法醫(yī)物證學(xué)各章知識整理

1、第二章 法醫(yī)物證分析的遺傳學(xué)基礎(chǔ)法醫(yī)物證學(xué)：是以法醫(yī)物證為研究對象，以提供科學(xué)證據(jù)為目的，研究應(yīng)用生命科學(xué)技術(shù)解決案件中與人體有關(guān)的生物檢材鑒定的一門學(xué)科。法醫(yī)物證的特點(diǎn)：法醫(yī)物證的穩(wěn)定性受環(huán)境條件的影響；法醫(yī)物證屬于“科學(xué)證據(jù)”。法醫(yī)物證學(xué)生物檢材遺傳標(biāo)記個(gè)人識別遺傳（heredity）：生物繁衍過程中，子代與親代相似的現(xiàn)象。變異（variation）：生物繁衍過程中，子代與親代有所不同的現(xiàn)象。遺傳標(biāo)記（genetic marker，GM）：個(gè)體的單位遺傳性狀作為標(biāo)志用于法醫(yī)物證分析時(shí)，這種遺傳性狀就稱為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記顯然具有以下特點(diǎn)： 特定性-遺傳多態(tài)性 穩(wěn)定性-終身不變、對環(huán)境的耐受

2、性 反映性 -可檢測性遺傳性狀：生物體表現(xiàn)出來的形態(tài)特征和生理生化特性稱為性狀。如果性狀的產(chǎn)生是由遺傳因素決定的，稱為遺傳性狀。單位遺傳性狀是指可檢測的、由遺傳決定的、并能夠以一定的規(guī)律從親代傳給下一代的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及分子生物學(xué)特征?；颍耗軌虮磉_(dá)特定功能的產(chǎn)物，并決定生物特定性狀的一段DNA序列?；蜃╨ocus)：基因在染色體上的一個(gè)特定位置等位基因: 同一個(gè)基因座上的基因可以有不同類型，它們之間存在一級結(jié)構(gòu)的差異，這種有差異的基因稱為等位基因復(fù)等位基因：對群體而言，一個(gè)基因座上具有3個(gè)或3個(gè) 以上的等位基因，稱為復(fù)等位基因，如ABO血型、TH01基因型：個(gè)體一個(gè)或多個(gè)基因座的等位基因

3、的組合，是生物體可見性狀的實(shí)際基因組成。基因座上的等位基因都是成對存在的。 純合子：成對的等位基因相同。雜合子：成對的等位基因不同。表型：是指生物體某特定基因所表現(xiàn)出的性狀。法醫(yī)學(xué)含義：1、表型是基因型決定的 2、表型是個(gè)體基因型檢測的結(jié)果。 3、型檢測的結(jié)果可以對未知基因型進(jìn)行推斷。 4、DNA水平的檢測結(jié)果也是表型。 5、表型可能和真實(shí)的基因組成之間存在偏差孟德爾分離律：指在生殖細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成配子時(shí)，成對的等位基因彼此分離，并獨(dú)立地分配到不同配子中自由組合律：在配子形成時(shí)，不同基因座上的非等位基因隨機(jī)地自由組合，形成子代基因型先決條件：各基因座間沒有遺傳連鎖關(guān)系。要求：選擇符合自由組

4、合律的遺傳標(biāo)記 位于不同染色體上 在同一染色體上相距較遠(yuǎn)的位置 通過群體調(diào)查證實(shí)沒有遺傳連鎖關(guān)系（基因座獨(dú)立性檢驗(yàn)）母 系 遺 傳(線粒體DNA)：(1) 遺傳物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)中，不受核移植的影響 (2) 無有絲分裂和減數(shù)分裂的周期變化 (3) 子代只表達(dá)母方的特征 應(yīng)用：母系進(jìn)化研究，缺乏父親的親子鑒定，其他男性伴性遺傳(Y染色體DNA)：（1）Y染色體非重組部分的DNA序列 （2）連鎖遺傳（以單倍體形式遺傳） （3）只遺傳給男性子代 應(yīng)用：父系進(jìn)化研究，缺乏母親的親子鑒定，性犯罪連鎖(linkage) ： 每個(gè)染色體上必然集合著許多基因，基因的這種集合叫連鎖。完全連鎖(complete li

5、nkage) ： 同一條染色體上的兩個(gè)非等位基因，在遺傳過程中完全不分離的遺傳現(xiàn)象群體： 包含同一物種所有的個(gè)體。 Hardy-Weinberg群體： 在一定地域內(nèi)一群隨機(jī)婚配，能實(shí)現(xiàn)基因世代傳遞并保持穩(wěn)定的許多個(gè)體的集群。gene Pool(基因庫)： 一個(gè)群體內(nèi)所包含的全部基因的總和遺傳多態(tài)性(genetic polymorphism) ： 對一個(gè)群體而言，控制遺傳標(biāo)記的基因座上存在有2個(gè)或2個(gè)以上等位基因，并且等位基因的頻率大于0.01?；蝾l率：群體中某等位基因數(shù)目占該基因座上所有等位基因總數(shù)的百分比?；蛐皖l率：群體中某基因座上的基因型在全部基因型中所占百分比表型頻率：就某一性狀而言

6、，某一表型在群體中所占百分比Hardy-Weinberg平衡定律：群體無限大； 隨機(jī)婚配； 沒有突變；沒有大規(guī)模的遷移和沒有選擇因素的影響。 結(jié)論是群體中的基因頻率和基因型頻率在逐代傳遞中保持不變。Hardy-Weinberg平衡定律的意義：1.反映基因頻率和基因型頻率的關(guān)系 2.群體樣本的檢驗(yàn)。連鎖平衡（linkage equilibrium，LE）：位于不同染色體的基因座，或者位于同一染色體相距較遠(yuǎn)的基因座之間常常是按照隨機(jī)原則進(jìn)行組合的，呈不連鎖遺傳。這種基因座之間沒有相關(guān)性的狀態(tài)稱為連鎖平衡連鎖不平衡：在遺傳過程中，如果不同基因座上的等位基因沒有按照孟德爾自由組合定律的隨機(jī)原則組合時(shí)，

7、這些基因座的遺傳則處于一種連鎖不平衡狀態(tài)。雜合度(heterozygosity) ：群體中某遺傳標(biāo)記所有基因型中雜合子所占的比例。個(gè)人識別率(probability of discrimination power, DP) ：在群體中隨機(jī)抽取兩個(gè)體，兩者的遺傳標(biāo)記表型不相同的概率。非父排除概率(excluding probability of paternity, PE) ： 指孩子的非親生父親的男子，能夠被某個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)排除的概率。第3章 DNA多態(tài)性的分子基礎(chǔ)DNA的分子結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)是指DNA分子中核苷酸的排列順序（3,5-磷酸二酯鍵，方向：5端3端）；二級結(jié)構(gòu)是指兩條DNA單鏈形成的

8、雙股螺旋結(jié)構(gòu)；三級結(jié)構(gòu)則是指雙鏈DNA進(jìn)一步扭曲盤旋形成的超級螺旋結(jié)構(gòu)。寡核苷酸：是二至幾十個(gè)核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線性核苷酸片段。寡核苷酸可由儀器自動(dòng)合成，可作為DNA合成的引物（primer）、基因探針（probe）等，在分子生物學(xué)研究中具有廣泛用途。探針probe：標(biāo)記有示蹤物的寡核苷酸片段。通過與靶DNA特異性結(jié)合（雜交），檢測靶DNA分子。引物primer：與模板DNA結(jié)合，引發(fā)DNA的合成反應(yīng)中合成鏈的延伸反應(yīng)。DNA分子的理化性質(zhì)：（一）核酸的高分子性質(zhì) ：粘性 酸堿性 紫外吸收 （二）DNA的變性和復(fù)性：變性 復(fù)性 降解 雜交DNA變性denaturation:在一定

9、條件下，堿基間氫鍵被打開，互補(bǔ) DNA雙鏈變?yōu)閮蓷l單鏈的過程(變性因素：加熱、溶液堿性、有機(jī)溶劑)增色效應(yīng):在熱變性的過程中，隨變性溫度升高，DNA的紫外吸收增強(qiáng)，A260值升高融鏈溫度（melting temperature，Tm）:融鏈曲線的中點(diǎn)所示溫度。是一半DNA發(fā)生變性時(shí)的溫度。Tm的高低反映了DNA分子的熱穩(wěn)定性程度的高低（C+G含量越高Tm越高，高離子強(qiáng)度可以增加溶液中DNA分子的穩(wěn)定性）。降解：DNA分子的共價(jià)鍵斷裂，形成多個(gè)分子量更小的片段的過程（法醫(yī)學(xué)意義：高度降解的DNA片段，有可能使待測遺傳標(biāo)記發(fā)生破壞，而失去檢測的價(jià)值）。DNA復(fù)性：變性因素撤除后，原變性的兩條互補(bǔ)單

10、DNA鏈通過堿基配對重新結(jié)合為雙鏈DNA的過程退火：加熱后變性的DNA在溫度降低過程中的復(fù)性。復(fù)性的影響因素：1、復(fù)性溫度：高：不易形成氫鍵，不易發(fā)生錯(cuò)配，特異性高。低：氫鍵容易形成，易發(fā)生錯(cuò)配，特異性差。參考溫度：Tm值下25 2、離子強(qiáng)度：離子可以中和單鏈DNA分子中所帶的負(fù)電荷，促進(jìn)單鏈DNA分子之間的聚合高：錯(cuò)配率高、特異性差 低：錯(cuò)配率低、特異性高3、DNA分子大小 DNA分子序列復(fù)雜程度 DNA分子濃度雜交：在復(fù)性條件下，來源不同、但具有同源性的DNA單鏈按堿基配對原則形成雙鏈DNA分子的過程。雜交條件的選擇： 雜交條件 溫度 離子強(qiáng)度 雜交效果 高強(qiáng)度 高 低 錯(cuò)配率低，特異性高

11、 低強(qiáng)度 低 高 錯(cuò)配率高，特異性差基因組（genome）：細(xì)胞中所有DNA的總稱。突變：遺傳物質(zhì)發(fā)生可遺傳的變異。端粒（telomere）：線性形式基因組DNA的末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)，是一段DNA和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，叫做端粒?；蛲蛔兊姆诸悾荷矬w的基因組DNA并不穩(wěn)定，經(jīng)常會出現(xiàn)各種各樣的可遺傳的改變，在子代留下變異的遺傳信息。在DNA分子水平，DNA損傷的后果之一就是突變（mutation）。主要分為編碼區(qū)堿基突變和非編碼區(qū)突變兩種。編碼區(qū)堿基突變：堿基替代在基因組中是最常見的突變形式，分轉(zhuǎn)換（transition）和顛換（transversion）兩種。非編碼區(qū)突變：非編碼區(qū)DN

12、A沒有表達(dá)產(chǎn)物，DNA復(fù)制中也能夠出現(xiàn)堿基的錯(cuò)配、插入和缺失，但是對細(xì)胞正常生理過程不構(gòu)成實(shí)質(zhì)性影響。無論在編碼區(qū)或非編碼區(qū)，突變的后果從沒有效應(yīng)到有害效應(yīng)和有利效應(yīng)，各種情況都會出現(xiàn)。堿基替換：堿基轉(zhuǎn)換、堿基顛倒堿基序列改變 基因突變堿基排列改變：倒位、易位堿基數(shù)目改變：插入、缺失、重復(fù)同義突變（same sense mutation）：是指DNA組成變了，但密碼子沒有改變，或密碼子雖然不同，但編碼產(chǎn)生同一種氨基酸，這種突變又稱中性突變。錯(cuò)義突變（missence mutation）：是指DNA組成改變使編碼一種氨基酸的密碼子改變成編碼另一種氨基酸的密碼子。無義突變（nonsense mut

13、ation）：是指某一堿基的替換使氨基酸密碼子變?yōu)榻K止密碼，可過早地終止轉(zhuǎn)錄，形成無活性的肽鏈。移碼突變（frameshift mutation）：DNA鏈上插入或缺失一個(gè)或n個(gè)核苷酸，使下游密碼子閱讀框發(fā)生變化，導(dǎo)致在插入或缺失部位以后的編碼發(fā)生相應(yīng)改變。終止密碼突變：是DNA分子中的某一終止密碼突變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的合成至此仍繼續(xù)下去，直至下一個(gè)終止密碼為止，形成超長的異常多肽鏈。沉默突變（silent mutation）：僅改變表達(dá)產(chǎn)物的單個(gè)氨基酸，對蛋白質(zhì)的生理功能沒有影響的點(diǎn)突變，是形成蛋白質(zhì)多態(tài)性的主要原因。DNA多態(tài)性：基因組中，由不同堿基構(gòu)成的等位基因所形成的

14、多態(tài)性叫做DNA多態(tài)性DNA長度多態(tài)性：同一基因座上各等位基因之間的DNA片段長度差異構(gòu)成的多態(tài)性可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列 VNTR ： 通常把小衛(wèi)星DNA中的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列稱為VNTR短串聯(lián)重復(fù)序列 STR: 把微衛(wèi)星的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列稱為短串聯(lián)重復(fù)序列 STR。是目前在法醫(yī)物證學(xué)中應(yīng)用最廣泛的長度多態(tài)性遺傳標(biāo)記。它的重復(fù)單位短，僅1-6bp，其長度多態(tài)性來源于重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的個(gè)體差異。4bp重復(fù)的STR基因座最常用。篩選STR基因座的條件：等位基因長度在300bp以下； 重復(fù)單位為四核苷酸，不含有插入的非重復(fù)單位堿基； 等位基因數(shù)812個(gè)； 基因座雜合度0.8以上，個(gè)體識別能力

15、大于0.9； 基因頻率分別比較平均，沒有特別高的或特別低的頻率的等位基因； PCR擴(kuò)增溫度，突變率低。單核苷酸多態(tài)性（SNPs）：在人類基因組范圍內(nèi)，如果任何單堿基突變使特定核苷酸位置上出現(xiàn)兩種堿基其中最少的一種在群體中的頻率不少于1，就形成單核苷酸多態(tài)性。第四章 DNA長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）：RFLP分析是一種傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于突變分析、基因診斷、基因定位等各個(gè)方面。法醫(yī)物證鑒定應(yīng)用RFLP技術(shù)主要是對人類基因組中的VNTR基因座進(jìn)行分型，其技術(shù)核心是DNA分子雜交，決定RFLP分析圖譜個(gè)體特異性的因素是限制性核酸內(nèi)切酶的特異性和探針的特異性。檢測所

16、用的探針多是由人類基因組DNA中篩選出的小衛(wèi)星序列，選擇特異性不同的探針，在不同的雜交條件下，可以只檢出單個(gè)VNTR基因座，也可同時(shí)檢出多個(gè)VNTR基因座，前者稱為DNA紋印，后者稱之為DNA指紋，檢測所用的相應(yīng)探針分別被稱為單基因探針（single-locus probe）和多基因探針(multi-locus probe)?；炯夹g(shù)：DNA提取、純化和定量 限制性核酸內(nèi)切酶酶切 電泳分離 印跡轉(zhuǎn)移 探針選擇單基因座探針（DNA紋印），多基因座探（DNA指紋） 探針標(biāo)記 分子雜交 譜帶顯示限制性酶選擇要求：識別序列位于VNTR兩側(cè)，盡量靠近VNTR； 酶活性、特異性穩(wěn)定，反應(yīng)條件容易控制； 不

17、受基因組DNA是否甲基化的影響。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：類似半保留復(fù)制，在體外以基因組DNA為模板，以一對寡核苷酸為引物，dNTP為原料，在Taq DNA聚合酶的催化下，經(jīng)過變性、退火和引物延伸三步循環(huán)使目標(biāo)片段得到復(fù)制百萬倍。PCR反應(yīng)體系： 模板DNA，寡核苷酸引物，dNTP，反應(yīng)緩沖液，TaqDNA聚合酶。 循環(huán)參數(shù) ：溫度、時(shí)間PCR技術(shù)特點(diǎn)：靈敏度高 特異性高 適用于降解DNA檢材 種屬特異性好 操作簡單，時(shí)間短 儀器自動(dòng)完成 污染 樣本要求 影響因素多復(fù)合擴(kuò)增：經(jīng)過篩選的STR基因座，擴(kuò)增條件基本相同，可以在同一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增多個(gè)靶基因座，叫作復(fù)合擴(kuò)增。應(yīng)用于法醫(yī)的STR應(yīng)滿

18、足條件： PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度在300bp以下； 宜選擇四核苷酸STR基因組； 選多個(gè)STR基因座應(yīng)不在同一條染色體上； 每個(gè)STR基因座等位基因數(shù)8-10個(gè)左右； 基因頻率分布均勻，沒有高或低頻基因出現(xiàn)； 雜合度高，最好大于0.80； 低突變率<0.2%。不同DNA長度分析技術(shù)比較：不同DNA長度分析技術(shù)綜合評價(jià)：STR分型用于法醫(yī)物證鑒定的主要優(yōu)點(diǎn)：1、高靈敏度：適用于微量降解檢材。 2、高鑒別能力：節(jié)約檢材、試劑和提高效率。 3、標(biāo)準(zhǔn)化分型：實(shí)現(xiàn)數(shù)字化結(jié)果，利于實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)交換，建立數(shù)據(jù)庫。miniSTR：通過重新設(shè)計(jì)引物，使其結(jié)合在更靠近核心重復(fù)區(qū)的側(cè)翼序列，從而降低擴(kuò)增產(chǎn)物的大小

19、，進(jìn)一步提高靈敏度和分型成功率，這種技術(shù)稱為短片段STR分型或miniSTR分型。miniSTR的優(yōu)勢：ØSTR基因座的擴(kuò)增片段較短，靈敏度更高，尤其適用于極微量或嚴(yán)重降解生物檢材的DNA分型； Ø等位基因片段長度范圍較窄，不易發(fā)生因小等位基因的優(yōu)勢擴(kuò)增而造成的等位基因丟失現(xiàn)象； Ø可對多個(gè)STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，從而節(jié)約檢材、降低成本，提高單次檢測的信息量miniSTR分型的局限性：1、因擴(kuò)增片段長度的限制，構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)只能同時(shí)擴(kuò)增較少的基因座（通常每種顏色的熒光標(biāo)記的基因座不超過2個(gè)）。要想達(dá)到與傳統(tǒng)的商品化試劑盒接近的個(gè)人識別能力，必須增加復(fù)合擴(kuò)增的

20、次數(shù)。2、miniSTR引物與傳統(tǒng)的引物結(jié)合區(qū)之間若存在堿基的插入和缺失，易導(dǎo)致miniSTR與傳統(tǒng)STR分型結(jié)果的不一致。 3. 若某些STR基因座核心重復(fù)區(qū)上游或下游側(cè)翼序列存在嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，則不利于miniSTR引物設(shè)計(jì)。4、 當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物過小時(shí)，未消耗引物上的染料分子或稱“染料污斑”（dye blobs）可使產(chǎn)物峰變寬、信號變?nèi)?。這種影響在檢測降解生物樣本時(shí)更為明顯。 Y-STR有何法醫(yī)學(xué)應(yīng)用特點(diǎn)：1、Y染色體為男性特有2、Y-STR呈父系遺傳特征3、單倍體遺傳：在減數(shù)分裂過程中，Y-特異性區(qū)不發(fā)生重組，所有Y-STR基因座均呈連鎖遺傳，等位基因頻率不能以相乘方法計(jì)算4、

21、GD=PE5、結(jié)果不具有唯一性，不能認(rèn)定。其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值在于排除Y-STR分型中需要注意的問題：因?yàn)閄和Y染色體部分序列具有高度相似性，有些Y-STR分型時(shí)在X染色體上也能檢出擴(kuò)增產(chǎn)物男性個(gè)體可見額外的產(chǎn)物峰，女性個(gè)體也可有分型結(jié)果。 部分Y-STR基因座，有時(shí)可檢出二個(gè)或三個(gè)等位基因，易被誤認(rèn)為不同男性的混合樣本。第五章 STR自動(dòng)分型 STR自動(dòng)分型技術(shù)的主要步驟：1、DNA自動(dòng)化提取 2、PCR多色熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增 3、PCR產(chǎn)物電泳前處理 4、自動(dòng)毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)的熒光檢測 5、自動(dòng)數(shù)據(jù)采集并分型 off-ladder：在STR分型圖譜中，常會遇到部分樣本的少量片段峰未被

22、程序化數(shù)字命名，在分型圖譜中被標(biāo)識為off-ladder。漂移作用和新等位基因都可標(biāo)識為off-ladder低拷貝DNA（low copy number，LCN）：是指基因組含量小于100pg的樣本。第六章 DNA序列多態(tài)性PCR循環(huán)測序的基本原理：PCR技術(shù)能夠快速、特異性地?cái)U(kuò)增靶DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)測定DNA序列分為兩個(gè)步驟：先利用PCR擴(kuò)增靶序列片段，制備測序模板，然后再利用PCR直接測定序列。PCR測序采用了熱循環(huán)高效合成DNA的特性并結(jié)合雙脫氧核苷酸終止法，使引物鏈終止的延伸產(chǎn)物數(shù)量在熱循環(huán)過程中得到增加，因此稱為循環(huán)測序。每個(gè)測序循環(huán)包括：PCR擴(kuò)增制備的模板DNA變性成單鏈形式

23、；標(biāo)記引物與其中的一條鏈上的互補(bǔ)序列退火；退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應(yīng)。本次循環(huán)產(chǎn)生的模板鏈與延伸終止鏈形成的雙鏈的產(chǎn)物，在下一輪測序循環(huán)中，再次被變性，釋放出模板鏈，作為又一輪引發(fā)反應(yīng)的模板，同時(shí)積累下一輪循環(huán)產(chǎn)生的鏈終止產(chǎn)物。上述循環(huán)步驟重復(fù)2040次，使鏈終止產(chǎn)物以線性方式獲得擴(kuò)增。DNA自動(dòng)測序技術(shù)：DNA自動(dòng)測序技術(shù)是以4種熒光染料基團(tuán)分別作為4種ddNTP終止鏈的標(biāo)記物，于20世紀(jì)80年代末期建立的一種高效、快速、自動(dòng)化的序列測定技術(shù)。4種熒光染料分別作為測序反應(yīng)中4種ddNTP終止鏈的標(biāo)記物，即4種被雙脫氧核苷酸終止的DNA片段分別帶上4種不同的顏色。這

24、些DNA片段的混合物同時(shí)加在一個(gè)樣品槽中電泳展開，相互間僅差1個(gè)堿基的DNA片段形成一條具有4種顏色的階梯分布圖像。階梯中的每- DNA片段由標(biāo)記在該片段上的特征性熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光所指示。熒光染料基團(tuán)作為標(biāo)記物的基本要求是經(jīng)過激光誘發(fā)的吸收光譜波長在可見光波長范圍內(nèi)，不影響延伸反應(yīng)，不影響標(biāo)記后DNA片段的電泳性質(zhì)。其次要求4種熒光的吸收和激發(fā)光波長要有足夠的差異，便于檢測。熒光染料的摻入的方式有兩種：一種是將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)通用引物的5端。4種熒光標(biāo)記形成4種標(biāo)記引物，測序反應(yīng)分4個(gè)反應(yīng)管進(jìn)行，特定的熒光染料與相應(yīng)的ddNTP是對應(yīng)關(guān)系，例如熒光示蹤染料JOE標(biāo)記的通用引物總是與

25、ddATP加在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)，因此由ddATP終止的所有延伸鏈都帶有JOE。這種方式被稱為Dye-Primers。另一種是將熒光染料基團(tuán)連在ddNTP上，4種熒光染料分別與4種ddNTP底物連接，反應(yīng)產(chǎn)生的4組DNA片段分別由特定ddNTP所終止，并且標(biāo)記有4種不同的熒光發(fā)色基團(tuán)，A、C、G和T分別攜帶有綠、紅、藍(lán)、黃4種熒光。這種方式被稱為Dye-Terminators。兩種方式各有特點(diǎn)，不過前者要求A，G，C，T分4個(gè)反應(yīng)進(jìn)行，而后者的4組反應(yīng)可以在同一管中完成。上述兩種方法都能確定4種熒光與4種ddNTP所終止的DNA片段之間的對應(yīng)關(guān)系，這是后來從電泳中檢測標(biāo)記物信號以及最終讀序的基礎(chǔ)。

26、自動(dòng)測序儀器無論是變性PAG平板凝膠電泳還是毛細(xì)管電泳，都配置有激光束激發(fā)系統(tǒng)和熒光信號收集檢測系統(tǒng)。當(dāng)DNA片段電泳通過檢測窗口時(shí)，在激光束的激發(fā)下，片段的電泳時(shí)間和被激發(fā)熒光的波長、強(qiáng)度等信號都被記錄，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)作數(shù)據(jù)處理，最后在屏幕上顯示每一樣品的各終止片段電泳分離的模擬圖像。不同顏色的峰標(biāo)示各自標(biāo)記的堿基及其排列順序(如圖所示)：MVP（minisatellite variant repeat）序列：稱為具有變異核心序列的小衛(wèi)星DNA，是一類既有長度多態(tài)性又有序列差異的DNA重復(fù)序列。線粒體DNA的特點(diǎn)：人類線粒體的基因排列得非常緊湊，除與mtDNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外，無內(nèi)

27、含子序列。mtDNA為高效利用DNA有5個(gè)閱讀框架，缺少終止密碼子，僅以U或UA結(jié)尾。mtDNA的突變率高于核中DNA，并且缺乏修復(fù)能力。mtDNA為母系遺傳。部分mtDNA的密碼子不同于核內(nèi)DNA的密碼子。血型（blood group）：是人類血液由遺傳控制的個(gè)體性狀之一，是血液的遺傳標(biāo)記（genetic marker）。紅細(xì)胞血型是指紅細(xì)胞表面抗原由遺傳決定的個(gè)體差異?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)抗原分布紅細(xì)胞膜上分泌液中血漿中糖脂質(zhì)HAB、PILea、Leb莫內(nèi)蛋白Rh、Kell糖蛋白（寡糖+多肽）MN、HLAHAB、Lea、Leb蛋白質(zhì)Gm、KmABO血型（重點(diǎn)）：ABO血型系統(tǒng)是最早發(fā)現(xiàn)，最重要的血型系

28、統(tǒng)。人類學(xué)與遺傳學(xué)研究、器官移植，以及法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的個(gè)人識別與親子鑒定均需應(yīng)用這個(gè)系統(tǒng)。.一、ABO血型.4種普通血型的劃分及存在相應(yīng)的抗體.1.紅細(xì)胞ABO血型系統(tǒng)的分型。ABO血型系統(tǒng)分四種型：即O型、A型、B型與AB型。.2.四種血型個(gè)體血清中存在的相應(yīng)抗體：血清中有天然抗體，B型血清中有抗A抗體；A型血清中有抗B抗體；O型血清中有抗A、抗B及抗A，B等抗體；AB型血清中沒有抗體ABO血型抗體恒定地存在于正常人的血清中，可以預(yù)測其存在，故稱為規(guī)則抗體。.3.正常的A、B、AB、O型的檢測。利用抗A與抗B血清，以及A與B型紅細(xì)胞，可以測定未知血液的ABO血型。.二、ABO血型抗體.正常情況

29、下，凡紅細(xì)胞沒有某一種或某兩種ABO抗原，又無明顯的外來A或B抗原的刺激，其血清中含有與紅細(xì)胞上缺失抗原相對應(yīng)的天然抗A、抗A1或抗B抗體。.(一) 抗A、抗B抗體的生成.新生兒血中的IgG抗A與抗B抗體多來自母體，故一般不對新生兒進(jìn)行血型測定。36個(gè)月以內(nèi)的嬰兒，多數(shù)尚未產(chǎn)生抗A與抗B抗體；6個(gè)月以后，抗體逐漸產(chǎn)生；510歲抗體效價(jià)達(dá)最高峰；隨著年齡的增長，抗體效價(jià)逐漸降低，老年人抗體水平明顯地低于年輕的成年人。.(二) 抗A、抗B抗體的特性.1、抗A與抗B抗體最顯著的血清效應(yīng)是凝集反應(yīng)，在適當(dāng)?shù)臈l件下也可以發(fā)生溶血反應(yīng)；.2、ABO血型測定都在室溫中(2225)進(jìn)行，偶爾在4下進(jìn)行；.3、

30、抗A和抗B抗體可以是天然的，也可以是免疫抗體；.4、B型與A型血液中的天然抗A與抗B抗體大多數(shù)是IgM；.5、天然IgM與IgG抗A與抗B抗體均能在鹽水介質(zhì)中使紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，在室溫中具有抗體活性。.(三)抗H抗體.由于O、A、B或AB型紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)上含有H成分，故其血清中很少有抗H抗體。.三、ABO血型的遺傳.(一) 各種不同表型的雙親所生子女的血型。.(二) ABO血型按孟德爾規(guī)律遺傳.ABO血型系統(tǒng)按孟德爾定律遺傳，人類染色體上的一個(gè)座位為.A、B、O.三個(gè)等位基因之一所占，每一個(gè)體有一對染色體，一條來自父親，另一條來自母親，紅細(xì)胞ABO型的表達(dá)由基因決定。ABO血型有4種普通型，由復(fù)

31、等位基因.A、B及O.所控制，有6種基因型，決定4種表現(xiàn)型。四種表現(xiàn)型、六種基因型，一個(gè)基因座位，三個(gè)等位基因。.何謂ABO血型的正反定型？正定性試驗(yàn)：根據(jù)RBC與特異性抗體的反應(yīng)來分型，即用抗A抗體判定A抗原，用抗B抗體判定B抗原。反定型試驗(yàn)：依據(jù)血清中的凝集素與標(biāo)準(zhǔn)型RBC膜上的凝集原反應(yīng)的性質(zhì)，即用標(biāo)準(zhǔn)的A型RBC判定抗A抗體，用標(biāo)準(zhǔn)的B型RBC判定抗B抗體，同時(shí)也應(yīng)用抗H抗體判定H抗原。試述ABO血型的DNA分型方法 PCR-SSP序列特異性引物PCR技術(shù)：特異性強(qiáng)、重復(fù)性好；PCR-RFLP。Rh血型：凡是人體血液紅細(xì)胞上有Rh凝集原者，為Rh陽性。反之為陰性。這樣就使已發(fā)現(xiàn)的紅細(xì)胞

32、A、B、O及AB四種主要血型的人，又都分別一分為二地被劃分為Rh陽性和陰性兩種。在中國，Rh陰性血型只占千分之三到四。RH陰性A型、B型、O型、AB型的比例是3：3：3：1。Rh血型鑒定：RhD抗原分布：Rh血型鑒定一般指Rh系統(tǒng)中D抗原的檢測，根據(jù)病人紅細(xì)胞是否帶有D抗原分為Rh陽性和Rh陰性。Rh血型鑒定正常值：Rh+，稱作“Rh陽性”、“Rh顯性”，表示人類紅細(xì)胞有“Rh因子”；Rh-，稱作“Rh陰性”，“Rh隱性”，表示人類紅細(xì)胞沒有“Rh因子”。HLA（human leukocyte antigen）抗原：即人類白細(xì)胞抗原，是人類最復(fù)雜的顯性遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，也是迄今為止人類基因組中密

33、度最高的區(qū)域。HLA系統(tǒng)具有極其重要的功能，如抗原的加工、呈遞，控制免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞間相互作用，對異體移植物的排斥，腫瘤監(jiān)視，參與大量的自身免疫性疾病的發(fā)生。人類白細(xì)胞膜上的抗原分為三類：是紅細(xì)胞血型抗原，如ABH、Lea、Leb、Jka、K、k、Dib等；是白細(xì)胞本身特有的抗原，如CD4、CD8、Leu8等；是與其他組織共有的，也是最強(qiáng)的同種抗原，即人類白細(xì)胞抗原。HLA抗原的結(jié)構(gòu)和分布：HLA-I類和HLA-II類抗原存在于細(xì)胞表面，為跨膜蛋白質(zhì)，均為異二聚體蛋白。HLA-I類抗原分布廣泛，幾乎存在于所有的有核細(xì)胞表面，以淋巴細(xì)胞上的密度最高；含有HLA-II類抗原的組織比I類抗原少

34、得多，密度最高者為樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞，一些吞噬細(xì)胞亞群及B細(xì)胞。結(jié)構(gòu)：HLA-I類基因產(chǎn)物為HLA-A、B和C抗原，由重鏈和輕鏈兩條多肽鏈構(gòu)成；HLA-II類基因產(chǎn)物為HLA-DR、DQ、DP抗原，均為跨膜糖蛋白，由和兩條鏈構(gòu)成。HLA遺傳：HLA基因定位于6號染色體，占整個(gè)人類基因組全部堿基序列的0.12%。HLA區(qū)主要有HLA-I、II、III類基因座。表現(xiàn)為：共顯性遺傳、單倍型遺傳、連鎖不平衡。HLA遺傳特征：共顯性遺傳：每個(gè)HLA基因座表達(dá)一對抗原，人類HLA每個(gè)基因座上有眾多等位基因。故如果血清學(xué)方法分型時(shí)，個(gè)體只檢測出了一個(gè)抗原則有三種可能：該抗原的純合子、HLA血清板不完全、存

35、在一種至今尚未發(fā)現(xiàn)的抗原。單倍型遺傳：單倍體是指一條染色體上HLA各基因座的基因緊密連鎖組成的基因遺傳單位。連鎖不平衡：HLA在實(shí)際群體調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各基因座的基因并非完全隨機(jī)組成單倍型，有些單倍型觀察頻率高于期望頻率或低于期望頻率，這種現(xiàn)象稱為連鎖不平衡。處于連鎖部平衡狀態(tài)說明HLA不同基因座的基因之間存在關(guān)聯(lián)，具有一同遺傳的趨向。HLA高多態(tài)性。HLA抗原的分布：HLA-I類抗原：分布廣發(fā)，幾乎存在于所有的有核細(xì)胞表面，以淋巴細(xì)胞上的密度最高；成熟RBC上沒有HLA-A、B、和DR抗原，幼稚RBC卻有；HLA-II類抗原：密度最高者為DC、單核細(xì)胞，一些吞噬細(xì)胞亞群及B細(xì)胞；II類抗原作為一種分化抗原在不同細(xì)胞上表達(dá)，大多數(shù)骨髓分化細(xì)胞具有HLA-II類抗原。HLA命名原則：以大寫字母A、D、C.表示HLA遺傳區(qū)域中的座位；HLA抗原特異性用數(shù)字表示；為防止與補(bǔ)體組分命名相混淆，HLA-C抗原特異性以Cw為字首命名；HLA基因命名一般以4位數(shù)字表示，其中前2位數(shù)字表示對應(yīng)最相近的HLA抗原特異性，后2位數(shù)字則用于表示亞型的等位基因，如A*0101；如果出現(xiàn)第五位數(shù)字，則代表“沉默取代”，