樹突狀細(xì)胞融合瘤苗體內(nèi)外誘導(dǎo)特異性抗白血病免疫的實(shí)驗(yàn)研究

1、樹突狀細(xì)胞融合瘤苗體內(nèi)外誘導(dǎo)特異性抗白血病免疫的實(shí)驗(yàn)研究    作者：于津浦，李牧，葛薇，馬雙，尤勝國    【摘要】 本研究觀察615鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（DC）與白血病細(xì)胞L615融合瘤苗L615/DC體內(nèi)外誘導(dǎo)特異性抗白血病免疫的能力。分別制備615鼠骨髓來源DC，用PEG融合法將DC與照射滅活的L615制備L615/DC融合瘤苗并免疫動物，用MTT法和LDH法測定L615/DC融合瘤苗免疫鼠脾細(xì)胞體外MLR反應(yīng)和對L615特異性殺傷活性，同時通過免疫治療實(shí)驗(yàn)檢測L615/DC融合瘤苗的體內(nèi)抗白血病作用。結(jié)果

2、表明：研究獲得了具有特征形態(tài)的樹突狀細(xì)胞，MLR反應(yīng)表現(xiàn)出強(qiáng)大的異基因免疫刺激功能，當(dāng)L615/DC融合瘤苗免疫鼠的脾細(xì)胞再次接觸L615抗原時表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增殖活性；LDH實(shí)驗(yàn)顯示，融合瘤苗組、共培瘤苗組和滅活L615組均可在體外誘導(dǎo)擴(kuò)增出L615特異性CTL，但融合瘤苗組的CTL在不同效靶比、不同孵育時間的特異性殺傷活性均明顯高于另兩組 （P<0.01）。體內(nèi)免疫治療實(shí)驗(yàn)中L615/DC融合瘤苗治療組平均壽命為25.7±1天，有1/4小鼠長期存活，而對照組全部死亡，平均壽命17.5±1天。2個月后對治療組存活鼠用致死劑量 L615攻擊不發(fā)病。結(jié)論： L615/DC融

3、合瘤苗可誘導(dǎo)強(qiáng)大的特異性抗L615免疫，它不僅在體外能特異性識別并殺傷L615細(xì)胞，還可有效抑制荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的生長，延長存活時間，并產(chǎn)生免疫記憶，抵抗腫瘤的二次攻擊。L615/DC融合瘤苗為腫瘤免疫治療提供了新的手段。    【關(guān)鍵詞】 樹突狀細(xì)胞 Anti-leukemia Immunity Induced by Dendritic Cells Fused with L615 Tumor Cells Abstract This study was aimed to investigate the specific anti-L615 leukemia

4、 cell immunity induced by L615/DC fused cell vaccine in vivo and in vitro. BM-derived DCs were generated from bone marrow of 615 mice by culturing for 9-10 days in culture medium supplemented with GM-CSF and IL-4.Irradiated L615 tumor cells were fused with DC by using PEG to form fused cell vaccine，

5、with which 615 mice were immunized.After immunization，the specific proliferation ability and cytotoxicity against L615 leukemia cells in vitro were examined by MTT and LDH methods.Anti-leukemia effect of fused cell vaccine in vivo was studied by observing the immunotherapy effects on L615 tumor-bear

6、ing mice.The results showed that fully mature and functional bone marrow-derived DC were obtained.L615/ DC fused cell vaccine could elicit potent specific proliferation response of spleen T cells from immunized mice when contacting with the same antigen at the second time，and could also elicit the e

7、ffective cytotoxic activity against L615 leukemia cells in vitro，which were significantly different from other groups.In vivo the average survival time of the tumor-bearing mice received immunotherapy with L615/ DC fused cell vaccine was 25.7±1 days，and one fourth of treated tumor-bearing mice

8、survived for long time，but the mice of control group died all，their average of survival time was 17.5±1 days.The immunized mice survived with no evidence of recurrence when exposed to the second attack of lethal dose of living L615 cells 2 months later.It is concluded that L615/ DC fused cell v

9、accine can improve the immunogenecity of L615 and induce effectively the specific anti-leukemia immunity against L615 leukemia cells to eliminate the residual leukemia cells，prolong the survival time and induce the immune memory to avoid the relapse.Thus，the fused cell vaccine may be an attractive s

10、trategy for malignance immunotherapy. Key words dendritic cell; tumor vaccine; acute leukemia; antitumor immunity    腫瘤細(xì)胞存在嚴(yán)重的抗原呈遞障礙，但提高其表面MHC類分子和多種協(xié)同刺激分子的表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤抗原信號的傳遞。融合瘤苗是一種具有較高臨床應(yīng)用價值的腫瘤疫苗，通過將腫瘤細(xì)胞與專職抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的融合細(xì)胞同時表達(dá)腫瘤抗原肽-MHC復(fù)合物和多種協(xié)同刺激分子，可誘導(dǎo)出有效的特異性抗瘤免疫。與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)方

11、法簡便易行，且由于是多基因轉(zhuǎn)移，可避免因單基因轉(zhuǎn)移引起的腫瘤缺陷株或變異株的免疫逃逸現(xiàn)象。    成熟的樹突狀細(xì)胞（DC）表面表達(dá)大量的MHC-肽復(fù)合物1和多種協(xié)同刺激分子2，并分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-123，是功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞。近年來由于DC制備方法的迅速發(fā)展和逐漸成熟，使獲得大量符合實(shí)驗(yàn)需要的成熟DC成為可能，因此腫瘤細(xì)胞和DC的融合瘤苗成為雜交瘤技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域中的又一個新突破。    迄今為止，細(xì)胞融合瘤苗的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途窒抻趯?shí)體瘤范圍，對于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究未見相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)即以病毒誘發(fā)的純系6

12、15小鼠急性T細(xì)胞白血病 L615細(xì)胞為腫瘤模型，利用骨髓來源的DC與照射滅活的L615細(xì)胞進(jìn)行融合制備出L615/DC融合瘤苗，通過檢測融合瘤苗在體內(nèi)外誘導(dǎo)特異性抗白血病T細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力，來探討融合瘤苗作為一種新型的白血病免疫治療途徑的可行性，并為臨床試驗(yàn)提供動物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法 動物與細(xì)胞株 純系615（H-2K）小鼠、 BALB/c（H-2b）小鼠，雌性，體重18-22 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所動物中心，并維持清潔級飼養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)。615小鼠T細(xì)胞白血病細(xì)胞株L615和 L7212由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供，由血液學(xué)研究所血液免疫室常規(guī)傳代培養(yǎng)。兩者具有相同的遺傳

13、背景但攜帶不同的腫瘤抗原。培養(yǎng)條件： 5% CO2，37，RPMI 1640培養(yǎng)液，內(nèi)含10% FCS，100 U/ml青霉素，100 g/ml鏈霉素，5×10-5mol/L 2-巰基乙醇，10 g/ml（2 mmol/L）谷氨酰胺。骨髓來源樹突狀細(xì)胞的制備 取615鼠股骨和脛骨，沖洗并收集骨髓組織制備單細(xì)胞懸液，去紅細(xì)胞后用含20 ng/ml GM-CSF和20 ng/ml IL-4的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)8天，收集懸浮細(xì)胞和輕微貼壁細(xì)胞，補(bǔ)加1 g/ml LPS后繼續(xù)培養(yǎng)1-2天至收獲細(xì)胞。    樹突狀細(xì)胞的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定 利用倒

14、置光學(xué)顯微鏡觀察活細(xì)胞比例和細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞表型鑒定 調(diào)節(jié)骨髓來源DC為 5×105/管，加入FITC或PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD11c、Thy1.2、B220、CD80、CD86、CD40、CD54、I-A等McAb 1 g，4避光染色45分鐘，1%多聚甲醛固定后進(jìn)行FACS測定。 刺激異基因T細(xì)胞增殖活性    將骨髓來源DC作為刺激細(xì)胞S1，脾臟單核細(xì)胞（Mo）作為S2，調(diào)整濃度為5×105/ml、2×105/ml和1×105/ml。制備615和BALB/c小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，經(jīng)尼龍毛柱分離T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為

15、2×106/ml，分別作為反應(yīng)細(xì)胞R1 和R2。在96孔內(nèi)將S1/S2和R1/ R2按不同組合、不同比例混合，37，5% CO2，培養(yǎng)5天后用MTT法測定OD值并計(jì)算刺激指數(shù)。 公式為：刺激指數(shù)（SI）=實(shí)驗(yàn)組OD570值/反應(yīng)細(xì)胞對照組OD570值 刺激細(xì)胞對照組OD570值）。 融合瘤苗的制備 收集生長旺盛的L615白血病細(xì)胞，用137Cs照射100 Gy滅活，與此同時收獲成熟骨髓來源的DC，按3 1的比例混合，在37水浴中加入1 ml 50% PEG溶液進(jìn)行融合，融合細(xì)胞經(jīng)過洗滌之后孵育過夜，次日接種。共培養(yǎng)瘤苗的制備過程只是混合，而不加入PEG。  

16、60; 融合瘤苗的體外混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 正常615純系小鼠隨機(jī)分為4組：融合瘤苗組、共培瘤苗組、瘤細(xì)胞對照組和PBS對照組，分別用L615/DC融合細(xì)胞、滅活L615與DC混合細(xì)胞、滅活L615細(xì)胞和空白PBS對615小鼠進(jìn)行接種。接種部位為雙側(cè)腹股溝皮下，劑量為0.5毫升/只。在免疫后第7天，分別取4組免疫鼠的脾細(xì)胞作為R1-4，以不同濃度（5×105/ml，2×105/ml和1×105/ml）的照射滅活的L615細(xì)胞作為S1-3，在96孔中將R1-4和S1-3混合，37，5% CO2條件下培養(yǎng)5天。用MTT法計(jì)算SI。 融合瘤苗的體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)

17、體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞    正常615小鼠隨機(jī)分成3組：融合瘤苗組、共培瘤苗組和瘤細(xì)胞對照組，分別用L615/DC融合細(xì)胞、 滅活L615與DC混合細(xì)胞和滅活L615細(xì)胞進(jìn)行免疫，免疫部位和劑量同上，共進(jìn)行2次，間隔7天。在第2次免疫后第7天，每組取脾制備單細(xì)胞懸液分別作為R1-3，與照射滅活的L615混合，在含100 U/ml IL-2的完全培基培養(yǎng)5天，收集活細(xì)胞作為L615特異性CTL細(xì)胞。 測定體外細(xì)胞毒活性 取不同誘導(dǎo)條件的CTL作為E1-3，調(diào)整濃度為8×106/ml和4×106/ml。以L615和L7212為靶細(xì)胞，按

18、E/T比為40 1和20 1，將3種效應(yīng)細(xì)胞和2種靶細(xì)胞依不同組合混合加入96孔板內(nèi)，100 l/well，37，5% CO2條件下分別培養(yǎng)4小時和18小時，用LDH法計(jì)算細(xì)胞殺傷率。 融合瘤苗的體內(nèi)免疫治療實(shí)驗(yàn) 正常615鼠隨機(jī)分成2組：融合治療組和PBS對照組，每組4只動物。實(shí)驗(yàn)開始時給每只鼠腹腔接種生長旺盛的活L615白血病細(xì)胞2×104/只以建立荷瘤鼠模型，在第2天，第4天和第6天分別腹腔接種L615/DC融合細(xì)胞和空白PBS，0.5毫升/只，然后每天觀察兩組荷瘤鼠的發(fā)病情況，記錄存活時間及生存率。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及最小顯著差法(

19、LSD)，結(jié)果以±SD來表示，設(shè)定P<0.05時有顯著性差異。 結(jié) 果 樹突狀細(xì)胞的鑒定 形態(tài)學(xué)結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察骨髓培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞，胞體大，外形不規(guī)則，胞膜向外伸出毛刺狀或樹枝狀突起，胞漿豐富，有的細(xì)胞呈毛玻璃樣外觀。經(jīng)培養(yǎng)的骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，在培養(yǎng)早期有明顯的貼壁集簇生長，至培養(yǎng)中期逐漸脫離板壁而懸浮，細(xì)胞散開，成熟時胞體極大，胞膜突起明顯，面紗樣細(xì)胞多見。 細(xì)胞表型直接熒光染色結(jié)果 骨髓來源的樹突狀細(xì)胞經(jīng)FACS檢測，發(fā)現(xiàn)CD11c ，CD86 ，CD40 ，CD54 ，I-Ab 細(xì)胞超過85%（圖1）。 刺激異基因T細(xì)胞增殖活性 實(shí)驗(yàn)顯示，615鼠來源的樹突狀

20、細(xì)胞可以有效地刺激異基因BALB/c鼠的T淋巴細(xì)胞增殖，而對于同基因的T淋巴細(xì)胞則無作用，與單核細(xì)胞相比具有顯著性差異（P<0.05），且增殖強(qiáng)度與樹突狀細(xì)胞呈量效相關(guān)趨勢（圖2）。 融合瘤苗體外混合淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) L615/DC融合瘤苗免疫鼠的脾臟T細(xì)胞在體外再次接觸相同L615抗原時表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增殖活性，與其他3組相比具有顯著性差異（P<0.05），且增殖強(qiáng)度與L615呈量效相關(guān)趨勢（圖3）。 融合瘤苗體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 3組CTL均具有L615特異性殺傷活性，僅針對L615，對L7212無殺傷作用（圖4）。但與其他2組相比，來自L615/DC融合瘤苗免疫組的CTL，在不同效靶比

21、（E/T=401或201）的殺傷活性均顯著增強(qiáng)（P<0.01）（圖5）。 融合瘤苗體內(nèi)免疫治療實(shí)驗(yàn) 建立荷瘤小鼠模型并隨機(jī)分為2組，治療組腹腔接種L615/DC融合瘤苗，對照組注射PBS。結(jié)果顯示治療組較對照組平均存活時間延長（治療組為25.7 1天，對照組為17.5 1天），生存率提高，1/4小鼠達(dá)到長期存活（圖6）。 討論 大量研究指出，腫瘤免疫主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫過程，T細(xì)胞對腫瘤抗原的識別需要雙信號系統(tǒng)。雖然腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生內(nèi)源性腫瘤抗原，但缺失協(xié)同刺激分子提供的第二信號，因此極易誘導(dǎo)免疫耐受和腫瘤逃逸。以L615細(xì)胞為例，研究已證明 L615細(xì)胞表面存在某種尚未明確的腫瘤

22、抗原和一定的MHC-I類分子，但因缺乏B7分子，故不能產(chǎn)生有效的特異性抗瘤免疫，導(dǎo)致白血病的發(fā)展4。通過基因轉(zhuǎn)染方法提高腫瘤細(xì)胞表面各種協(xié)同刺激分子的表達(dá)是目前常用的提高腫瘤免疫原性，制備腫瘤疫苗的常用方法，但方法繁瑣，轉(zhuǎn)染率低，不易在臨床治療中推廣，而通過細(xì)胞融合方法將兩者合二為一，不僅滿足腫瘤疫苗的構(gòu)建要求，而且符合臨床應(yīng)用安全快捷的需要，尤其適用于腫瘤抗原不明確的各種惡性腫瘤5。    615鼠骨髓細(xì)胞在GM-CSF和IL-4共同存在的條件下培養(yǎng)7-8天，并用LPS誘導(dǎo)1-2天后的DC細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測顯示DC細(xì)胞膜標(biāo)記CD11c染色率高達(dá)90%，

23、而各項(xiàng)DC 成熟指標(biāo)（包括MHC-II，B7-1，B7-2，ICAM-1和CD40）均顯著提高，達(dá)到85%-90%。骨髓來源的DC在體外刺激同種異基因（BALB/c）小鼠T細(xì)胞時，可觀察到強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)中，在DCL615融合比為13時，利用50% PEG將骨髓來源的DC與L615白血病細(xì)胞進(jìn)行融合，融合后1天通過光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，融合率可達(dá)到20%-30%，與文獻(xiàn)報道相一致6。有研究指出，DC瘤苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力與使用的DC的成熟程度成正相關(guān)7，因此本實(shí)驗(yàn)中制備的L615/DC融合瘤苗不僅具有L615的腫瘤抗原，而且高表達(dá)MHC-I/II類分子和CD86，CD40、ICAM-1等

24、協(xié)同刺激分子，具備較強(qiáng)的免疫刺激功能，可顯著改善L615的抗原呈遞缺陷。    實(shí)驗(yàn)中我們先將L615細(xì)胞照射滅活（100 Gy）再與活DC融合，這樣制備出的融合細(xì)胞既保證了DC的生理活性，又保證了瘤苗的安全性；并且由于照射滅活的L615細(xì)胞具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，所以不影響與DC的融合。用L615/DC融合瘤苗免疫615鼠，1次即可誘導(dǎo)出針對L615細(xì)胞的特異性T細(xì)胞，后者在體外再次接觸相同抗原時即產(chǎn)生強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)，而在滅活L615細(xì)胞與DC混合細(xì)胞免疫鼠中則未觀察到上述現(xiàn)象。L615/DC融合瘤苗體外可以誘導(dǎo)出對L615細(xì)胞的特異性CTL，在不同時段

25、（4小時或18小時）和不同效靶比（401或201）的殺傷活性均顯著高于共培養(yǎng)瘤苗組和滅活L615細(xì)胞免疫組。    由于L615白血病是一種起病急、進(jìn)展快、病情兇險的惡性全身性腫瘤，所以一般在化療藥物評價中，生存時間延長3天即表示有效。我們在評價L615/DC融合瘤苗的體內(nèi)療效時沿用了該標(biāo)準(zhǔn)。我們建立L615的荷瘤鼠模型，觀察到對照組的平均存活時間為17.5天，而經(jīng)L615/DC融合瘤苗免疫治療的實(shí)驗(yàn)組的平均存活時間較對照組延長8天，其中有2/4存活時間超過35天，有1/4獲得長期存活，同時發(fā)現(xiàn)獲得長期存活的小鼠在2個月后再次接受致死劑量L615細(xì)胞攻擊

26、時不發(fā)病。雖然由于樣本數(shù)太少而無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但本實(shí)驗(yàn)仍提示L615/DC融合瘤苗對荷瘤鼠具有免疫治療作用，可以抑制腫瘤的生長，甚至清除殘存腫瘤細(xì)胞，并且L615/DC融合瘤苗誘導(dǎo)出的宿主特異性抗腫瘤免疫具記憶性，這對于防止腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有重要價值。    【參考文獻(xiàn)】 1Inaba K，Pack M，Inaba M，et al.High levels of a major histocompatibility complex II-self peptide complex on dendritic cells from the T cell areas of lymph nodes. J Exp M