消毒和滅菌效果的評價方法和標(biāo)準(zhǔn).

1、消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)第一篇壓力蒸汽滅菌效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)1主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其評價滅菌效果的檢測方法。本方法適用于對壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的評價。2試齊IJ本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未說明規(guī)格者，均為分析純（ AR）,水為蒸儲水。2. 1蛋白月東。2. 2 葡萄糖。2. 3 澳甲酚紫酒精溶液：取澳甲酚紫 2. 0g,溶于100mL95 %乙醇中。2. 4澳甲酚紫蛋白月東水培養(yǎng)基配制：蛋白臍 10. 0g,葡萄糖5. 0g,溶于1000mL蒸 儲水中，調(diào)pH值至7. 07. 2,然后再加2%澳甲酚紫酒精溶液 0. 6mL ,搖勻后，按5 mL/管，分裝包口，

2、置壓力蒸汽滅菌器中，于 115c滅菌40min后備用。3指示菌嗜熱脂肪桿菌芽胞（ATCC 7953或SSI K31）菌片，含菌量為 5X1055X106cfu/片，1 21c下，殺滅90%微生物所需時間 D121值為1. 31. 9min,殺滅時間（KT值）為19mi n,存活時間（ST值）為m.9min。4化學(xué)指示劑需用衛(wèi)生部批準(zhǔn)的化學(xué)指示劑。5 技術(shù)要求壓力蒸汽滅菌器壓力,MPa/cm2溫度C火菌時間，min下排氣式0.070115400.10512130預(yù)真空式0.2101344-6國家技術(shù)監(jiān)督局 1995-12-15批準(zhǔn)1996-07-01實(shí)施6檢測方法6. 1生物學(xué)指標(biāo)（用作壓力蒸汽

3、滅菌設(shè)備滅菌效果的依據(jù)）。6. 1. 1將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個分別放入滅菌小紙袋內(nèi)，置于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包中心 部位。6. 1. 2 滅菌柜室內(nèi)，上、中層中央和排氣口處各放置一個標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包（由 3件平紋 長袖手術(shù)衣，4塊小手術(shù)巾，2塊中手術(shù)巾，1塊大手術(shù)巾，30塊10cmM0cm、8層紗布敷 料包裹成25cm X30cm x30cm大小）。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒（22cm M 3cm 6cm）代替標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包，盒內(nèi)盛滿中試管，指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內(nèi)（試管口用 滅菌牛皮紙包封），將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。6. 1. 3 經(jīng)一個滅菌周期后，在無菌條件下，取出標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯

4、物盒中的指示 菌片，投入澳甲酚紫葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中，56c培養(yǎng)48h,觀察培養(yǎng)基顏色變化。6. 2化學(xué)指標(biāo)在物品包外用化學(xué)指示膠帶，可作為物品是否經(jīng)過滅菌的處理標(biāo)志。在物品包內(nèi)中心部位用化學(xué)指示劑，可作為物品是否滅菌的參考標(biāo)志。7結(jié)果判定及評價7. 1同次檢測中，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯物盒內(nèi)，每個指示菌片接種的澳甲酚紫蛋白月東 水培養(yǎng)基全部不變色，判定為滅菌合格。指示菌片之一接種的澳甲酚紫蛋白月東水培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色時，判定為滅菌不合格。7. 2化學(xué)指示劑的顏色變?yōu)榕c滅菌合格標(biāo)準(zhǔn)色相同時，或熔化時作為滅菌合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。第二篇紫外線表面消毒效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)8主題內(nèi)容與適用范圍本方法規(guī)定了物

5、體表面消毒用紫外線的波長、強(qiáng)度及評價其消毒效果的物理學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)檢測方法。本方法適用于紫外線直接照射到的物體表面消毒效果評價。9指示菌9. 1 大腸桿菌（8099 或 ATCC 25922）。9. 2 枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC 9372）。10物理學(xué)指標(biāo)10. 1在電壓220V時，普通30W直管型紫外線燈，在室溫為2025c的使用情況下， 253. 7nm紫外線輻射強(qiáng)度（垂直 1m處）應(yīng)身0 W/cm2 。10. 2 在電壓220V時，高強(qiáng)度紫外線燈，在室溫為2025C的使用情況下，253. 7nm紫外線輻射強(qiáng)度（垂直 1m處）應(yīng) 或00（Wcm2 。10. 3照射劑量按式（1）計(jì)算:

6、劑量（iW s/cm2 ）=強(qiáng)度（jW/cm2 ）刈寸間（s）11檢測方法11 1物理學(xué)檢測方法11 1. 1燈管的紫外線強(qiáng)度（W/cm2 ）用中心波長為 253. 7nm的紫外線強(qiáng)度測定 儀（標(biāo)定有效期內(nèi)），在燈管垂直位置1m處測定。11 1. 2 在實(shí)際應(yīng)用中消毒表面的照射強(qiáng)度應(yīng)以燈管與消毒對象的實(shí)際距離測定。11 1. 3表面消毒接受的照射劑量，應(yīng)達(dá)殺滅目標(biāo)微生物所需。對大腸桿菌，照射劑 量應(yīng)達(dá)到20000 pWs/cm2 ,對枯草桿菌黑色變種芽胞應(yīng)達(dá)到100000pW s/cm2 。11 2生物學(xué)檢測方法11 2. 1采用載體定量消毒試驗(yàn)。載體制備按本標(biāo)準(zhǔn)附錄C進(jìn)行。11 2. 2 開

7、啟紫外線燈5min后，將8個染菌玻片平放于滅菌器皿中，水平放于適當(dāng) 距離照射，于4個不同間隔時間各取出 2個染菌玻片，分別投入2個盛有5mL洗脫液（1% 吐溫80, 1%蛋白月東生理鹽水）試管中，振打80次。11 2. 3經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取 0. 5mL洗脫液，作平板傾注，每個染菌玻片接種兩個， 放37 c培養(yǎng)48h作活菌計(jì)數(shù)。11 2. 4陽性對照，除不作照射處理外，取2個染菌玻片分別投入 2個盛有5mL洗脫液中振打80次，余按4. 2. 3進(jìn)行。11 2. 5 計(jì)算殺滅率12判定標(biāo)準(zhǔn)12. 1對指示菌殺滅率 淘9. 9%判為消毒合格。12. 2達(dá)物理學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)時，作為消毒合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。第三

8、篇液體消毒劑消毒效果評價方法與標(biāo)準(zhǔn)13主題內(nèi)容與適用范圍本方法具體規(guī)定了消毒劑消毒效果生物學(xué)檢測方法及其評價標(biāo)準(zhǔn)。本方法適用于消毒劑對各種物體的消毒效果評價。14理化指標(biāo)將消毒劑置20及C水浴中，測定在使用濃度下殺滅指示微生物達(dá)到消毒或滅菌所需的 最短時間（min）。15指示微生物15. 1細(xì)菌15. 1. 1細(xì)菌繁殖體：金黃色葡萄球菌（ ATCC 6538）、大腸桿菌（8099或ATCC 25922）。15. 1. 2 細(xì)菌芽胞：枯草桿菌黑色變種芽胞（ ATCC 9732）。15. 2 真菌：白色念珠菌（ATCC 10231）。15. 3乙型肝炎表面抗原：純化抗原（1. 0mg/mL ）。1

9、6檢測方法16. 1中和試驗(yàn)（見附錄 A）。16. 2消毒劑定性消毒試驗(yàn)（見附錄B）。16. 3消毒劑定量消毒試驗(yàn)（見附錄C）。16. 4消毒劑殺菌能量試驗(yàn)（見附錄D）。16. 5乙型肝炎表面抗原（HBsAg ）抗原性破壞試驗(yàn)（見附錄E）。17消毒效果評價標(biāo)準(zhǔn)17. 1對細(xì)菌和真菌的殺滅率 冷9. 9%,對HBsAg ,將檢測方法靈敏度 104倍或5X10 4倍（載體試驗(yàn)）的 HBsAg抗原性破壞，可判為消毒合格。11. 2對枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅，可判為滅菌合格。11. 3在實(shí)際應(yīng)用中消毒效果評價以有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)的最低濃度和最短時間為該消毒 劑達(dá)到實(shí)用消毒所需的濃度和時間。附錄A中和劑

10、中和效果試驗(yàn)（補(bǔ)充件）A1內(nèi)容提要為了準(zhǔn)確評價消毒劑對微生物的殺滅作用， 消毒試驗(yàn)中要求選擇適當(dāng)中和劑。 所選中和 劑不僅能及時中止消毒劑的殺微生物作用，且中和劑本身及其與消毒劑的反應(yīng)產(chǎn)物 （下稱中和產(chǎn)物）尚需對微生物無抑制或殺滅作用，對培養(yǎng)基無不良影響。A2 培養(yǎng)基和試劑A2 . 1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白臍 10.00g牛肉膏3.00g氯化鈉5.00g瓊脂15.00g蒸儲水1000. 00mL制法：除瓊脂外，其他成分溶解于蒸儲水中，調(diào) pH至7.27.4,加入瓊脂后加熱 溶解，過濾分裝，經(jīng) 121C、壓力蒸汽作用 30min,滅菌后備用。A2. 2 0. 03mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH

11、7. 2 7. 6,下稱 PBS）。成分：磷酸氫二鈉2. 84g磷酸二氫鉀1. 36g蒸儲水1000. 00mL制法：將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸儲水中，pH為7. 27. 4,分裝，經(jīng)121C、30min壓力蒸汽滅菌后備用。A3 器材A3 . 1錐形燒瓶。A3. 2 平皿（直徑9cm）。A3 . 3 量筒。A3 . 4 精密pH試紙。A3. 5 無菌試管。A3. 6 無菌刻度吸管（1. 0, 5. 0, 10. 0mL）。A3 . 7恒溫培養(yǎng)箱。A3. 8 冰箱。A3. 9菌落計(jì)數(shù)器。A3. 10酒精燈。A4中和劑（注明生產(chǎn)廠家，批號）A5 操作方法A5. 1 用PBS將指示菌制成 5X

12、10卜5X106cfu/mL 懸液。A5. 2 將消毒劑用滅菌蒸儲水配制成3種不同濃度，在不加中和劑的情況下，測知該消毒劑10min抑殺指示菌99. 9%以上的最低有效濃度。A5. 3取消毒劑10min抑殺指示菌的最低有效濃度與待選擇中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，選出中 和劑種類并依據(jù)等當(dāng)量中和原則，調(diào)整中和劑濃度，選出試驗(yàn)濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。A5. 4中和劑選擇試驗(yàn)時，先將消毒劑1. 0mL與中和劑溶液9. 0mL混合，制成中和產(chǎn)物溶液，再按表A1分組進(jìn)行。表A1中和劑選擇試驗(yàn) photo-2A6中和試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告方法（如表 A2）表A2 中和試驗(yàn)結(jié)果舉例 photo-33、4、5組間誤差率計(jì)算公

13、式A7 判定標(biāo)準(zhǔn)A7. 1 3、4、5組菌數(shù)相似，其誤差率W 1Q%。A7. 2 6組無菌生長。A7. 3 2組菌數(shù)明顯少于 3、4、5組。A7. 4 1組不長菌或明顯少于 2組。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的中和劑表明可消除消毒劑對指示菌的作用，中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對指示菌無毒害，判定為該消毒劑的中和劑。A8消毒試驗(yàn)用中和劑濃度的選擇按A5. 4步驟進(jìn)行，按 A7. 17. 4的標(biāo)準(zhǔn)判定。附錄B消毒劑定性消毒試驗(yàn)(補(bǔ)充件)B1內(nèi)容提要定性消毒試驗(yàn)是測定受消毒因子作用后的樣本有無細(xì)菌生長的試驗(yàn)方法。用于對消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細(xì)菌效果的初步評價。B2 培養(yǎng)基與試劑B2 . 1 普通肉湯培養(yǎng)

14、基B2. 1. 1成分：蛋白月東10. 00g氯化鈉5. 00g肉浸液1000. 00mLB2. 1. 2制法：取蛋白月東、氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH至弱堿性，煮 沸、濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7. 27. 4,壓力蒸汽滅菌備用。B2 . 2 試劑82. 2. 1 稀釋液：含 1% 蛋白月東的 0. 03mol/L PBS ( pH7 . 2 7. 4)。B2 . 2 . 2 滅菌蒸儲水。82. 2. 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄 A選擇。B3 器材83. 1 滅菌刻度吸管（1. 0, 5. 0, 10. 0mL）。83. 2 滅菌試管。84. . 3 滅菌三角燒瓶。85. 4酒精燈。

15、86. 5 恒溫水浴箱。87. 6恒溫培養(yǎng)箱。B4 試驗(yàn)方法84. 1將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液配制成含菌量為5X1055X106cfu/mL 的菌懸液。84. 2 將滅菌試管10支排列于試管架上，標(biāo)記管號。84. 3 每個試管加滅菌蒸儲水 2. 5mL ,放20i2C水浴中。84. 4于第1管內(nèi)加適當(dāng)濃度消毒液 2. 5mL,混勻后取2. 5mL移入第2管，再次 混勻，從第2管中取2. 5mL移入第3管，以此類推至第 9管，混勻后棄去2. 5mL ,第 10管中不加消毒液作對照。84. 5加菌懸液2. 5mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時間，使菌藥混合液中含菌 量均為 105106cfu

16、/mL 。84. 6 各管分別于加菌后 4個不同間隔時間，取出 0. 5mL ,加入4. 5mL中和劑內(nèi)， 中和10min后，取出0. 5mL加入4. 5mL營養(yǎng)肉湯管內(nèi)。84. 7將接種細(xì)菌的肉湯管放 37c培養(yǎng)48h,觀察初步結(jié)果，無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)至 第7天。88. 8 試驗(yàn)重復(fù)5次。B5 結(jié)果判定85. 1若肉湯管混濁，則表示有菌生長，記為陽性，以（+）表示。85. 2若培養(yǎng)至第7天，肉湯管澄清，則表示無菌生長，記為陰性，以（一）表示。B5. 3對難以判定的肉湯管，取 0. 1mL接種于營養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌L棒涂勻，放37c培養(yǎng)48h,觀察菌落形態(tài)；并做涂片染色鏡檢，判斷是否有指示菌生

17、長。有指示菌生長 記為陽性。85. 4 5次試驗(yàn)，均無指示菌生長表示達(dá)到滅菌。附錄C消毒劑定量消毒試驗(yàn)(補(bǔ)充件)C1內(nèi)容提要定量消毒試驗(yàn)是測定受消毒因子作用后，樣本殘存微生物數(shù)量的試驗(yàn)方法，以殺滅率表示結(jié)果。用于對消毒劑殺滅效果的評價。C2培養(yǎng)基與試劑C2. 1普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按本標(biāo)準(zhǔn)A2. 1制備。C2 . 2 試齊IJC2. 2. 1 稀釋液：含 1%蛋白月東的 0. 03mol/L PBS (pH7 . 27. 4)。C2. 2. 2 滅菌蒸儲水。C2. 2. 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄 A選擇。C2. 2. 4 0. 03mol/L PBS (pH7 . 27. 4)。C2. 2.

18、5 洗脫液：含中和劑、1%蛋白月東、0. 1%吐溫80的PBS。C3器材C3. 1 滅菌刻度吸管(1. 0, 5. 0, 10. 0mL)。C3. 2 滅菌試管。C3. 3 滅菌三角燒瓶。C3. 4 滅菌平皿(直徑為 9cm)。C3. 5恒溫水浴箱。C3. 6恒溫培養(yǎng)箱。C3. 7酒精燈。C3. 8菌落計(jì)數(shù)器。C3. 9微量進(jìn)樣器。C3. 10載體：根據(jù)需要及試驗(yàn)?zāi)康倪x用經(jīng)脫脂處理0. 5cm X1. 0cm大小的布片、紙片、玻片、橡膠片、塑料片、不銹鋼片或鋁片。C4試驗(yàn)方法C4. 1定量懸液試驗(yàn)C4. 1. 1將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液稀釋成含菌量為5X10卜5X106cfu/mL的菌懸

19、液。C4. 1. 2將消毒劑用滅菌蒸儲水稀釋成3個不同濃度，各吸取 4. 5mL分別加入三個試管內(nèi)，放20 i2 C水浴中。C4. 1. 3待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，在三個試管中分別加入0. 5mL菌懸液（含菌量為 5X10卜5X106cfu/mL ）,混勻并開始記時。C4. 1. 4 分別于4個不同間隔時間，各取 0. 5mL菌液混合液移入 4. 5mL中和劑中 混勻。C4. 1. 5中和10min,作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。C4. 1. 6陽性對照以洗脫液代替消毒液，同時按 C4. 1. 2C4. 1. 5進(jìn)行。C4. 1. 7按不同稀釋度推算出每個樣本存活菌數(shù)（ cfu/mL ）

20、，按式（C1）計(jì)算殺滅C4. 1. 8試驗(yàn)重復(fù)5次。C4. 2載體定量試驗(yàn)C4. 2. 1將滅菌載體平放于滅菌平皿內(nèi)，每個載體滴注定量菌液（載體回收菌量達(dá)5X1055X106cfu/片），涂勻，放37c培養(yǎng)箱待干。應(yīng)用市售染菌載體時，回收菌量亦應(yīng)達(dá)5X10卜 5X106cfu/片）。C4. 2. 2用滅菌蒸儲水將消毒劑稀釋成3個不同濃度，各吸取 5mL分別加入三個試管內(nèi)，放20i2C水浴中。C4. 2. 3待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，加入染菌載體，作用至規(guī)定時間，將染菌載體移入含中和劑的 5mL洗脫液試管內(nèi)，中和 10min,振打80次，適當(dāng)稀釋，接種 兩個平板。放37 c培養(yǎng)2448h

21、,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。C4. 2. 4陽性對照，以洗脫液代替消毒液按C4. 2. 2C4. 2. 3進(jìn)行。C5結(jié)果判定C5. 1 5次試驗(yàn)的殺滅率均99. 9%判為消毒合格。C5. 2對枯草桿菌黑色變種芽胞 5次試驗(yàn)均全部殺滅判為消毒合格。附錄D有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)（補(bǔ)充件）D1內(nèi)容提要有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)是測定消毒劑對有機(jī)物保護(hù)條件下的微生物的殺滅作用，以殺滅率表示之，其結(jié)果與該消毒劑定量消毒試驗(yàn)相比較，用于評價有機(jī)物對消毒劑的殺菌能力的影響。D2培養(yǎng)基與試劑D2. 1普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按本標(biāo)準(zhǔn) A2. 1制備。D2. 2 試劑：D2. 2. 1 稀釋液：同 C2. 2. 1。D2. 2. 2 滅菌蒸儲水。

22、D2. 2. 3 中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄 A進(jìn)行選擇。D2. 2. 4 0. 03mol/L 磷酸緩沖液（pH7 . 2 7. 4）（簡稱 PBS）。D2. 2. 5 洗脫液：含1%蛋白月東，0. 1%吐溫80的生理鹽水。D2. 2. 6小牛血清加入菌懸液中，使其最終濃度為10%。D3 器材同本標(biāo)準(zhǔn)C3。D4試驗(yàn)方法D4. 1實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用稀釋液稀釋，加入小牛血清，使其最終含 血清量為10%,含菌數(shù)為5X10卜5X106cfu/mL ,以此作為試驗(yàn)菌懸液。D4. 2 以下步驟同本標(biāo)準(zhǔn) C4. 1. 2C4. 1. 8。D5結(jié)果判定D5. 1 5次試驗(yàn)的殺滅率均大于 99. 9%

23、所需最低濃度和最短時間，判為該消毒劑在 有機(jī)物存在下，可以達(dá)到消毒的有效濃度和時間。D5. 2此有效濃度和時間與定量消毒試驗(yàn)達(dá)到消毒的有效濃度和時間相同或相近，判 為有機(jī)物對消毒劑殺菌作用無明顯影響。達(dá)到消毒最低有效濃度增加一倍以上或最短作用時間延長一倍以上者可視為有明顯影響。附錄E 乙型肝炎表面抗原破壞試驗(yàn) （補(bǔ)充件）E1 內(nèi)容提要乙型肝炎表面抗原（HBsAg ）破壞試驗(yàn)是以HBsAg的抗原活性為間接標(biāo)志，評價消毒 因子對乙型肝炎病毒（HBV）滅活能力的試驗(yàn)方法。適用于評價化學(xué)消毒劑、紫外線對HBV的消毒效果。E2 試劑E2 . 1 小牛血清（56 C, 30min滅活）。E2 . 2 0.

24、 01mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS , pH7 . 27. 4）。E2 . 3 純化 HBsAg （1. 0mg/mL ）。E2 . 4固相放射免疫分析法試劑，要求特異性100%,精密性CVW15%,靈敏度V1. 0ng/mL ,線性 r0. 95。E2 . 5酶聯(lián)免疫吸附法試劑，要求特異性100%,精密性CVW15%,靈敏度 3. 2ng/mL ,線性 r 0. 95。E3 器材E3. 1吸量器：包括試管、吸管（0. 1, 1. 0, 5. 0和10. 0mL4種）和微量進(jìn)樣器 （100. 0L）。E3 . 2 載體（直徑1. 5cm大小的不銹鋼片）。E3 . 3免疫計(jì)數(shù)儀。E3 . 4

25、酶聯(lián)免疫測定儀。E 3. 5 低溫冰箱（一30一70C）。E4 HBsAg懸液的配制E4. 1 取 0. 01mol/LPBS （pH7 . 2 7. 4） 9. 4mL 加入小牛血清 0. 6mL,配成含 6%小牛血清的懸液。再取該 PBS 9 . 0mL ,加入濃度為1. 0mg/mL 的純化HBsAg懸液 1. 0mL,使成含5. 4%小牛血清，HBsAg濃度為100d g/mL 的試驗(yàn)用 HBsAg懸液。E4. 2 將試驗(yàn)用HBsAg懸液1. 0mL盛裝入容量為1. 5mL的玻璃安甑中，封口， 放30 C70c冰箱保存?zhèn)溆?。保存期為三個月。E5 HBsAg的檢測方法E5 . 1固相放射

26、免疫分析法（SPRIA）。E5 . 2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA ）。E6 中和劑選擇在測定消毒劑對 HBsAg的破壞效果時，應(yīng)先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進(jìn)行 破壞試驗(yàn)。所用中和劑：a.應(yīng)能有效而及時中止消毒劑的殘余作用；b.中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對HBsAg的抗原活性沒有影響，亦不影響檢測方法對HBsAg檢出的靈敏度。E6. 1將消毒劑用無菌蒸儲水配成不同濃度，取 1. 2mL消毒液與0. 3mLHBsAg 懸 液混勻，置202C水浴條件下，作用10min,測定該消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原 性的最低有效濃度。E6. 2取消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性

27、的最低有效濃度與待選中和劑進(jìn)行 試驗(yàn)，試驗(yàn)可按下列組別進(jìn)行：a .消毒液0. 9mL+HBsAg 懸液0. 1mL; b.消毒液0. 4mL+HBsAg 懸液0. 1mL作用10min后+含20%小牛血清的中和劑 0. 5mL ; c.先取 含20%小牛血清的中和劑 1mL與消毒液1mL,混勻，作用1030min ,制成中和產(chǎn)物溶液， 再行試驗(yàn)。中和產(chǎn)物溶液 0. 9mL+HBsAg 懸液0. 1mL; d.含10%小牛血清的PBS0 .9mL+HBsAg 懸液 0.1mL；e.含 10%小牛血清的中和劑 0.9mL+HBsAg 懸液 0.1mL; f.中和產(chǎn)物溶液0. 9mL+PBs0 ,

28、1mL。經(jīng)檢測只有在 c、d、e組HBsAg活性的測定值相 近（相差10%以下）并都明顯多于 b組，a組HBsAg活性不能檢出或檢出活性明顯少于 b 組，f組陰性對照正常，方可證明所選中和劑及其使用劑量是適宜的。E6. 3 進(jìn)行消毒試驗(yàn)時，依據(jù)消毒劑與中和劑等當(dāng)量中和原則，適當(dāng)調(diào)整中和劑的用 量。再次按E6 . 2步驟測定中和效果后，方可進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。E7 破壞試驗(yàn)方法E7. 1 懸液法懸液法指將HBsAg在懸液中與消毒劑相互作用并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗(yàn)方 法。E7. 1. 1 HBsAg懸液的濃度為檢測試劑靈敏度的104倍。如檢測試劑的靈敏度為1ng/mL , HBsAg 的濃度

29、應(yīng)為 10科 g/mL 。E7.1.2 取含5%小牛血清的 PBS2.7mL加到含0.3mL濃度為100d g/mL 的HBsAg 懸液中，混勻。E7. 1. 3取小牛血清20mL加到含80mL滅菌的中和劑溶液中，混勻。E7. 1. 4 破壞試驗(yàn)：將預(yù)定消毒液濃度 1. 25倍的消毒液與 HBsAg懸液按4 ： 1比例 混合，混合液容量不少于1. 5mL。然后置202C水浴條件下，作用達(dá)規(guī)定時間，即刻取0.3mL 混合液與等體積含 20%小牛血清的中和劑混勻，作用1g30min,取樣測定殘留 HBsAg的活性，每一樣本平行測定 2份，每份0. 1mL,取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑觀 察

30、3個濃度，每一濃度觀察 4個作用時間。試驗(yàn)重復(fù) 5次。E7. 1. 5陽性對照：取含20%小牛血清的中和劑 1mL,加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的 試管中混勻，作用1g30min,制成中和產(chǎn)物溶液。取該中和產(chǎn)物溶液 0. 9mL加入試驗(yàn)濃 度的HBsAg懸液0. 1mL取樣檢測，每一樣本檢測 3份，每份0. 1mL,取其平均值為陽性對照值。E7. 1. 6陰性對照：取含 20%小牛血清的中和劑 1mL加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的 試管中，混勻，作用 1030min,取樣檢測，每一樣本檢測 3份，每份0. 1mL取其平均值 為陰性對照值。應(yīng)注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。E7. 2 載體法載體

31、法指將在載體表面的 HBsAg與消毒因子相互作用，并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的 試驗(yàn)方法。E7. 2. 1 HBsAg載體的制備E7. 2. 1. 1載體為直徑1. 5cm大小的不銹鋼片，經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸 汽滅菌備用。E7 . 2. 1. 2 HBsAg懸液的濃度為檢測方法靈敏度的5X104倍。如靈敏度為1ng/mL ,HBsAg的濃度應(yīng)為 50 g/mL 。E7. 2. 1. 3 HBsAg的污染方法為滴染法。滴染時，將滅菌載體平鋪于無菌平皿內(nèi)， 用微量進(jìn)樣器吸取 HBsAg懸液，滴注于載體中央，每個載體20 L。然后用L型白金絲將懸液涂布均勻，放 37 c培養(yǎng)箱4060min ,待懸液干燥后進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。E7. 2. 2 抗原性破壞試驗(yàn)取污染HBsAg的載體，平放于無菌平皿內(nèi)，