人群瘢痕疙瘩家系易感基因定位

1、人群瘢痕疙瘩家系易感基因定位    作者：陳陽，高建華，劉曉軍，嚴(yán)欣，宋玫 【關(guān)鍵詞】  瘢痕疙瘩家系；連鎖分析；微衛(wèi)星標(biāo)記；易感基因；異質(zhì)性Study on location for keloid susceptible locus in Chinese pedigrees【Abstract】 AIM: To locate keloid susceptible locus in Chinese pedigrees. METHODS: Peripheral venous blood samples from 51 members in 2 la

2、rge keloid pedigrees were collected for extracting genomic DNA. Six markers on chromosome 2q23 were selected as microsatellite markers according to recent foreign literatures on the similar study. Subsequently, these markers were amplified by PCR, and all PCR products were genotyped and the linkage

3、analyses were performed. RESULTS: Most of the twopoint LOD scores for these markers at =0 were less than -2, which excluded the linkage. CONCLUSION: The keloid susceptible locus in Chinese pedigrees were not on chromosome 2q23.【Keywords】 keloid pedigree; linkage analysis; microsatellite marker; susc

4、eptibility genes; heterogeneity【摘要】 目的： 定位中國人群瘢痕疙瘩家系的易感基因. 方法： 選擇2個(gè)中國人群瘢痕疙瘩大家系，從中選出51名成員，采集其外周靜脈血樣，提取基因組DNA；參照國外最近相似研究的文獻(xiàn)報(bào)道，采集其外周靜脈血樣，提取基因組DNA；參照國外最近相似研究的文獻(xiàn)報(bào)道，在染色體2q23上選取6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物片斷基因分型，再進(jìn)行連鎖分析. 結(jié)果： 在重組率=0時(shí)，這些微衛(wèi)星標(biāo)記的兩點(diǎn)LOD值絕大部分-2，排除連鎖關(guān)系存在. 結(jié)論： 中國人群瘢痕疙瘩家系的易感基因位點(diǎn)不在染色體2q23上.【關(guān)鍵詞】 瘢痕疙瘩家系；連鎖分析；微衛(wèi)星標(biāo)

5、記；易感基因；異質(zhì)性【中圖號(hào)】 R596.20引言瘢痕疙瘩(keloid)是人體皮膚損傷后的一種病理性瘢痕愈合，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚. 流行病學(xué)調(diào)查表明，瘢痕疙瘩大多散發(fā)發(fā)病，但具有一定的家族遺傳傾向，且存在顯著的種族差異性1-2. Cosman等3證明其家族性發(fā)病率約為3，深膚色人種好發(fā). 國內(nèi)外的研究一致認(rèn)為，瘢痕疙瘩的遺傳模式為常染色體顯性遺傳,伴外顯不完全，其臨床表型存在個(gè)體差異4-5. 最近，Marneros等6的研究首次發(fā)現(xiàn)了1個(gè)日本家系和1個(gè)非洲裔美國人家系瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)分別與染色體2q23和7p11連鎖的遺傳學(xué)證據(jù)，對(duì)進(jìn)一步尋找瘢痕疙瘩發(fā)病的相關(guān)基因具有指導(dǎo)意義.

6、 但是，有關(guān)中國人群瘢痕疙瘩易感基因的定位至今仍未見報(bào)道，由于中國漢族人種與日本人種同屬蒙古人種，而非洲裔美國人屬尼格羅人種，為此，我們收集了來自我國不同地區(qū)的1個(gè)5代發(fā)病和1個(gè)4代發(fā)病的中國漢族人群瘢痕疙瘩大家系，從中分別選取32位和19位具有較高遺傳病研究意義的成員作為研究對(duì)象，在上述研究發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，在染色體2q23及其周圍選擇已知的兩點(diǎn)LOD值1的6個(gè)微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記，通過連鎖分析以驗(yàn)證中國人群瘢痕疙瘩家系易感基因位點(diǎn)是否也在染色體2q23上.1對(duì)象和方法1.1對(duì)象1個(gè)5代發(fā)病的NM（內(nèi)蒙）家系和1個(gè)4代發(fā)病的LN（遼寧）家系（圖1，2）. 遵照赫爾辛基宣言的準(zhǔn)則采集血樣和病理組織標(biāo)

7、本. 指定2名對(duì)瘢痕疙瘩診斷和治療有相當(dāng)臨床經(jīng)驗(yàn)的整形外科醫(yī)師，根據(jù)瘢痕疙瘩診斷標(biāo)準(zhǔn)7（即瘢痕超過原有損傷范圍并向周圍正常皮膚侵犯，或瘢痕病程超過1年仍無自發(fā)消退征象，或術(shù)后瘢痕復(fù)發(fā)者）對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行全面的體格檢查、詳細(xì)的病史詢問和準(zhǔn)確的臨床診斷，并對(duì)部分患者的瘢痕疙瘩組織取活檢行組織病理學(xué)檢查以確診. 我們從NM和LN家系中分別選出32位和19位成員作為研究對(duì)象（即系譜圖中標(biāo)號(hào)者），采集他們的外周靜脈血樣.圖1瘢痕疙瘩家系系譜（略）圖2LN瘢痕疙瘩家系系譜（略）1.2方法抽取這51名家系成員的外周靜脈血各2 mL(EDTA抗凝)，經(jīng)SDS裂解，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀基因組DN

8、A后，用ddH2O溶解，放置-20保存以備后用. 根據(jù)參考文獻(xiàn)6在染色體2q23及其周圍共約33.4 Mbp區(qū)域內(nèi)選取已知的6個(gè)兩點(diǎn)LOD值1的微衛(wèi)星標(biāo)記D2S1328（LODZMAX=2.01）， D2S349 （LODZMAX=2.84）， D2S1399 （LODZMAX=2.86）， D2S356（LODZMAX=2.84）， D2S2275 （LODZMAX=2.29）和D2S1353 （LODZMAX=0.89），通過UCSC Genenome()和Ensembl（/Homo_sapiens/mar

9、kerview）遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫，查找出這些微衛(wèi)星標(biāo)記的上下游引物序列(    表1)，再合成相應(yīng)的引物. 根據(jù)上述各自的上、下游引物序列設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的PCR引物，PCR擴(kuò)增在PE9700型PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行. PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 50100 ng，上、下游引物各10 mol/L（1 L），GeneAmp dNTP 1 L，Takaka Ex Taq DNA聚合酶33.34 nkat，10×Ex Tag Buffer（Mg2+ Plus） 1 L，加雙蒸去離子水至總體積10 L. PCR反應(yīng)條件：95預(yù)變性5 min后,94變性30 s，

10、5557退火30 s，72延伸30 s，38次循環(huán)后,72延伸10 min. 熒光標(biāo)記引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司提供，PCR擴(kuò)增試劑由Applied Biosystems公司提供. 將HiDi Formamide 1 mL和GeneScan500 LIZ Size Standard 50 L混合后，取9.5 L同PCR產(chǎn)物（20倍稀釋后） 0.5 L混合，95變性5 min后迅速冰浴冷卻5 min，再在ABI PrismTM 310 Genetic Analyzer上用PE公司的POP4膠，15 kV，60下，電泳28 min. 電泳數(shù)據(jù)經(jīng)Genescan軟件（V3.11）, Genoty

11、per（V.3.7）處理后得到檢測(cè)片段大小和基因型. 以上儀器、試劑及軟件由美國Perkin Elmer公司提供. 基因分型數(shù)據(jù)經(jīng)家系和人工校對(duì)后，用連鎖分析軟件Linkage（V.5.11）的Mlink程序計(jì)算每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的兩點(diǎn)LOD（log of the odds，Lod）值，其中重組率=00.4；遺傳模式為常染色體顯性遺傳伴不完全顯性，外顯率90%，擬表型1，群體疾病基因型頻率1/1000 5-6；根據(jù)算出的兩點(diǎn)LOD值判斷連鎖關(guān)系. LOD值表示在不同重組率（）的條件下，兩位點(diǎn)連鎖的可能性與不連鎖的可能性之間概率比值的對(duì)數(shù). LOD值1支持連鎖，LOD值3肯定連鎖，LOD值-2否定連鎖

12、.表1微衛(wèi)星標(biāo)記名稱、位置、引物序列及產(chǎn)物大?。裕?結(jié)果連鎖分析結(jié)果表明，在重組率=0時(shí)，兩點(diǎn)LOD值除NM家系中D2S1399的為0.71和LN家系D2S349的為-0.12外，其余微衛(wèi)星標(biāo)記的均-2（表2，3）.3討論我們所選擇的瘢痕疙瘩家系中共有3個(gè)肯定攜帶者，可以解釋為外顯不完全，也可以認(rèn)為是不規(guī)則顯性遺傳，即雜合子的顯性由于某種原因而不表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀，但他們卻可以生出具有該性狀的后代，因此在系譜中可以出現(xiàn)隔代遺傳現(xiàn)象，目前認(rèn)為機(jī)體的內(nèi)外環(huán)境對(duì)基因表達(dá)所產(chǎn)生的影響和不同個(gè)體所具有的不同遺傳背景可能是引起不規(guī)則顯性的重要因素8；而LN家系性狀遺傳表現(xiàn)為完全外顯，遵循典型的常染色體顯性

13、遺傳規(guī)律. 家系中出現(xiàn)雙親未發(fā)病而子女發(fā)病的現(xiàn)象，提示相關(guān)基因可能出現(xiàn)了新的變異. 經(jīng)文獻(xiàn)檢索，本研究所選擇的這2個(gè)家系是至今所報(bào)道的中國人群瘢痕疙瘩家系中最大和最多的，其中NM家系5代63人，健在成員4代56人，發(fā)病5代14人，健在患者3代11人；LN家系4代49人，健在成員4代48人，發(fā)病4代10人，健在患者3代9人. 它們都能較好地滿足遺傳病研究對(duì)家系的要求，對(duì)中國人群瘢痕疙瘩致病基因等相關(guān)研究具有較好的代表性. Marneros等6發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩日本家系與染色體2q23連鎖，并認(rèn)為位于染色體2q23的153cM(152 Mbp)處的壞死因子抑制蛋白6（TNFAIP6）基因是瘢痕疙瘩的一

14、個(gè)候選基因，但是對(duì)這個(gè)候選基因的外顯子、內(nèi)含子與外顯子的拼接點(diǎn)及啟動(dòng)子序列進(jìn)行測(cè)序，并未發(fā)現(xiàn)突變存在. 因此，認(rèn)為在該候選基因位點(diǎn)附近可能存在其它基因突變，才導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成. 另外，他們還報(bào)道了對(duì)一個(gè)有10人發(fā)病的非洲裔美國人中等大小的瘢痕疙瘩家系進(jìn)行同樣的研究，卻沒發(fā)現(xiàn)與2q23和7p11存在連鎖關(guān)系，說明瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)存在異質(zhì)性. Marneros等6的研究首次發(fā)現(xiàn)了存在瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)的遺傳學(xué)證據(jù)，對(duì)進(jìn)一步尋找瘢痕疙瘩的致病基因具有重要的指導(dǎo)意義.由于瘢痕疙瘩的發(fā)病存在顯著的種族差異性，為了驗(yàn)證中國人群瘢痕疙瘩家系易感基因位點(diǎn)是否也分布在上述染色體區(qū)域，為此，我們選取了這2

15、個(gè)中國人群瘢痕疙瘩大家系，以同樣的方法進(jìn)行研究，其連鎖分析結(jié)果顯示可以排除該瘢痕疙瘩家系與2q23的連鎖關(guān)系，再次證明了瘢痕疙瘩易感基因位點(diǎn)存在異質(zhì)性，提示瘢痕疙瘩易感基因可能存在種族特異性，即不同種族瘢痕疙瘩的形成可能由不同的致病基因調(diào)控，這與流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩好發(fā)于有色人種尤其多發(fā)于深膚色人種的現(xiàn)象相一致. 最近，張剛等9采用比較基因組雜交方法檢測(cè)了6例瘢痕疙瘩患者的染色體后發(fā)現(xiàn)染色體1p,16p,20q和22p存在部分缺失，推測(cè)這種缺失導(dǎo)致抑制性基因的丟失，造成瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展，從而認(rèn)為瘢痕疙瘩的發(fā)病可能與染色體的結(jié)構(gòu)畸變有關(guān). 由此可見，瘢痕疙瘩是一種復(fù)雜的遺傳性疾病，要準(zhǔn)確

16、定位和明確瘢痕疙瘩的致病基因，需要收集數(shù)量更多質(zhì)量更高種族來源更廣的家系，并應(yīng)用更先進(jìn)的研究方法，如全基因組掃描、選擇多態(tài)性更高的SNP作為遺傳標(biāo)記和對(duì)候選基因進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)基因突變等.表2NM家系微衛(wèi)星標(biāo)記不同值的LOD值（略）表3LN家系微衛(wèi)星標(biāo)記不同值的LOD值（略）【參考文獻(xiàn)】1 Alhady SM, Sivanantharajah K. Keloids in various races: A review of 175 cases J. Plast Reconstr Surg, 1969，44(7):564-570.2 Dustan HP. Does keloid pathogenes

17、is hold the key to understanding black/white difference    s in hypertension severity ?J. Hypertension, 1995，26(6):858-862.3 Cosman B, Crikelair GF, Ju DM, et al. The surgical treatment of keloidsJ. Plast Reconst Surg, 1961，27(6):335-338.4 Marneros AG, Norris JE, Olsen BR, et al. Clinical genetics of familial keloidsJ. Arch Dermatol, 2001，137(11):1429-1434.5 陳陽, 高建華，劉曉軍, 等. 瘢痕疙瘩中國家系的發(fā)病特點(diǎn)J. 中國美容醫(yī)學(xué), 2006，15(1):6-10.6 Marneros AG, Norris JEC, Watanabe S, et al. Genome scans provide evidence for keloid suscepti