TTV核酸模板快速制備方法

1、TTV核酸模板快速制備方法              作者：蘇明權(quán) ，馮繼紅 ，于文彬，徐光華 ，馬越云，張建芳 ，張林，劉家云 【關(guān)鍵詞】  TT病毒關(guān)鍵詞: TT病毒;聚合酶鏈反應(yīng);核酸制備 摘 要:目的  尋求建立適合大批量臨床標本檢測TT病毒（TTV）核酸快速制備方法，直接用于PCR擴增. 方法  應(yīng)用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法與直接快速裂解法，分別制備TTV核酸做PCR模板，用于TTV的聚合酶鏈反應(yīng)的快速檢測. 結(jié)果 

2、 在30例非甲非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患者血清，應(yīng)用經(jīng)典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法，分別制備TTV核酸模板，在相同條件下進行PCR擴增，結(jié)果兩種制備方法的符合率為89%. 結(jié)論  TTV是一種新發(fā)現(xiàn)的肝炎病毒，目前主要以實驗室檢測病毒核酸的存在為診斷依據(jù)，建立了具有快速、簡便、適合大批量臨床標本中TTV核酸制備方法，對TTV肝炎的快速診斷，具有重要的意義.     Rapid preparation of transfusion transmitted virus nucleic acid template 

3、    SU Ming-Quan     1 ，F(xiàn)ENG Ji-Hong     2 ，YU Wen-Bin     1 ，XU Guang-Hua     2 ，MA Yue-Yun     1 ，ZHANG Jian-Fang     1 ，ZHANG Lin     1 ，LIU J

4、ia-Yun     1    1 Center of Clinical Molecular Biology，Xijing Hospi-tal，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an710033，China，2 Deparment of Infectious Diseases，College of Medicine，Yan'an University，Yan'an716000     Keywords:transfusi

5、on transmitted virus;polymerase chain reaction;DNA preparation     Abstract:AIM To establish a method adapting to rapid preparation of TTV DNA from bulk samples for PCR.METHODS TTV nucleic acid template was prepared for PCR using two methods，viz.hydroxybenzene chloro-form extract

6、ion and directly rapid cracking.RESULTS DNA abstracted by the two methods was amplified at same PCR parameter and the coincidence rate was89%.CONCLUSION TTV is a new discovered hepatitis virus and the main laboratory diagnosis method is to detect it's DNA by PCR，so it is very important to establ

7、ish a method for rapid preparation of TTV DNA from bulk samples.     0 引言     TT病毒是近年新發(fā)現(xiàn)的一種肝炎病毒，當發(fā)現(xiàn)一種新的病原性相關(guān)病毒因子時，建立一種敏感、快速、特異的實驗室檢測方法并評價該病毒因子在肝病中的價值是十分重要的，該方法的臨床適用性和可行性，是評價所建立方法在臨床上應(yīng)用價值的關(guān)鍵所在.目前主要以實驗室檢測病毒核酸的存在為診斷依據(jù)，建立具有快速、簡便、適合大批量臨床標本中TTV核酸制備方法，對TTV肝炎的快速診斷，具有重

8、要的意義.我們從臨床快速檢測需要為目的，尋求建立一種快速、簡便的TTV核酸制備方法，用于大批量臨床標本的檢測，獲得滿意的結(jié)果.     1 材料和方法     1.1 材料  非甲非庚型肝炎血清30例，來自延安大學醫(yī)學院傳染科;慢性乙型肝炎患者血清50例，來自西京醫(yī)院就診患者;引物及合成:根據(jù)Nishizawa等1 報道的引物，外引物:RD037（正義鏈）5'-GCAGCAGCATATGGATATGT-3'RD038（反義鏈）5'-TGACTGTGCTAAAGCCTCTA-3

9、9;，擴增片段:270bp;內(nèi)引物:RD051（正義鏈）5'-ATACA-CATGAATGCCAGGC-3'RD052（反義鏈）5'-GTACTTCTTGCTGGTGAAAT-3'擴增片段:196bp，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成.     1.2 方法 蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法:50L血清加200L裂解液（50mmolL-1 Tris-HCl pH8.0，200mmolL -1 NaCl，10mmolL-1 EDTA，20gL-1 SDS，1gL-1 蛋白酶K），60水浴60min，加等體積酚:氯仿:異戊醇（25241

10、）混勻，4冰浴下30min，2000g離心10min，取上清加等體積預冷無水乙醇-20過夜，1000g離心20min，沉淀溶于20L0.1×TE緩沖液中，備用.直接快速制備法:20L血清加50L快速裂解液（50mmolL-1 Tris HCl，pH8.0，50mmolL1 KCl，1.5mmolL-1 MgCl，10gL -1 NP-40，5gL-1 Tween-205gL-1 Triton X-100，2.0gL-1 SDS）煮沸20min，1000g離心10min，取上清做模板.PCR擴增:第1輪PCR擴增:總反應(yīng)體積為25L，包括:10×PCR緩沖液2.5L;4×dNTP2.0L;外引物各1.0L（50pmolL -1 ）;DNA模板5.0L;Taq DNA酶3UL-1 ;無菌蒸餾水12.5L;無菌石蠟油30L覆蓋液面，94變性3min，進入PCR循環(huán)，循環(huán)條件:9450s，5550s，7270s，32個循環(huán)，最后72延伸5min.第2輪PCR擴增:總反應(yīng)體積為25L，包括:10×PCR緩沖液2.5L;4×dNTP2.0L;內(nèi)引物各1.0L（50pmolL-1 ）;第1次PCR產(chǎn)物5.0L;Taq DNA