型重組腺相關(guān)病毒(rAAV6)高效并優(yōu)先感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的體內(nèi)外研究

1、.六型重組腺相關(guān)病毒（rAAV6）高效并優(yōu)先感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的體內(nèi)外研究摘要：        腺相關(guān)病毒載體是越來(lái)越受歡迎的載體工具，它可將基因輸送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有非致病性、免疫原性低、可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞的特點(diǎn)。它的一個(gè)局限性是對(duì)神經(jīng)類細(xì)胞的感染有取向性，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率很低。為了克服這個(gè)局限，先前的研究中利用星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性的啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建載體包裝病毒，以及用不同血清型的病毒來(lái)感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，但是各種研究中的感染效率并不一致。在本實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了7種商業(yè)化的腺相關(guān)病毒的血清型，血清

2、型1、2、5、6、7、8、9（腺相關(guān)病毒由維真生物提供），通過(guò)觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)來(lái)測(cè)試各種血清型病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力。在細(xì)胞培養(yǎng)中，rAAV6表現(xiàn)出穩(wěn)定的高效的感染效率，而rAAV2只有一些批次的病毒對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有感染性。為了證明我們所用的病毒活性沒(méi)有問(wèn)題，我們將所用病毒感染公認(rèn)的易感染細(xì)胞ARPE-19細(xì)胞并都表現(xiàn)出很高的感染性。基于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選用rAAV6和rAAV2進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同樣條件下感染星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，感染3個(gè)星期后，對(duì)病毒表達(dá)蛋白GFP、神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白NeuN以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白GFAP進(jìn)行免疫染色，我們發(fā)現(xiàn)rAAV6

3、對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有很高的感染率（90%以上細(xì)胞被感染），但是對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的感染率很低（約10%感染率），相反地，rAAV2對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有高感染率（約65%），但是不易感染星形膠質(zhì)細(xì)胞（約20%）?？傊?，我們的研究表明rAAV6能夠被用作對(duì)體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控（過(guò)表達(dá)或敲低）的工具。 前言       病毒載體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛用于基因遞送和目的基因的表達(dá)。其中，腺相關(guān)病毒（AAV）已越來(lái)越受歡迎，它具有以下優(yōu)勢(shì)：非致病性，低免疫性，能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，并能產(chǎn)生持久的基因表達(dá)。 AAV載體在基礎(chǔ)研究中的成功使其應(yīng)

4、用于臨床實(shí)踐中，包括在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用。在過(guò)去的十年來(lái)，重組AAV已經(jīng)應(yīng)用于腦組織，脊髓和視網(wǎng)膜的臨床試驗(yàn)中。rAAV在基因治療中的安全性也越來(lái)越有吸引力，那些在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的實(shí)驗(yàn)，以及幾種人類單基因疾病的表型校正實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了rAAV應(yīng)用的安全性，這也進(jìn)一步提高了rAAVs在基礎(chǔ)研究中的利用價(jià)值。      腺相關(guān)病毒(AAV)是一種無(wú)包膜的單鏈 DNA 病毒，是細(xì)小病毒家族的一員，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能進(jìn)行自我復(fù)制。簡(jiǎn)單的AAV基因組有兩個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)（ITR），其中間有約4.7kb的線性單鏈DNA的開(kāi)

5、放閱讀框。 rep部分基因組負(fù)責(zé)編碼病毒復(fù)制和基因組特異性位點(diǎn)整合的四種蛋白質(zhì)；另外的cap開(kāi)放閱讀框負(fù)責(zé)生成三種不同的衣殼蛋白。在應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中的重組AAVs，rep和cap基因被刪除，取而代之的是目的基因序列或shRNA序列，抗生素篩選標(biāo)記等基因序列。因此，重組包裝AAV需要額外的編碼rep基因的質(zhì)粒（通常衍生自AAV2）和編碼cap基因的質(zhì)粒，以及提供腺病毒輔助基因的輔助質(zhì)粒，cap基因可來(lái)自于各種血清型或進(jìn)行過(guò)基因改造的衣殼蛋白基因）。      AAV衣殼蛋白的不同決定了它們?cè)谝罁?jù)細(xì)胞類型和組織嗜性方面的血清型之間的差異。 原型AA

6、V2與硫酸乙酰肝素蛋白多糖結(jié)合從而接近靶細(xì)胞，并與靶細(xì)胞的共同受體相互作用，例如整合素V5，V1，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和層粘連蛋白。有助于其他血清型AAV感染的細(xì)胞表面受體的研究的較少，普遍認(rèn)可的有唾液酸或半乳糖的蛋白多糖。最近的一篇文章發(fā)現(xiàn)了孤兒跨膜蛋白KIAA0319L可作為幾種常見(jiàn)的AAV血清型的受體，包括AAV6，這將有助于我們進(jìn)一步理解細(xì)胞機(jī)制（Pillay et al.,2016）。      星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、功能最復(fù)雜的細(xì)胞，它對(duì)正常大腦功能和許多神經(jīng)障礙方面有非常重要的作用。隨著人們對(duì)正常和病理細(xì)胞研究興趣的增長(zhǎng)，對(duì)能夠有效靶向星形

7、膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體的需求不斷增長(zhǎng)。但是，過(guò)去大多數(shù)的研究都集中在rAAV對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的感染上。最常用的血清型rAAV2，幾乎對(duì)所有嚙齒動(dòng)物和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的神經(jīng)元細(xì)胞都有應(yīng)用研究。rAAV1,5,8和9也有相同模式的報(bào)道（Burger et al., 2004;Cearley and Wolfe,       2006; Dodiya et al., 2010; Markakis et al.,2010）。相比之下，其他文章還報(bào)道了rAAV1,5,8和9對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定的偏好性（Davidson et al., 2000; Foust et al

8、., 2009; Gray et al., 2011;Aschauer et al., 2013; Petrosyan et al., 2014; Watakabe et al.,2015），甚至有報(bào)道rAAV8和rAAV-rh43對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞有優(yōu)勢(shì)（Lawlor et al., 2009; Aschauer et al., 2013）。不同的血清型的AAV對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的取向性不同的原因仍少有報(bào)道（更多細(xì)節(jié)見(jiàn)“討論”）。一些研究對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子進(jìn)行了改進(jìn)，如gfa2或gfaABC1D（Merienne et al., 2013; Weinberg et al., 2013）。然

9、而，即使有這些改進(jìn)，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率并未有很大的提升，新的靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞的AAV載體將在該領(lǐng)域非常受歡迎。這篇文章中我們研究了之前較少研究的rAAV血清型之一，rAAV6，其能有效靶向大鼠大腦皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 材料和方法 材料與試劑牛血清白蛋白（BSA)、DAPI、N-propyl-gallate、Triton X-100，所有的鹽和溶劑均購(gòu)自SigmaAldrich (St.Louis, MO, USA)，均使用最高純度的，除非另有說(shuō)明。細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、抗生素使用 Gibco R品牌，重組蛋白酶TrypLE R購(gòu)自Life Technologie

10、s/Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)。所使用的抗體的來(lái)源和目錄編碼在文章中標(biāo)注。 rAAV載體      血清型rAAV1，rAAV2，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV8和rAAV9 的腺相關(guān)病毒從維真生物（Vigene）公司獲得。這些病毒是用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝制備的。主要的質(zhì)粒pAV-U6-GFP含有AAV2 ITRs序列，U6啟動(dòng)子后面有shRNA插入位點(diǎn)，CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)EGFP基因表達(dá)，氨芐青霉素抗性。Rep 和 Cap質(zhì)粒以及輔助質(zhì)粒提供了病毒

11、復(fù)制機(jī)器的組件和決定AAV血清型的衣殼蛋白。HEK293細(xì)胞裂解后，病毒顆粒通過(guò)碘克沙醇梯度超速離心進(jìn)行純化。有關(guān)這些病毒的詳細(xì)信息及他們的包裝和純化過(guò)程可以在維真生物（Vigene）公司網(wǎng)站查到。作為對(duì)照，根據(jù)先前公開(kāi)的方法（Gao andSena-Esteves, 2012），我們也使用了馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院（Worcester，MA，USA）包裝的rAAV1，rAAV2，rAAV5和rAAV9的腺相關(guān)病毒。這種腺相關(guān)病毒也由三重質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝制備的。這些病毒載體由CAG啟動(dòng)子編碼翻譯EGFP蛋白，病毒血清型由衣殼蛋白種類決定。同樣的病毒純化通過(guò)CsCl梯度超速離心方法。在以上

12、兩類rAAV病毒滴度通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）測(cè)定，純度通過(guò)蛋白凝膠電泳后考馬斯亮藍(lán)染色或銀染測(cè)定。原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)      原代星形膠質(zhì)細(xì)胞是從1-2天齡的Sprague-Dawley大鼠幼仔的大腦中提取制備的。所有動(dòng)物程序嚴(yán)格遵守由國(guó)際動(dòng)物中心和奧爾巴尼醫(yī)學(xué)院使用委員會(huì)制定的NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，大鼠幼仔被快速殺死解刨，迅速取到大腦組織。將皮質(zhì)與腦膜和海馬體分離，并置于預(yù)冷的Opti-MEM中。將腦組織切碎并在等量的含有重組蛋白酶的TrypLE和Opti-MEM混合液中進(jìn)行酶解，并另外補(bǔ)充DNase

13、I（1mg / ml）。在37下重復(fù)用TrypLE進(jìn)行細(xì)胞提取3次。第一次提取的細(xì)胞不要，將最后兩次提取的細(xì)胞合并并通過(guò)1000×g的短暫離心沉降。細(xì)胞重懸于DMEM中，其含有10%熱滅活馬血清（HIHS）、50 U/mL青霉素和50g/ mL鏈霉素，然后按每瓶200,000個(gè)細(xì)胞的密度接種在聚-D-賴氨酸材質(zhì)的T-75的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)的細(xì)胞放置在含5%CO2的37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4周。每周更換兩次培養(yǎng)基。對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白的抗體染色（GFAP，Sigma貨號(hào)# g3893），定期檢測(cè)培養(yǎng)物純度，純度需大于 95。人類視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用作AAV功能

14、的另外的對(duì)照。已知這種細(xì)胞容易被多種血清型的AAV感染（Surace and Auricchio, 2008）。 ARPE-19在含有10胎牛血清和抗生素的的DMEM中培養(yǎng)，同樣選用T75培養(yǎng)瓶。在用TrypLE提取細(xì)胞后定期傳代。 體外rAAV感染和免疫反應(yīng)過(guò)程      將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞或ARPE-19細(xì)胞接種在24孔板中，用七種不同的rAAV病毒分別進(jìn)行感染?；谠囼?yàn)過(guò)的滴度摸索實(shí)驗(yàn)，我們選用105gc/cel的病毒量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣感染效率最好。首先，將各種rAAV分別感染的細(xì)胞在Opti-MEM 培養(yǎng)基中37下進(jìn)行孵育，孵育

15、4h后，每個(gè)孔補(bǔ)充等體積的DMEM，星形膠質(zhì)細(xì)胞用含10HIHS的DMEM，ARPE-19細(xì)胞用含10%FBS的DMEM。培養(yǎng)20小時(shí)，根據(jù)需要用新鮮的DMEM-HIHS或DMEM-FBS替換含rAAV的培養(yǎng)基。48-72小時(shí)后測(cè)定病毒感染率（GFP表達(dá)）。測(cè)定感染效率的方法：將培養(yǎng)基中的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌兩次，然后用含4多聚甲醛的PBS緩沖液在室溫（20）下進(jìn)行固定，再用PBS洗滌兩次，然后用含0.1Triton X-100的PBS在室溫下透析15分鐘。再經(jīng)過(guò)兩次PBS洗滌，然后再用含1BSA的PBS在室溫下封閉1小時(shí)。免疫反應(yīng)過(guò)程：在室溫下，將固定好的星形膠質(zhì)細(xì)胞用兔多克隆抗GFP抗體

16、（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，目錄A6455,1：2,000）或者雞多克隆抗GFP抗體（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，目錄號(hào)A10262，1：500稀釋）孵育1小時(shí)。用PBS洗滌三次，每次5min，以除去未結(jié)合的一抗，然后將細(xì)胞與偶聯(lián)Alexa-Fluor 488的山羊抗兔二抗（Life Technologies / Thermo Fisher Scientific，A11008,1：1,000稀釋）或偶聯(lián)Alexa-Fluor 488的山羊抗雞二抗（Life Techno

17、logies / Thermo Fisher Scientific，目錄A11039,1:500稀釋）進(jìn)行孵育，在室溫下封閉1小時(shí)。用PBS洗滌三次，每次5min，以去除未結(jié)合的二抗。用DAPI（10g/ ml）復(fù)染細(xì)胞，在室溫下孵育15分鐘，并用PBS洗滌一次。用Zeiss LSM510META共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）捕獲Alexa-488熒光圖像。為確保GFP表達(dá)比較的有效性，所有圖像在相同的條件下進(jìn)行拍攝。rAAV注射動(dòng)物      根據(jù)國(guó)際動(dòng)物保護(hù)法，以及奧爾巴尼醫(yī)學(xué)委員會(huì)制定的關(guān)于保護(hù)和使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的N

18、IH規(guī)定，在對(duì)動(dòng)物麻醉處理的情況下注射rAAV病毒。約200g重的5周齡雄鼠在含30%氧氣和70%氮?dú)獾沫h(huán)境中用異氟醚進(jìn)行麻醉（5%濃度用于誘導(dǎo)，2%濃度用于維持），用直腸探頭進(jìn)行體溫檢測(cè)，用加熱墊維持老鼠體溫在36.5-37度。將動(dòng)物置于嚙齒動(dòng)物立體定位框架上（David KopfInstruments，Tujunga，CA，USA）。在頭皮皮下局部額外的注射布比卡因（Hospira，Lake Forest，IL，USA）進(jìn)行頭皮麻醉，在頭皮上做一個(gè)切口暴露顱骨，接下來(lái)，在頭骨上用力矩II鉆（Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA）鉆一個(gè)小孔，這個(gè)位置在桶狀皮層

19、區(qū)域的正上方(正中線前方2 mm , 前鹵邊緣5 mm)。用含有rAAV2或rAAV6病毒的注射器注射老鼠的硬脊膜下2.1毫米處，注射速度是0.2ul/min,注射病毒量為1ul。等待10min以確保病毒進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)散，然后將注射器向上拔出1mm，再注射1ul的病毒。縫合切口，按0.1mg/kg的量皮下注射布魯林諾啡，并在傷口處涂抹三聯(lián)抗生素軟膏以愈合傷口，術(shù)后兩天每日兩次喂食丁丙諾啡。術(shù)后喂養(yǎng)3個(gè)星期以確保病毒的擴(kuò)散和標(biāo)記蛋白GFP的表達(dá)。 病毒感染后的免疫反應(yīng)分析      為了評(píng)估病毒的感染效率，我們對(duì)GFP的表達(dá)進(jìn)行免疫組化分

20、析。首先給老鼠注射致死量的戊巴比妥鈉，然后用含肝素溶液的PBS緩沖液灌注心臟內(nèi)，再用含4%多聚甲醛的PBS緩沖液灌注。將大腦取出，在4度下用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到30%的蔗糖溶液中（4度）進(jìn)行低溫保護(hù)。取出蔗糖溶液中的腦組織放入Tissue-Tek O.C.T.冰凍切片包埋劑中固定在低溫裝置中冷凍至-20度，然后用Leica CM3050恒冷箱切片機(jī)切片，片厚25um，切片防御冷藏液中儲(chǔ)存在-20度冰箱中，冷藏液的成分為50%的Tris緩沖生理鹽水（TBS）、30%乙二醇、20%甘油。染色前，將切片用TBS緩沖液清洗5次，然后在室溫下用含3%正常山羊血清（載體實(shí)驗(yàn)室，Burlin

21、game、CA、美國(guó)）和0.3%Triton X-100的溶液封閉30分鐘。首先，用兔多克隆抗GFP抗體在4度條件下孵育24-48h，抗體用3%正常山羊血清稀釋。然后，用TBS緩沖液清洗5次切片，再用山羊抗兔標(biāo)記AlexaFluor 488的二抗在常溫下孵育2h，抗體同樣用3%正常山羊血清進(jìn)行稀釋。為了進(jìn)一步驗(yàn)證是哪種細(xì)胞類型感染了AAV病毒，我們將相同的切片用小鼠單克隆抗NeuN抗體（(EMD-Millipore, cat. # MAB377, 1:500) 或者小鼠單克隆抗GFAP抗體進(jìn)行孵育，染色程序同上，所不同的是所用的山羊抗小鼠的二抗用AlexaFluor 555標(biāo)記（(L

22、ife Technologies/Thermo Fisher Scientific, cat. #A21422, 1:400)。二抗孵育后，用TBS清洗5次以除去未結(jié)合的二抗。然后將腦切片用0.1ug/ml的DAPI在室溫下復(fù)染15分鐘，再用TBS清洗一次，最后涂抹防褪色劑N-propyl-gallate并用透明指甲油密封，置于顯微鏡下。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們改變了初級(jí)抗體的使用順序并發(fā)現(xiàn)當(dāng)最后用GFP抗體時(shí)，得到的GFP信號(hào)更強(qiáng)，而且在初級(jí)抗體中加入0.3%的 Triton X-100能使得抗體更好的滲透到切片中。需要強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是細(xì)胞取向的定量分析都是按照上面介紹的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

23、的，而且抗體的使用順序并不會(huì)影響病毒感染效率和細(xì)胞取向的分析結(jié)果。所有的切片的熒光圖片都是用Zeiss LSM-510 Meta共焦顯微鏡用250×放大而且是相同的曝光和設(shè)置條件下拍攝的。半腦圖像是用Leica TCS SPE共焦顯微鏡在15×放大條件下拍攝便于更形象的觀察病毒的感染情況。一系列的六張圖片的展示是用一個(gè)具有代表性的圖像拼接軟件拼接而成。數(shù)據(jù)分析      各種病毒體內(nèi)感染效率的定量分析以及免疫熒光圖片的拍攝都是有兩名不知實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡膶彶檎吆鸵幻跫?jí)研究者共同完成。對(duì)于染色切片或免疫熒光圖片中細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)取三位實(shí)驗(yàn)人員計(jì)

24、數(shù)的平均值。分析的切片數(shù)目、注射的動(dòng)物數(shù)量以及總細(xì)胞數(shù)都在文字和表格中進(jìn)行了說(shuō)明。統(tǒng)計(jì)數(shù)字的比較分析采用方差分析和tukey事后檢驗(yàn)法，使用Origen8.1軟件進(jìn)行多重比較分析。 結(jié)論 在常用的七種血清型腺相關(guān)病毒中，rAAV6對(duì)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞具有最高的感染效率      為了確定一種能有感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的AVV血清型，我們選擇了7種市售的重組AAV載體：rAAV1, rAAV2, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8,and rAAV9，這幾種AAV載體都是在CMV啟動(dòng)子下表達(dá)GFP蛋白。在第一組的一系列實(shí)驗(yàn)中，我們用

25、兩種不同的GFP抗體進(jìn)行檢測(cè)，只有rAAV6在兩組實(shí)驗(yàn)中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有一致的高效的感染性（圖1）。作為對(duì)照，我們同樣用兩種抗體對(duì)未感染病毒的細(xì)胞進(jìn)行了免疫反應(yīng)檢測(cè)，未檢測(cè)到免疫反應(yīng)（圖1）。其他的rAAV血清型表現(xiàn)出低水平的感染效率，只有少量的星形膠質(zhì)細(xì)胞被感染，而且感染的細(xì)胞的熒光亮度非常弱（圖1）。有趣的是，rAAV7和rAAV9對(duì)另外一種細(xì)胞類型有明顯的感染取向性（比如小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞），這種細(xì)胞目前在星形膠質(zhì)類細(xì)胞中占一小部分（圖1箭頭所指）。為了確定這個(gè)結(jié)果對(duì)不同批次生產(chǎn)的病毒也是有效的，首先我們用同一供應(yīng)商生產(chǎn)的第二批病毒進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)rAAV6對(duì)星形膠質(zhì)

26、細(xì)胞仍有很高的感染性，rAA2也表現(xiàn)出了高感染性，這是不同批次病毒的差異性所致（補(bǔ)充圖S1)。另外，我們用了另外一套不同包裝方法以及不同啟動(dòng)子的腺相關(guān)病毒做了相同的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)rAA2(AAV2/2)、rAAV1(AAV2/1)以及rAAV5(AAV2/5)有較高水平的感染性（補(bǔ)充圖S1)，但由于病毒量的限制，我們未能進(jìn)行幾組細(xì)胞的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，也未能進(jìn)行不同批次細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。      所有上述實(shí)驗(yàn)都是用了相同比例的病毒量感染細(xì)胞（每個(gè)細(xì)胞使用105基因組拷貝數(shù)病毒）。對(duì)于rAAV1, rAAV5, rAAV7-9這幾種低感染率的病毒，我們將這幾種病毒

27、感染了RPE細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19細(xì)胞以確定病毒功能正常，因?yàn)橐暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是已知的非常容易被各種血清型AAV感染的細(xì)胞（Surace and Auricchio, 2008)。我們用了與圖1所示實(shí)驗(yàn)相同批次相同比例的病毒，與感染星形膠質(zhì)細(xì)胞形成強(qiáng)烈對(duì)比的是，rAAV1, 2, 5, 8對(duì)ARPE-19細(xì)胞表現(xiàn)出了高感染率，rAAV7和rAAV9也表現(xiàn)出了中度水平的感染率（圖2）?？傊?，感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明，在我們實(shí)驗(yàn)中選用的幾種血清型病毒，rAAV6表現(xiàn)出一致的高效的感染率，rAAV2、rAAV1以及rAAV5在不同批次不同生產(chǎn)方式的病毒中也會(huì)有一定感染效果，而且rAAV2在相同

28、病毒包裝方式下，不同批次的病毒會(huì)有不同效果的感染率。 在大鼠腦內(nèi)實(shí)驗(yàn)，rAAV6優(yōu)先感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，rAAV2更傾向于感染神經(jīng)元細(xì)胞      為了確定rAAV6和rAAV2分別傾向于感染哪種類型的細(xì)胞，我們將被病毒感染后的腦切片進(jìn)行了多重免疫染色：病毒表達(dá)GFP蛋白，神經(jīng)元特異性標(biāo)記蛋白NeuN,以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白GFAP。和預(yù)期的一樣，由NeuN的免疫染色形態(tài)可看出，rAAV2很明顯的傾向于感染神經(jīng)元細(xì)胞（圖4，AAV2部分），形成鮮明對(duì)比的是，rAAV6對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞幾乎沒(méi)有感染性（圖4，AAV6部分）。相反，將腦切片中星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記

29、物GFAP進(jìn)行染色，在rAAV2感染的動(dòng)物腦切片中，我們發(fā)現(xiàn)很少的GFP+/GFAP+陽(yáng)性細(xì)胞（圖5，AAV2部分），在rAAV6感染的動(dòng)物腦切片中，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)近乎完美的GFP和GFAP信號(hào)之間的重疊（圖5，rAAV6部分）。這些數(shù)據(jù)有力地表明，rAAV2趨向于感染神經(jīng)元細(xì)胞，而rAAV6趨向于感染星形膠質(zhì)細(xì)胞。      為了量化不同血清型病毒對(duì)細(xì)胞感染的取向性，我們用rAAV2和rAAV6分別注射4只老鼠，在250×放大的顯微鏡下，選取5-8個(gè)視野盲記GFP+/NeuN+以及GFP+/GFAP+的細(xì)胞數(shù)目。為保證實(shí)驗(yàn)的可重現(xiàn)性，我們選用了同種包裝方

30、式兩個(gè)批次的病毒進(jìn)行感染。在被rAAV2感染的腦細(xì)胞中，我們統(tǒng)計(jì)有64.9 ± 5.5%的神經(jīng)元細(xì)胞被感染，通過(guò)計(jì)數(shù)GFP標(biāo)記細(xì)胞和NeuN標(biāo)記細(xì)胞染色的數(shù)目（218/336），只有19.8 ± 6.3%的星形膠質(zhì)細(xì)胞被感染（58/284，圖6）。而 GFP+/NeuN- 的大部分細(xì)胞根據(jù)形態(tài)判斷仍可能是神經(jīng)元細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞體和突起較大，類似圖4，rAAV2部分）。由于在許多切片中，NeuN的免疫染色偏弱，這使得盲鑒定者難以確定準(zhǔn)確的雙陽(yáng)性細(xì)胞，從而統(tǒng)計(jì)rAAV2感染神經(jīng)元的效率偏低。    &

31、#160; 相反，在被rAAV6感染的腦細(xì)胞中，我們統(tǒng)計(jì)有90.9 ± 2.8%的星形膠質(zhì)細(xì)胞被感染（241/265，圖6），而僅有10.8 ± 4.4%的神經(jīng)元細(xì)胞被感染（14/128，圖6）?？梢?jiàn)，rAAV6對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有非常強(qiáng)的感染取向。通過(guò)計(jì)數(shù)比較，rAAV2和rAAV6對(duì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染有非常明顯的差異性。 討論       本研究的主要發(fā)現(xiàn)是，市售的rAAV6對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞有很強(qiáng)的感染性，不管是體內(nèi)還是體外，并且可以選擇性的感染大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞。在7種測(cè)

32、試的rAAV中，只有rAAV6表現(xiàn)出對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞高的感染性。在體內(nèi)感染中，rAAV6感染了大腦區(qū)域90%以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞，這是非常有意義的，因?yàn)槟壳翱捎玫腁AV病毒對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染非常困難。      正如前言中所說(shuō)的，目前大部分的rAAV都傾向于感染神經(jīng)元細(xì)胞，rAAV2能感染95%以上的神經(jīng)元細(xì)胞而很難感染星形膠質(zhì)細(xì)胞或其他類膠質(zhì)細(xì)胞。我們這項(xiàng)研究中rAAV2實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了上述結(jié)論。也有報(bào)道重組AAV1,AAV5, AAV8, and AAV9 對(duì)嚙齒類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的感染性（例如Wang et al., 2003;

33、Cearley and Wolfe, 2006; Taymans et al., 2007; Lawlor et al.,2009; Dodiya et al., 2010），但是，不知為何這些研究結(jié)果都沒(méi)有可重復(fù)性。已經(jīng)有研究用rAAV1, rAAV5, rAAV8, rAAV9, 以及rAAV-rh10和rAAV-hu11注射嚙齒類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物觀察各種血清型病毒對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染性（(Davidson et al., 2000; Foust et al., 2009; Aschaueret al., 2013; Petrosyan et al., 201

34、4; Watakabe et al., 2015）。有研究發(fā)現(xiàn)AAVrth43對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定的感染性（Lawlor et al., 2009），并且進(jìn)一步的研究中，AAV病毒載體選用膠質(zhì)細(xì)胞的啟動(dòng)子Gfa2表達(dá)基因，由此種病毒載體包裝成病毒rAAV5，rAAV8及rAAV-rh43去感染星形膠質(zhì)細(xì)胞（Lawlor et al., 2009; Drinkutet al., 2012; Merienne et al., 2013）。不同研究中rAAV對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率不同，造成這種差異性的原因有很多，包括大腦區(qū)域的不同，動(dòng)物的年齡，物種等（Burger et al., 2004;Foust

35、 et al., 2009; Aschauer et al., 2013; Weinberg et al., 2013），甚至病毒的包裝和純化方法也會(huì)對(duì)病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定的影響（Klein et al., 2008）。啟動(dòng)子或其他基因因素也有可能造成病毒感染的取向性不同，但是沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。      這篇研究中我們報(bào)道了一種對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有很高的感染性并且有明顯的感染取向的血清型，rAAV6。以前有少量的報(bào)道，通過(guò)比較不同的AAV病毒發(fā)現(xiàn)rAAV6對(duì)小鼠、大鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦組織有感染取向（Koerber et al., 2009; Bli

36、ts et al., 2010; Markakis et al., 2010;Aschauer et al., 2013）。rAAV6 對(duì)腦部不同區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染率不同（Koerberet al., 2009; Aschauer et al., 2013）。在另一項(xiàng)研究中，rAAV6被用于感染人類的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，這種細(xì)胞來(lái)源于星形膠質(zhì)細(xì)胞（Huszthyet al., 2005）。rAAV6已經(jīng)在外周組織中被很好的應(yīng)用，對(duì)氣管上皮細(xì)胞、心肌組織和骨骼肌有很高的感染率（Halbert et al., 2001; Blankinship et al.,2004; Palomeq

37、ue et al., 2007）?？傊?，現(xiàn)有的文獻(xiàn)中有用rAAV6感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的先例，但是沒(méi)有足夠的證據(jù)證明這種血清型病毒傾向于感染神經(jīng)元細(xì)胞還是星形膠質(zhì)細(xì)胞。      決定rAAV6感染細(xì)胞型取向的原因是什么？我們實(shí)驗(yàn)中用了大量的病毒，這些病毒都是用相同的包裝和純化方式生產(chǎn)的，唯一的不同的是這些病毒的衣殼蛋白不同，因此，感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的差異性可能是有衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)決定的。雖然我們沒(méi)有在分子機(jī)制上進(jìn)一步的分析這種現(xiàn)象，但是之前的一些文獻(xiàn)已經(jīng)有些報(bào)道。一些研究發(fā)現(xiàn)，AAV1和AAV6的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)約有99%的相似性（Wu et al., 2006c

38、; Huang et al., 2016）。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)rAAV1和rAAV6在感染原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率上有非常大的不同，這樣的結(jié)果是令人意想不到的，但并非史無(wú)前例，在之前的研究報(bào)道中，有研究發(fā)現(xiàn)用這兩種血清型的病毒感染大腦和心臟，或者用于體外干細(xì)胞感染，兩者也表現(xiàn)出明顯的差異（Wu et al., 2006a;Markakis et al., 2010; Zincarelli et al., 2010）。有研究者給出的解釋是AVV6衣殼蛋白中有幾種其關(guān)鍵作用的獨(dú)特的氨基酸（Wu et al., 2006a）。rAAV6 衣殼蛋白中的三個(gè)突變點(diǎn) Y731F/

39、Y705F/T492V顯著影響了感染細(xì)胞的取向性和感染效率（Rosario et al.,2016）。      本研究的意義在于發(fā)現(xiàn)了一種新的對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的工具。以前的報(bào)道中，選用以gfa2為啟動(dòng)子表達(dá)外源基因的rAAV5，rAAV8和rAAV9感染星形膠質(zhì)細(xì)胞（例如Young et al., 2014; Furman et al., 2016），但是，這三種病毒對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率很容易受病毒包裝或其他因素的影響。為了說(shuō)明這一點(diǎn)，我們用維真生物（Vigene）公司生產(chǎn)的rAAV5，rAAV8和rAAV9病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)感染效率非

40、常低，但是同樣的這三種病毒感染ARPE-19就非常容易。其他的一些研究利用最近發(fā)現(xiàn)的具有星形膠質(zhì)細(xì)胞感染取向的rhAAV43，或者將病毒的衣殼蛋白基因進(jìn)行改造以提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率（Koerber et al., 2009; Lawloret al., 2009）。但是，這些情況下病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率并不高，只有一小部分星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白。例如，將AAV載體進(jìn)行突變改造后，體內(nèi)感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率只有15%（Koerber et al., 2009）。在本篇研究中，我們發(fā)現(xiàn)rAAV6在大腦區(qū)域感染星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率高達(dá)90%以上，至少這未設(shè)計(jì)和生產(chǎn)更有效的載體提供一個(gè)強(qiáng)

41、有力的起點(diǎn)。      鑒于過(guò)去研究結(jié)果的不穩(wěn)定性，我們需要考慮的一個(gè)問(wèn)題是我們的結(jié)果能否被別人重現(xiàn)出來(lái)，我們通過(guò)一系列體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。所有星形膠質(zhì)細(xì)胞的感染效率都是通過(guò)多批次的病毒感染評(píng)估得到，無(wú)感染效率或低感染效率的病毒都同樣的感染ARPE-19細(xì)胞，這種細(xì)胞已被公認(rèn)的易感染，以確定病毒沒(méi)有問(wèn)題。rAAV6對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞感染的取向性的量化用多個(gè)動(dòng)物體內(nèi)注射分析得到，并且用不同生產(chǎn)方式不同批次的病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，排除潛在的批次之間的差異，最后計(jì)數(shù)采用盲目選擇的方式以減少分析偏見(jiàn)的可能。我們所用的rAAV是一種商業(yè)化產(chǎn)品，有規(guī)范的包裝和純化方式，因此，rAAV6可作為對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的新工具，適用于感興趣的研究者，不管其之前有沒(méi)有AAV病毒包裝的經(jīng)驗(yàn)。圖1  七種表達(dá)GFP蛋白的不同血清型的病毒感染原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞將rAAV1, rAAV2, rAA