第十章免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)

1、第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 第十章第十章 免疫細(xì)胞的免疫細(xì)胞的分離和分離和功能檢測(cè)功能檢測(cè) 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 目錄目錄 1外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和純化2淋巴細(xì)胞及其亞群的分離淋巴細(xì)胞及其亞群的分離3吞噬細(xì)胞的分離和收集吞噬細(xì)胞的分離和收集返回總目錄返回總目錄第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 3免免疫細(xì)胞疫細(xì)胞的分離及檢測(cè)的分離及檢測(cè)檢測(cè)：檢測(cè)：各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和各類免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能測(cè)定功能測(cè)定方法方法：體體外法為外法為主主目的：目的：

2、判斷機(jī)體免疫狀態(tài)判斷機(jī)體免疫狀態(tài)意義意義：探討疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展、預(yù)后探討疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展、預(yù)后、療效、療效免疫細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞的分離 是指將各種參與免疫反應(yīng)的是指將各種參與免疫反應(yīng)的 細(xì)胞從血液或組織中分離出來(lái)細(xì)胞從血液或組織中分離出來(lái) 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 免疫細(xì)胞種類第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 大大吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞: :即單核即單核- -吞噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬細(xì)胞系統(tǒng) 小小吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞: :即中性粒細(xì)胞即中性粒細(xì)胞第一節(jié)第一節(jié) 吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞的分離和收集的分離和收集吞噬細(xì)胞的種類吞噬細(xì)胞的種類第十章第十

3、章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 特征特征性標(biāo)志性標(biāo)志 CD14CD14分離技術(shù)分離技術(shù) PecollPecoll密度梯度分離法密度梯度分離法 流式細(xì)胞儀分離技術(shù)流式細(xì)胞儀分離技術(shù) 免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法免疫磁珠分離法：為目前較常用的方法 黏附法黏附法一、吞噬細(xì)胞的分離一、吞噬細(xì)胞的分離（一）單核細(xì)胞的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 斑蝥斑蝥敷貼法分離人巨噬細(xì)胞敷貼法分離人巨噬細(xì)胞 動(dòng)物動(dòng)物的巨噬細(xì)胞直接從腹腔滲出液中獲取的巨噬細(xì)胞直

4、接從腹腔滲出液中獲取 （二）巨噬細(xì)胞的分離（二）巨噬細(xì)胞的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 聚合物加速沉降法聚合物加速沉降法 可從外周血中分離出白細(xì)胞可從外周血中分離出白細(xì)胞RBC血漿血漿(抗凝血抗凝血)WBCRBC FicollFicoll分離法分離法 可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞可從白細(xì)胞中分離出純化的中性粒細(xì)胞（三）中性粒細(xì)胞的分離（三）中性粒細(xì)胞的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞密度梯度離心分離中性粒細(xì)胞第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和

5、功能檢測(cè) 吞噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)大體分為吞噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)大體分為趨化趨化、吞噬吞噬和和胞內(nèi)殺胞內(nèi)殺滅滅作用三個(gè)階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。作用三個(gè)階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。 （一）中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)（一）中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù) （二）巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)（二）巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù)二、相關(guān)功能檢測(cè)二、相關(guān)功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 細(xì)胞趨化功能的檢測(cè)細(xì)胞趨化功能的檢測(cè)吞噬功能的檢測(cè)吞噬功能的檢測(cè)殺菌功能的檢測(cè)殺菌功能的檢測(cè)（一）中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)（一）中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 體內(nèi)試驗(yàn)法：

6、皮膚體內(nèi)試驗(yàn)法：皮膚窗法窗法 體外試驗(yàn)法：濾膜滲透法體外試驗(yàn)法：濾膜滲透法 瓊脂糖平板法瓊脂糖平板法 趨化功能檢測(cè)趨化功能檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能皮膚窗法皮膚窗法 在在受檢者前臂屈側(cè)中央受檢者前臂屈側(cè)中央3 3范圍內(nèi)，搔刮范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2 2，5 5，8 8，1212，2424，3636小時(shí)各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集小時(shí)各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時(shí)間、聚集程度等。健康正常人一般開始時(shí)間、聚集程度等。健康正常人一般2 23h3h后后開始聚集，達(dá)開始聚集，達(dá)5050100100個(gè)，個(gè)，6 6小時(shí)可達(dá)小時(shí)可達(dá)1

7、0001000個(gè)以上個(gè)以上。 第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原理及技術(shù)要點(diǎn)原理及技術(shù)要點(diǎn) 在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加在一特制的分上下兩層的小盒，將趨化因子加入下室，待檢細(xì)胞加入上室，兩室用微孔濾膜分入下室，待檢細(xì)胞加入上室，兩室用微孔濾膜分隔，隔，3737溫育數(shù)小時(shí)后，上室的中性粒細(xì)胞受下溫育數(shù)小時(shí)后，上室的中性粒細(xì)胞受下室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取室趨化因子的吸引，由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，取濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡濾膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍鏡下觀察細(xì)胞穿越濾膜的移動(dòng)距離，從而判斷其趨下觀察細(xì)胞穿越濾膜

8、的移動(dòng)距離，從而判斷其趨化功能?；δ堋V膜滲透法濾膜滲透法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原理及技術(shù)要點(diǎn)原理及技術(shù)要點(diǎn) 在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對(duì)照液，溫育趨化因子，右孔加對(duì)照液，溫育48小時(shí)后，用顯小時(shí)后，用顯微鏡測(cè)微器測(cè)定中性粒細(xì)胞向左孔的移動(dòng)距離微鏡測(cè)微器測(cè)定中性粒細(xì)胞向左孔的移動(dòng)距離A和和向右孔的移動(dòng)距離向右孔的移動(dòng)距離B，計(jì)算趨化指數(shù)。，計(jì)算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)趨化指數(shù)= A/B趨化指數(shù)越大，表明中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能越強(qiáng)趨化指數(shù)越大，表明中性粒細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能越強(qiáng) 瓊脂糖平板法瓊脂糖

9、平板法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 顯微鏡檢查法顯微鏡檢查法 100(%)計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)吞噬率吞噬指數(shù)=（一）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)（一）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) NBTNBT還原試驗(yàn)還原試驗(yàn) 原理：原理：N-N-C + H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黃色）四氮唑基（淡黃色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）殺菌功能檢測(cè)殺菌功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 方法：方法：1.1.抗抗凝血凝血 + + 硝基藍(lán)四氮唑（硝基藍(lán)四氮唑（N

10、BTNBT），），3737孵孵育育25min25min。2.2.推推片染色、鏡檢。片染色、鏡檢。正常值：正常值：NBTNBT陽(yáng)性細(xì)胞率應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞率應(yīng)95% 95% NBT還原試驗(yàn)還原試驗(yàn)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 炭炭粒廓清試驗(yàn)粒廓清試驗(yàn) 正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除9090炭粒，脾炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除巨噬細(xì)胞約吞噬清除1010炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時(shí)間注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃

11、度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。（二）巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)（二）巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) M +CRBCM +CRBC孵育孵育涂片、染色、鏡檢涂片、染色、鏡檢計(jì)算、吞噬率、吞噬指計(jì)算、吞噬率、吞噬指數(shù)數(shù)吞噬率（吞噬吞噬率（吞噬CRBCCRBC的的M 數(shù)數(shù)/ /計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)的M 數(shù)數(shù)）100100吞噬指數(shù)吞噬指數(shù) M吞噬的CRBCCRBC總數(shù)總數(shù)/ /計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)的M 數(shù)數(shù)吞噬功能檢測(cè)吞噬功能檢測(cè)返回章目錄返回章目錄第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) PBMCPB

12、MC包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞包括：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞 各種血細(xì)胞比重不同各種血細(xì)胞比重不同, ,利用密度梯度離心進(jìn)行分離利用密度梯度離心進(jìn)行分離 常用分層液：常用分層液：ficollhypaque，percoll第二節(jié)第二節(jié) 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和純化外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和純化第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 細(xì)胞細(xì)胞比重比重血小板血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白細(xì)胞多核白細(xì)胞1.092紅細(xì)胞紅細(xì)胞1.093外周血各細(xì)胞成分的密度第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) Ficoll分離液法分離液法是一種單次差

13、速密度梯度離心是一種單次差速密度梯度離心的分離法，主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞。的分離法，主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞。 原原理：理：Ficoll分層液：密度分層液：密度1.0771.0770.0010.001 離心：密度梯度離心離心：密度梯度離心 分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布分離：各類細(xì)胞按其相應(yīng)密度重新分布一、一、Ficoll分離法分離法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) Ficoll分層液分離單個(gè)核細(xì)胞示意圖第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 7898Percoll分離單個(gè)核細(xì)胞示意圖返回章目錄返回章目錄第十章第十章

14、免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 紅細(xì)胞紅細(xì)胞的去除：低滲裂解法、氯化銨裂解法的去除：低滲裂解法、氯化銨裂解法 血小板血小板的去除的去除 ：胎牛血清：胎牛血清梯度離心法梯度離心法單核細(xì)胞單核細(xì)胞的去除的去除：黏附法：黏附法 羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法）羰基鐵吞噬法（磁鐵吸引法） 苯丙氨酸苯丙氨酸甲酯去除法甲酯去除法 第三節(jié)第三節(jié) 淋巴細(xì)胞及其亞群的分離淋巴細(xì)胞及其亞群的分離一、淋巴細(xì)胞的純化一、淋巴細(xì)胞的純化第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法 其他方法其他方法二、淋巴細(xì)胞亞群的分離二、淋巴細(xì)

15、胞亞群的分離第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原理原理 將針對(duì)淋巴細(xì)胞特殊表面標(biāo)志的某種特異性將針對(duì)淋巴細(xì)胞特殊表面標(biāo)志的某種特異性單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成單克隆抗體與磁珠結(jié)合形成免疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB），當(dāng)特異性單克隆抗體與表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞結(jié)當(dāng)特異性單克隆抗體與表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞結(jié)合，利用磁場(chǎng)可以將合，利用磁場(chǎng)可以將IMBIMB所結(jié)合細(xì)胞與其他細(xì)胞所結(jié)合細(xì)胞與其他細(xì)胞分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗分離。包被磁珠的抗體可以是第一抗體或第二抗體。體。 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢

16、測(cè) 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 488 nm 激光激光+-前向散射光前向散射光檢測(cè)器檢測(cè)器 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電磁場(chǎng)電磁場(chǎng)單個(gè)細(xì)胞被分類單個(gè)細(xì)胞被分類進(jìn)入檢測(cè)管進(jìn)入檢測(cè)管流流式式細(xì)細(xì)胞胞術(shù)術(shù)分分離離原原理理示示意意圖圖第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) E花環(huán)沉降法花環(huán)沉降法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) T T細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞功能檢測(cè) B B細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞功能檢測(cè) NKNK細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞功能檢測(cè)三、相關(guān)功能檢測(cè)三、相關(guān)功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和

17、功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) T T細(xì)胞增殖試驗(yàn)細(xì)胞增殖試驗(yàn) T T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn) MHC-MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù) 淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè) T細(xì)胞功能檢測(cè)細(xì)胞功能檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞DNADNA合成合成分化分化母細(xì)胞母細(xì)胞刺激物刺激物細(xì)胞細(xì)胞變大變大細(xì)胞漿擴(kuò)大細(xì)胞漿擴(kuò)大空泡空泡核仁明顯核仁明顯核染色質(zhì)疏松核染色質(zhì)疏松T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 非特異性刺激物：非特異性刺激物： PHA - TPHA - T細(xì)胞

18、細(xì)胞 ConA - TConA - T細(xì)胞細(xì)胞 PWM - TPWM - T、 B B細(xì)胞細(xì)胞 LPS - BLPS - B細(xì)胞細(xì)胞特異性刺激物：特異性刺激物： 異種抗原異種抗原 同種組織抗原同種組織抗原淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 形態(tài)學(xué)檢查法形態(tài)學(xué)檢查法 3H-TdR3H-TdR摻入法摻入法 MTTMTT比色法比色法 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測(cè)方法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測(cè)方法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 形態(tài)學(xué)檢查法形態(tài)學(xué)檢查法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 轉(zhuǎn)化的

19、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴母細(xì)胞 過(guò)渡型過(guò)渡型細(xì)胞大小細(xì)胞大小( (直徑直徑m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色質(zhì)核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4個(gè)個(gè)有或無(wú)有或無(wú)無(wú)無(wú)有絲分裂有絲分裂有或無(wú)有或無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)胞質(zhì)、著色胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色極少、天青色漿內(nèi)空泡漿內(nèi)空泡有或無(wú)有或無(wú)有或無(wú)有或無(wú)無(wú)無(wú)偽足偽足有或無(wú)有或無(wú)有或無(wú)有或無(wú)無(wú)無(wú)未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的形態(tài)特征第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫

20、細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原理：原理：刺激物刺激物3756hG1期期 S1期期 合成合成DNADNA 3H-TdR3716hDNA- 3H-TdR測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)放射量（cpmcpm）計(jì)算計(jì)算SISI判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度判斷淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度外周血（外周血（T T）G G0 0期期3H-TdR摻入法摻入法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 評(píng)價(jià)：該方法敏感性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)評(píng)價(jià)：該方法敏感性高、客觀性強(qiáng)、重復(fù)性好、可自動(dòng)操作；設(shè)備昂貴、放射污染性好、可自動(dòng)操作；設(shè)備昂貴、放射污染。 刺激指數(shù)（刺激指數(shù)（stimulating indexs

21、timulating index，SI SI ） SI=SI=試驗(yàn)管試驗(yàn)管cpmcpm均值均值/ /對(duì)照管對(duì)照管cpmcpm均值均值3H-TdR摻入法摻入法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原理原理：外周血外周血T T細(xì)胞細(xì)胞 PHA發(fā)生增殖發(fā)生增殖 MTT含藍(lán)色甲顆粒含藍(lán)色甲顆粒 的的T T細(xì)胞細(xì)胞 MTT PHA 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑測(cè)吸光度（測(cè)吸光度（A A）值）值 計(jì)算計(jì)算SISI判定細(xì)胞增殖結(jié)果判定細(xì)胞增殖結(jié)果SI=值對(duì)照孔值試驗(yàn)孔AA(SI2(SI2具有意義具有意義) ) MTT比色法比色法第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原

22、理原理:靶細(xì)胞抗原靶細(xì)胞抗原T T細(xì)胞細(xì)胞觀察殺傷活力觀察殺傷活力致敏致敏CTLCTL靶細(xì)胞靶細(xì)胞（三）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法: 同位素法同位素法 淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CTLCTL）+ +含含51Cr 51Cr 的腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞破壞腫瘤細(xì)胞破壞 51Cr 51Cr 釋放釋放 測(cè)定測(cè)定射線射線51Cr特異釋放率= 均值對(duì)照孔均值最大釋放孔均值對(duì)照孔均值試驗(yàn)孔cpmcpmcpmcpm100%（三）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離

23、和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) （三）（三）T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)背景無(wú)效應(yīng)細(xì)胞背景無(wú)效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞靶細(xì)胞 1:1效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞靶細(xì)胞 5:1效應(yīng)細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞靶細(xì)胞 20:1細(xì)胞溶解細(xì)胞溶解第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)原理原理 根據(jù)根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識(shí)別原理，用生物工細(xì)胞活化的雙識(shí)別原理，用生物工程技術(shù)將程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)抗原特異性

24、細(xì)胞儀定量檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞。細(xì)胞。T第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 技術(shù)要點(diǎn)技術(shù)要點(diǎn) : 1.1.在體外將特異性抗原肽段、可溶性在體外將特異性抗原肽段、可溶性MHCIMHCI類分子類分子重鏈及重鏈及2 2微球蛋白正確折疊，形成微球蛋白正確折疊，形成MHC-MHC-抗原肽抗原肽復(fù)合物，并純化該復(fù)合物。復(fù)合物，并純化該復(fù)合物。 2. 2.用生物素標(biāo)記用生物素標(biāo)記MHC-MHC-抗原肽復(fù)合物?？乖膹?fù)合物。 3. 3.生物素標(biāo)記的生物素標(biāo)記的MHC-MHC-抗原肽復(fù)合物與熒光標(biāo)記的抗原肽復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親和素以親和素以4: 14: 1的比例相混合，即得到熒光標(biāo)記

25、的的比例相混合，即得到熒光標(biāo)記的四聚體四聚體 MHC- -肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) MHC-MHC-肽四聚體技術(shù)肽四聚體技術(shù)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 原理原理: : 用用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞制如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測(cè)出淋巴細(xì)胞內(nèi)的基體積聚，用流式細(xì)胞儀便可測(cè)出淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，從而確定細(xì)胞因子種類，從而確定TH1/ TH2TH1/ TH2細(xì)胞的百分率。細(xì)胞的百分率。淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)第十章第十章 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離和功能檢測(cè)的分離和功能檢測(cè) 分泌的細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞因子 Thl Th2Thl Th2 IL-2 + - IFN- + - TNF- + + IL-3 + + GM-CSF + + TNF- - + IL-4 - + IL-5 - + IL-6 - + IL-10