DNA定量分析用于宮頸癌及癌前病變的早期篩查探討

1、DNA定量分析用于宮頸癌及癌前病變的早期篩查探討                     作者：張薇，劉玉華，易細(xì)容，周單華 【摘要】  目的 探討用DNA定量分析和常規(guī)細(xì)胞學(xué)相結(jié)合方法而診斷宮頸癌及癌前病變。方法 對(duì)3266名婦女用宮頸刷取材，每例液基薄層制片2張，1張巴氏染色做常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查，1張F(tuán)eulgan DNA染色用全自動(dòng)DNA倍體分析系統(tǒng)做DNA定量測(cè)定。常規(guī)細(xì)胞學(xué)和DNA

2、倍體分析系統(tǒng)可疑的婦女在陰道鏡下行宮頸組織學(xué)活檢。結(jié)果 3266例宮頸癌標(biāo)本中，常規(guī)細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)42例非典型鱗狀上皮（ASCUS），9例低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）及1例高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）。DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上5C細(xì)胞的35例。32例活檢病例中有14例宮頸上皮內(nèi)瘤變2（CIN2）或CIN2以上級(jí)別改變，這14例細(xì)胞標(biāo)本中均可見DNA倍體異常，而常規(guī)細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)1例正常，8例ASCUS，4例LSIL和1例HSIL。結(jié)論 DNA倍體分析與常規(guī)細(xì)胞學(xué)相結(jié)合方法可提高宮頸癌及癌前病變的陽性率。 【關(guān)鍵詞】  宮頸腫瘤 宮頸上皮內(nèi)瘤變   

3、; Screening for Early Cervical Cancer and Precancerous Cervical Lesions by DNA Ploid Analysis    Abstract: Purpose To explore the diagnosis for cervical cancer and precancerous cervical lesions by DNA ploid analysis combined with cytology. Methods A total of 3266 cervical samples were

4、 obtained by cervix brush. Cell monolayers were prepared by a liquid based sample preparation. Two slides were prepared from each case: one slide was stained by Papanicolaou stain for conventional cytology examination, while the other slide was stained by Feulgen-Thionin method to measure relative a

5、mount of DNA in cell nuclei using an automated DNA imaging cytometer. Women suspected by cytology and DNA ploid underwent a colposcope examination and biopsy. Results Forty-two cases proved atypical squamous cells of  undermined significance (ASCUS) by cytology; 9 cases, low-grade squamous intr

6、aepithelial lesion (LSIL); and 1 case, high-grade squamous intraepithelial lesion(HISL) were found, while DNA ploid analysis found 35 cases having 3 or more cells with DNA greater than 5C in a total of 3266 women. Fourteen cases with cervical intraepithelial neoplasia 2(CIN2 or over） out of 32 biops

7、ies were diagnosed as 1 case, normal; 8 cases, ASCUS; 4 cases, LSIL and 1 case, HSIL by cytology. However all 14 cases were determined aneuploid cells by a DNA image cytometry. Conclusion Combination of DNA ploid analysis and cytology can increase positive rate of detection for cervical cancer and p

8、recancerous cervical lesions.    Key words：DNA ploid; cytology; cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia    宮頸癌是婦科高發(fā)的惡性腫瘤之一，宮頸癌及癌前病變的早期篩查與早期治療是防治宮頸癌的主要手段。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查簡便、可靠，是目前推行最廣、最有成效的防癌篩查方法。但在傳統(tǒng)的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查過程中可出現(xiàn)：取材時(shí)細(xì)胞丟失和制片時(shí)涂片質(zhì)量差、人眼工作疲勞等問題，往往會(huì)影響細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生的正確診斷而導(dǎo)致較高的

9、假陰性。近年來，我們采用宮頸刷取材，液基薄層制片，有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞學(xué)醫(yī)生與全自動(dòng)DNA圖像分析系統(tǒng)相聯(lián)合，力求把宮頸癌及癌前病變的漏診率降低到最低限度。目前，DNA倍體分析系統(tǒng)進(jìn)行宮頸癌前病變的診斷及預(yù)測(cè)在國內(nèi)外已有大量報(bào)道13。在北美及歐洲細(xì)胞DNA定量分析診斷方法已是一種常見臨床檢測(cè)方法之一4，5。本研究主要探討用宮頸常規(guī)細(xì)胞學(xué)結(jié)合全自動(dòng)DNA圖像分析系統(tǒng)診斷宮頸癌及癌前病變。    1   材料與方法    2005年10月至2006年5月，3 266名婦女在本院進(jìn)行宮頸癌篩查。參與檢查婦女的年齡多數(shù)在2262歲

10、。宮頸癌普查試劑盒由武漢蘭丁腫瘤早期診斷檢測(cè)中心提供，其中包括：宮頸刷、盛有固定液的標(biāo)本管、標(biāo)簽、申請(qǐng)單等。    1.1   取   材    婦科醫(yī)生在陰道擴(kuò)張器直視下，手持宮頸刷的刷柄，通過擴(kuò)陰器，將刷頭中央較長的刷絲從子宮頸外口插入子宮頸管內(nèi)（約8mm）處，周邊刷絲頂部抵觸于子宮頸黏膜面，順時(shí)針或逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)35圈，取出宮頸刷后，用鑷子夾緊刷頭底座，拔脫刷頭，將刷尖向下垂直方向浸泡在樣本收集管固定液內(nèi)，旋緊管蓋后震蕩搖晃，然后將貼上標(biāo)簽的標(biāo)本管送到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室制片。  &

11、#160; 1.2   液基薄層制片及染色    將裝有固定液和刷頭的標(biāo)本收集管，經(jīng)化學(xué)和物理處理，每例制成2張薄層細(xì)胞學(xué)片。其中1張巴氏染色做常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷，另外1張F(tuán)eulgen DNA染色做DNA定量測(cè)定。    1.3   細(xì)胞學(xué)診斷    所有巴氏染色片經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞病理醫(yī)生讀片。根據(jù)Bethesda診斷分為5組：正常或良性；不明意義的非典型鱗狀上皮(typical squamous cells of  undermined significan

12、ce，ASCUS)；低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low?鄄grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)；高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high?鄄grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)或原位癌(carcinoma in sita，CIS)；鱗狀上皮浸潤癌。    1.4   細(xì)胞DNA定量分析    所有Feulgen染色片用AcCell全自動(dòng)細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描處理6，7，該系統(tǒng)已達(dá)到歐洲定量細(xì)胞病理學(xué)會(huì)所制定的有關(guān)DNA定量分析圖像

13、系統(tǒng)的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)8。一般情況下，AcCell系統(tǒng)對(duì)每張玻片上6 000個(gè)以上的細(xì)胞核進(jìn)行掃描測(cè)定。經(jīng)掃描后的每個(gè)細(xì)胞核均有128個(gè)特征值，其中包括形態(tài)特征、吸光特征、具體結(jié)構(gòu)特征、Markovian和非Markovian結(jié)構(gòu)特征和長度特征等。AcCell系統(tǒng)根據(jù)不同細(xì)胞成分所具有的不同特征參數(shù)來完成自動(dòng)細(xì)胞分類和計(jì)數(shù)過程，如正常上皮細(xì)胞，增生或癌變細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，中性白細(xì)胞及未參與診斷的垃圾細(xì)胞（重疊細(xì)胞核，聚焦不良細(xì)胞核和核碎片等）。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照細(xì)胞為同張玻片上的100個(gè)正常上皮細(xì)胞，所測(cè)出的平均光密度(intergrated optical density，IOD)為2C的參考值，其CV（coe

14、fficient of variantion）值5%。如果出現(xiàn)以下三種情況就診斷異常：出現(xiàn)5C（DNA指數(shù)2.5）非整倍細(xì)胞。4C細(xì)胞數(shù)超過被測(cè)細(xì)胞總數(shù)的10%。出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞峰。    凡是有DNA指數(shù)2.5以上細(xì)胞的玻片，都要通過細(xì)胞技術(shù)員在顯微鏡下逐一對(duì)DNA指數(shù)2.5細(xì)胞進(jìn)行核實(shí)，以排除AcCell系統(tǒng)將垃圾和重疊的細(xì)胞核誤認(rèn)為癌細(xì)胞或異常細(xì)胞。    1.5   結(jié)合常規(guī)細(xì)胞學(xué)與DNA定量分析    根據(jù)表1而做出綜合診斷及建議。    1.6

15、   陰道鏡及病理學(xué)檢查    凡建議活檢婦女，均建議進(jìn)行陰道鏡檢查并對(duì)宮頸可疑部位進(jìn)行四點(diǎn)以上的組織活檢。每例活檢樣本由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)生出病理診斷報(bào)告。病理診斷報(bào)告分別為正常、宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN1、CIN2、CIN3）或原位癌和浸潤癌。百事通     2   結(jié)   果    2.1   常規(guī)細(xì)胞學(xué)與DNA倍體分析比較    3 266名婦女中，常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷3 214例正常，42

16、例ASCUS、9例LSIL及1例HSIL；DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)3 117例未見非整倍體細(xì)胞，114例12個(gè)5C非整倍體細(xì)胞，27例310個(gè)5C非整倍體細(xì)胞和8例10個(gè)或10個(gè)以上5C非整倍體細(xì)胞。在42例ASCUS病例中，除2例ASCUS和1例LSIL外，其余ASCUS，LSIL和HSIL均可見非整倍體細(xì)胞。在114例12個(gè)非整倍體細(xì)胞病例中，89例常規(guī)診斷為正常，其余25例分別診斷為ASCUS和LSIL。在27例310個(gè)5C細(xì)胞病例中，有11例常規(guī)診斷正常，16例診斷為ASCUS或LSIL。在8例大于10個(gè)5C細(xì)胞病例中，常規(guī)均診斷為ASCUS、LSIL或HSIL。  &#

17、160; 表2中常規(guī)細(xì)胞和DNA倍體分析均為正常3 114例，常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷正常而DNA發(fā)現(xiàn)12個(gè)5C細(xì)胞89例和常規(guī)診斷為ASCUS而DNA分析正常的2例，未要求活檢，其余的61例均要求活檢。    2.2   病理學(xué)診斷與DNA倍體分析和常規(guī)細(xì)胞學(xué)比較    有61例婦女要求活檢，但在本院實(shí)際活檢例數(shù)為32例。32例病理檢查發(fā)現(xiàn)1例為宮頸炎，17例CIN1，7例CIN2，6例CIN3/CIS和1例浸潤癌。    表3顯示，在1例宮頸炎中DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)有310個(gè)大于5C細(xì)胞（常規(guī)

18、診斷為ASCUS）。在17例CIN1中有1例DNA倍體分析正常，而常規(guī)診斷為LSIL，其余16例均可見DNA倍體異常。在7例CIN2、6例CIN3/CIS和1例浸潤癌中均可見DNA倍體異常。    在18例病理診斷為宮頸炎和CIN1病例中，有常規(guī)細(xì)胞學(xué)分別診斷為2例正常，12例ASCUS，3例LSIL。在14例病理診斷為CIN2、CIN3/CIS和浸潤癌的病例中，常規(guī)細(xì)胞學(xué)分別診斷為1例正常，8例ASCUS，4例LSIL和1例HSIL。    2.3   敏感性    若以病理學(xué)診斷為

19、金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算常規(guī)細(xì)胞學(xué)和DNA倍體分析診斷CIN2或CIN2以上級(jí)別的敏感性。若以ASCUS和LSIL診斷作為活檢發(fā)現(xiàn)CIN2或CIN2以上級(jí)別的敏感性為92.9%和35.7%。而若以發(fā)現(xiàn)1個(gè)以上、3個(gè)以上和10個(gè)以上非整倍體細(xì)胞作為活檢而發(fā)現(xiàn)CIN2或CIN2以上級(jí)別的敏感性分別為100%、92.9%和21.4%。    3   討   論    臨床上對(duì)宮頸常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS患者較難處理，由于這類患者的活檢陽性率低，往往要求這類患者半年內(nèi)復(fù)查。本文對(duì)21例ASCUS伴DNA倍體異?；?/p>

20、者進(jìn)行活檢可發(fā)現(xiàn)12例CIN1、4例CIN2、3例CIN3/原位癌及1例浸潤癌。提示此類型患者多伴有病理性改變，故有學(xué)者建議ASCUS伴有DNA非整倍體者須進(jìn)一步活檢，而ASCUS伴有整倍體者多視為正常而不要求進(jìn)一步活檢。本文還證實(shí)在3例常規(guī)細(xì)胞學(xué)正常而伴有多個(gè)非整倍體細(xì)胞患者均有病理性改變（2例CIN1、1例CIN2）。這都說明宮頸細(xì)胞中出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞，均要提高警惕。    有報(bào)道證實(shí)大多浸潤性宮頸癌均有染色體異常改變，在CIN2、CIN3/CIS和浸潤癌病例中分別有59%、84%和87%有異倍體細(xì)胞出現(xiàn)9。本文中14例CIN2或CIN2以上的病例均可見細(xì)胞D

21、NA倍體異常。    為什么宮頸癌及癌前病變可出現(xiàn)非整倍體細(xì)胞呢？這與HPV感染密切相關(guān)，Duensing等10研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染可引起染色體異常有兩條途徑：通過病毒上的E7影響細(xì)胞周期過程中心粒一分為二的過程。E6通過抑制p53在細(xì)胞周期中的作用位點(diǎn)11。    若以LSIL作為活檢標(biāo)準(zhǔn)而發(fā)現(xiàn)CIN2 以上病變的敏感性為36%，而以3個(gè)或3個(gè)以上異倍體細(xì)胞作為活檢標(biāo)準(zhǔn)的敏感性為93%。有報(bào)道證實(shí)LSIL的敏感性為63%，而以3個(gè)或3個(gè)以上異倍體細(xì)胞作為活檢標(biāo)準(zhǔn)的敏感性為90%3。從本文資料來看，將常規(guī)細(xì)胞學(xué)與DNA倍體方法結(jié)合

22、起來，綜合診斷其敏感性可達(dá)100%。    綜上，用DNA倍體分析方法來檢測(cè)宮頸癌及癌前病變是一種新的嘗試，從本文的資料可見DNA倍體分析與常規(guī)細(xì)胞學(xué)相結(jié)合可提高宮頸癌及癌前病變的檢出率。    致謝：武漢蘭丁腫瘤早期診斷檢測(cè)中心汪鍵博士對(duì)本文進(jìn)行的指導(dǎo)，李耀輝小姐對(duì)本文的幫助。 【參考文獻(xiàn)】  1 Grote HJ, Nguyen HV, Leick AG, et al. Identification of progressive cervical epithelial cell abnormalities us

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