)育、維持妊娠的作用1。早在20世紀(jì)70年代，hCG就被用

4、于避孕疫苗的研究2。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤組織也能特異性分泌hCG3，然而，一般情況下，非孕個(gè)體正常組織不分泌hCG。基于這點(diǎn)，抗hCG疫苗的研制也成為當(dāng)前抗腫瘤疫苗研究的熱點(diǎn)。HCG由和 2個(gè)亞基組成，其亞基與TSH（促甲狀腺激素）、FSH（促卵泡激素）、LH（黃體生成素）的亞基基本相同，亞基也與LH的亞基有部分同源性4，因此，以hCG為免疫原產(chǎn)生的抗體雖然與FSH、TSH等不發(fā)生反應(yīng)，但仍與LH有一定的交叉反應(yīng)。只有hCG羧基端109145殘基組成的37肽（簡(jiǎn)稱(chēng)hCGCTP37或CTP）是hCG分子所特有的，并存在hCG的特異表位，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體將具有更好的抗原特異性，不會(huì)與LH發(fā)生交叉

5、反應(yīng)5。國(guó)外學(xué)者曾利用化學(xué)合成的CTP與破傷風(fēng)類(lèi)毒素（TT）或白喉類(lèi)毒素(DT)偶聯(lián)組成的疫苗用于抗生育6和惡性腫瘤的治療7,8，取得了令人鼓舞的結(jié)果。但其不足之處是：成本較高、分子量小、抗原性較差4，產(chǎn)生的抗體中和hCG生物活性的能力低。因此，我們?cè)鴳?yīng)用基因重組的方法將3或4個(gè)CTP基因片段串聯(lián)起來(lái)，利用大腸桿菌XBlue表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)得到CTP多聚體，以期能解決上述不足9。但由于表達(dá)量太低，難以獲得足夠量的表達(dá)產(chǎn)物供實(shí)驗(yàn)用。本研究的目的是利用大腸桿菌BL21為表達(dá)菌株來(lái)適量表達(dá)CTP多聚體，并將表達(dá)得到的多肽CTP3和CTP4用于免疫家兔，制備相應(yīng)的多克隆抗體，從而初步了解多肽CTP3和C

6、TP4的免疫原性。1材料與方法1.1材料各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及其他修飾酶均購(gòu)自TaKaRa公司；BCIPNBT為Sigma公司產(chǎn)品；模板CTP cDNA片段，質(zhì)粒pPIC9K 、pBSMR，大腸桿菌DH5、BL21（DE3）均為本室保存；質(zhì)粒pMD18T購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒pGEX4T2、牛凝血酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）親和柱純化試劑盒為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。2005, 25(11)喻光榮 等：hCGCTP37多聚體的表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備中國(guó)生物工程雜志 China Biotechnology Vol.25 No.11 2005PC

7、R引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，引物F、R分別含有BglII和BamHI識(shí)別位點(diǎn)，其序列為：F：5GGAAGATCTACCTGTGACGACCCTCG3，R：5CGGGATCCTTGTGGCAGAATTGG3；新西蘭公兔購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。1.2CTP cDNA的PCR擴(kuò)增以CTP cDNA片段為模板，PCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性2min；94變性40s、55退火1min、72延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)；最后72延伸10min，冷卻至4。用酚氯仿抽提法純化、回收PCR產(chǎn)物，2瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定及定量分析。1.3pGEX4T2（CTP）n(n=3,4)的構(gòu)建純化后的PCR產(chǎn)物克

8、隆入質(zhì)粒pMD18T中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5，獲得含pMD18T（CTP）1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，小量制備該重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。鑒定符合要求的質(zhì)粒pMD18T（CTP）1以限制性內(nèi)切酶BglII、BamHI進(jìn)行酶切，回收、純化CTP酶切片段，并將其克隆入pBSMR的BglII位點(diǎn)，獲得含CTP單拷貝cDNA的質(zhì)粒pBSMR(CTP)1。利用相同的方法，在質(zhì)粒pBSMR(CTP)1的BglII位點(diǎn)插入CTP/BglII/BamHI片段，獲得pBSMR(CTP)2。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建pBSMR(CTP)3和pBSMR(CTP)4，對(duì)獲得的質(zhì)粒pBSMR(CTP)n(n=3,4)進(jìn)行測(cè)序

9、鑒定。將鑒定合格的質(zhì)粒pBSMR(CTP)n(n=3,4)用Not I和Bgl II雙酶切以將（CTP）3和（CTP）4片段切出，經(jīng)回收、純化、定量后，亞克隆入經(jīng)Not I和BglII雙酶切后的pGEX 4T2載體中，得到表達(dá)質(zhì)粒pGEX 4T2(CTP)n (n=3,4)，并對(duì)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。1.4融合蛋白的基因表達(dá)及純化將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，挑取陽(yáng)性克隆接種于2×YT培養(yǎng)液中，30，搖床培養(yǎng)至OD600約0.60.8時(shí)，以0.1mmol/L終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。參考文獻(xiàn)10的方法用溶菌酶裂解法收集表達(dá)產(chǎn)物，根據(jù)SDSPAGE電泳結(jié)果確定最佳表達(dá)條件。表達(dá)

10、產(chǎn)物用谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）親和層析柱進(jìn)行純化。1.5融合蛋白GSTCTPn (n=3,4)的酶解和CTPn (n=3,4)的純化將純化的GSTCTPn (n=3,4)濃度調(diào)整到9g/L，按2倍于說(shuō)明書(shū)使用量的酶量分2次加入反應(yīng)體系（第二次加酶時(shí)間為首次加酶后12h）， 22，共酶切36h。分別于2h、6h、12h、24h、36h取適量反應(yīng)產(chǎn)物作SDSPAGE分析，以GST、GSTCTPn (n=3,4)融合蛋白作對(duì)照，確定最適反應(yīng)條件。再按最佳反應(yīng)條件擴(kuò)大酶解反應(yīng)體系。酶解后通過(guò)制備電泳來(lái)純化反應(yīng)產(chǎn)物CTPn (n=3,4)，GSTCTPn (n=3,4)酶解反應(yīng)混合物經(jīng)SDSPAGE后，

11、切下含CTPn (n=3,4)條帶的凝膠，浸泡回收膠內(nèi)的CTPn (n=3,4)。1.6多克隆抗體的制備按常規(guī)方法免疫家兔。將回收的免疫原CTPn (n=3,4)濃度調(diào)整為1mg/ml，各取2ml分別與等體積的弗氏佐劑進(jìn)行充分乳化（首次免疫使用完全弗氏佐劑，加強(qiáng)免疫改為不完全弗氏佐劑11）。乳化后于家兔頸背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，免疫劑量為500g免疫原/只。共免疫3次，每?jī)纱蚊庖唛g隔時(shí)間為2w。最后一次加強(qiáng)免疫后的第8d放血，取血清。1.7多克隆抗體的酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA）用純品hCG分別包被96孔板（每孔0.5g，溶于100l包被液），4過(guò)夜；次日，棄孔內(nèi)溶液并洗滌，以2的小牛血清封閉2h

12、；封閉后加入不同稀釋度的待測(cè)血清，以免疫前正常兔血清和兔抗CTP多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室以同樣方法制備得到的）為對(duì)照，37孵育1h；棄孔內(nèi)溶液并洗滌，再加入羊抗兔IgGHRP(11 000)，37孵育1h；孵育結(jié)束經(jīng)洗滌后，加入顯色劑，37 反應(yīng)10min，再以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)492nm的光吸收值。1.8Western blot分析以GST、hCG為對(duì)照，將純化的融合蛋白GSTCTP3、GSTCTP4、酶切反應(yīng)混合物及酶切后純化的CTP3、CTP4作SDSPAGE，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含45g/L脫脂奶粉的封閉液封閉2h，再以上文所述制備而成的抗血清（抗CTP3多克隆抗體

13、或抗CTP4多克隆抗體）為一抗（以1600稀釋?zhuān)┘把蚩雇肐gGAP(15 000)為二抗各孵育1.5h。用NBT、BCIP顯色。2結(jié)果2 .1CTP cDNA片段的PCR擴(kuò)增以合成的CTP cDNA為模板，用設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的序列應(yīng)為：5Bgl II酶切序列hCGCTP37BamHI酶切序列3，全長(zhǎng)為128bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果顯示一條預(yù)期大小條帶（圖1）。圖1CTP PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1Agarose gel electrophoresis of PCR product of CTPM： DGL2 000 DNA molec

14、ular weight marker；1： PCR product2.2重組質(zhì)粒 pBSMR(CTP)n(n=3,4)的酶切鑒定構(gòu)建后的質(zhì)粒pBSMR（CTP）3、pBSMR（CTP）4經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，篩選出具有氨芐青霉素抗性的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，抽提的質(zhì)粒經(jīng)Bgl II/BamH I雙酶切后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。電泳結(jié)果顯示每條泳道只有2條帶，即載體pBSMR和與預(yù)期大小(361bp、478bp)相符的CTP三聚體、四聚體cDNA片段（圖2）。圖2重組CTP三聚體、四聚體基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig. 2Agarose gel electrophoresis analysis of

15、 therecombinant genes of CTP triplet and quadrigeminumM: DGL2 000 DNA molecular weight marker；1: The plasmid pBSMR-（CTP）3 digested by Bgl II/BamHI;2: The plasmid pBSMR-（CTP）4 digested by Bgl II /BamHI2.3表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T2（CTP）n(n=3,4)的鑒定構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T2（CTP）n (n=3,4)經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。以空質(zhì)粒pGEX4T2為對(duì)照，將擴(kuò)增后的表達(dá)質(zhì)粒用

16、EcoRII單酶切進(jìn)行初步鑒定，并挑選含有插入片段的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明所克隆的基因序列與設(shè)計(jì)的基因序列完全相符，圖3為pGEX4T2（CTP）4的質(zhì)粒示意圖。圖3表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T2(CTP)4的示意圖Fig. 3Diagram of expression plasmid pGEX4T2(CTP)42.4融合蛋白的表達(dá)及純化表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T2（CTP）n (n=3,4)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。然后將含有表達(dá)質(zhì)粒的單克隆菌在2×YT培養(yǎng)液中（含50mg/L的氨芐青霉素）進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度37），培養(yǎng)至A600為0.60.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為0.2mmo

17、l/L）誘導(dǎo)表達(dá)4h。收集菌體，用溶菌酶裂解法收集表達(dá)產(chǎn)物。因預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)的目的蛋白存在于表達(dá)菌裂解產(chǎn)物的上清液中，故將上清液經(jīng)GST親和層析柱進(jìn)行純化，SDSPAGE分析表明得到了純度為90以上的融合蛋白（圖4）。融合蛋白GSTCTP3和GSTCTP4分別含有345和384個(gè)氨基酸，理論分子量分別為38.0kDa和42.2kDa。結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白GSTCTP3和GSTCTP4的表觀分子量與理論分子量相符。圖4融合蛋白GSTCTP3和GSTCTP4純化前后的SDSPAGE檢測(cè)Fig. 4SDSPAGE analysis of purified GSTCTP3,GSTCTP4 and

18、the supernatant of lysates of thebacteria BL21/CTP3 and BL21/ CTP41: Protein molecular weight marker;2: The purified GSTCTP3;3: The supernatant of the lysate of bacteria BL21/CTP3;4: The purified GSTCTP4;5: The supernatant of thelysate of bacteria BL21/CTP42.5表達(dá)產(chǎn)物的酶解及目的蛋白的純化經(jīng)過(guò)蛋白酶解預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將純化后的融合蛋白經(jīng)牛凝血

19、酶酶解36h后，酶切率可達(dá)到70以上。酶解后的反應(yīng)混合物經(jīng)制備型SDSPAGE后，切下含CTP3、CTP4條帶的膠。將膠充分碾碎后置于小燒杯中，加入10倍稀釋的生理鹽水浸泡4h，重復(fù)浸泡5次，合并所有浸泡液進(jìn)行冷凍干燥，得到純化的目的蛋白（圖5）。CTP3和CTP4分別含有121和160個(gè)氨基酸，理論分子量分別為13.3kDa和17.6kDa。圖5抗血清的Western blot檢測(cè)Fig. 5Western blot analysis of antiserum1: The purified GSTCTP3;2: The purified GSTCTP3 digestedby thrombin

20、;3: The purified CTP3;4: The purified GSTCTP4;5: The purified GSTCTP4 digested by thrombin;6: The purifiedCTP4;7: hCG (control);8: GST (control)2.6多克隆抗體的滴度檢測(cè)家兔經(jīng)免疫3次后的第8d放血，取血清。以hCG包被板，用ELISA方法檢測(cè)制備的多克隆抗體滴度。結(jié)果（表1）表明：抗CTP4抗體的滴度較抗CTP3抗體的滴度高、抗CTP4抗體和抗CTP3抗體的滴度均較抗CTP抗體的滴度高更多。這提示：隨著CTP重復(fù)單位增多，相應(yīng)抗體的滴度逐漸升高。表1

21、多克隆抗體滴度的ELISA檢測(cè)Table1ELISA for the titers of polyclonal antibodiesAntibodyAntigenAntiCTPAntiCTP3AntiCTP4hCG180 0001160 0001220 0002.7免疫印跡檢測(cè)用制備的抗血清為一抗作免疫印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抗CTP3多克隆抗體和抗CTP4多克隆抗體所得的結(jié)果相同。圖5為以抗CTP3多克隆抗體為一抗的Western blot檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)抗血清同hCG、酶切混合物中的GSTCTP3、GSTCTP4，CTP3、CTP4、純化回收后的CTP3和CTP4均有特異性的結(jié)合反應(yīng)，而與GST卻無(wú)結(jié)

22、合反應(yīng)。以上結(jié)果表明，產(chǎn)生的抗體確實(shí)是針對(duì)CTP3、CTP4的，且能專(zhuān)一性地與hCG結(jié)合。3討論本實(shí)驗(yàn)對(duì)CTP三聚體、四聚體cDNA的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21中的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的純化和相應(yīng)多克隆抗體的制備進(jìn)行了探討。針對(duì)CTP/DT中免疫原分子量小，免疫原性弱的不足，為提高疫苗的免疫原性，通過(guò)基因工程的方法將3或4個(gè)CTP編碼基因通過(guò)串聯(lián)的方式連接起來(lái)組成重組基因，然后在大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)。SDSPAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明已成功表達(dá)了CTP三聚體、CTP四聚體。而且ELISA對(duì)抗血清滴度的檢測(cè)結(jié)果表明：隨著CTP重復(fù)單位的增多，相應(yīng)的抗體滴度逐漸增強(qiáng)。這提示CTP

23、多聚體的免疫原性確實(shí)比CTP單聚體的免疫原性要強(qiáng)，達(dá)到了我們的研究目的。目的蛋白與GST以融合蛋白形式在大腸桿菌BL21中表達(dá)是目前使用很廣泛的表達(dá)系統(tǒng)之一，它不僅表達(dá)量高，而且具有純化方便的優(yōu)點(diǎn)12。已經(jīng)被許多科研單位和醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)用來(lái)表達(dá)各種重組蛋白、細(xì)胞因子、抗生素和酶。本文采用大腸桿菌BL21表達(dá)融合蛋白GSTCTP3、GSTCTP4，經(jīng)純化后分別得到了83mg、90mg目的蛋白，表達(dá)量達(dá)到100mg/L。表達(dá)的融合蛋白經(jīng)親和層析柱純化后，用牛凝血酶切除GST蛋白，用制備型SDSPAGE制備得到純化的多肽CTP3和CTP4。在本研究中，摸索凝血酶酶切最佳條件是難點(diǎn)之一。起初按照凝血酶說(shuō)

24、明書(shū)的酶切條件進(jìn)行酶切時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶切效率總是不高。后來(lái)，通過(guò)加大用酶量、延長(zhǎng)酶切時(shí)間、改變酶切溫度、調(diào)整反應(yīng)體系體積大小、向反應(yīng)體系中加肝素及分步加酶等方法來(lái)摸索最佳反應(yīng)條件。最終發(fā)現(xiàn)：2倍于說(shuō)明書(shū)使用量的酶量分2次加入反應(yīng)體系（第二次加酶時(shí)間為首次加酶后12h），22，共酶切36h，這樣酶切效率較高，達(dá)到70以上。出現(xiàn)這種酶切不完全的情況可能是由于位阻效應(yīng)的緣故13。用制備型SDSPAGE對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化回收是本次研究中的另一難點(diǎn)。在這一實(shí)驗(yàn)部分，要注意以下幾點(diǎn)：(1)SDSPAGE后要用0.25mol/L的KCl進(jìn)行膠染色，而不要用考馬斯亮藍(lán)染色，以防目的蛋白被固定在膠內(nèi)而不易浸出；(2)

25、切下的含目的蛋白的膠要充分碾碎，以便在用生理鹽水浸出蛋白時(shí)更快、更充分；(3)浸出蛋白時(shí)用的浸出液為10倍稀釋的生理鹽水，因?yàn)椴豢赡芤淮尉湍苋拷瞿z中所含的全部蛋白，而要經(jīng)56次甚至更多次數(shù)才行。所以，使用10倍稀釋的生理鹽水進(jìn)行浸出，可以防止在最后乳化時(shí)蛋白溶液的含鹽量太高而影響乳化。綜上所述，我們成功構(gòu)建了含CTP多聚體編碼基因的表達(dá)質(zhì)粒；表達(dá)、純化了CTP三聚體和四聚體；并制備了相應(yīng)的多克隆抗體。這為將CTP多聚體應(yīng)用于腫瘤疫苗或避孕疫苗免疫原的可行性研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。下一步，我們將在重組的CTP多聚體編碼基因后連接上C3d3編碼基因，并在畢赤酵母中表達(dá)融合蛋白，將表達(dá)出來(lái)的蛋

26、白純化后用作腫瘤疫苗或避孕疫苗的免疫原。這樣既有利于增強(qiáng)疫苗的免疫原性，又可以省去再將表達(dá)產(chǎn)物連接載體和使用免疫佐劑的麻煩14。參考文獻(xiàn)1 Shimojo M, Sakakibara R，Ishiguro M. Purification and characterization of high molecular weight HCG from human first trimester placenta. Biol Pharm Bull,1995,18:163716422 Nath I, Gupta P D, Bhuyan U N, et al. Autopsy report on rhes

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33、to S, Moriguchi S, et al. Proteases involved in longterm potentiation. Life Sci, 2002,72:35536114 Wang X L, Li D J, Yuan M M, et al. Enhancement of humoral immunity to the hCGbeta protein antigen by fusing a molecular adjuvant C3d3. J Reprod Immunol,2004,63:97110Expression, Purification, and Polyclo

34、nal Antibodies Production of hCGCTP37 PolymeridesYU Guangrong1,2JIANG Chu2FENG Wenhua1,2SHEN Weiying2JIANG Wenjue2SHEN Qingxiang2(1 Shanghai Medical College,Fudan UniversityShanghai200032,China)(2 Shanghai Institute of Planned Parenthood ResearchShanghai200032,China)AbstractObjective: To study the e

35、xpression of hCGCTP37 polymeride in the E. coli BL21(DE3) and the antibody production of the expressed products. Methods: Three or four CTP cDNA were strung to construct CTP polymeric cDNA, and two expression plasmids, pGEX4T2（CTP）n (n=3,4), were constructed by inserting CTP polymeric cDNA into plas

36、mid pGEX4T2 containing GST gene. After identified by DNA sequencing, the two expression plasmids were introduced into E. coli BL21 cells and the fused proteins were expressed in the expression strains induced with IPTG. Purified by GST Sepharose 4B Column, the expressed products were digested by thrombin protease to obtain the peptides of CTP3 and CTP4. Then, the rabbits were immunized with the p