RNA干擾在乳腺腫瘤治療中的研究進(jìn)展

1、RNA干擾在乳腺腫瘤治療中的研究進(jìn)展         10-09-08 15:49:00     編輯：studa20                    作者：王明玉 王文靜 宋現(xiàn)讓【關(guān)鍵詞】  RNA干擾；基因治療；乳腺腫瘤RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性雙鏈R

2、NA(doublestranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的同源mRNA發(fā)生特異性降解,導(dǎo)致靶基因表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)功能表型缺失。這一現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)機(jī)制。RNAi是廣泛存在于生物界的古老現(xiàn)象,是生物體抵御病毒或其他外來核酸入侵以及保持自身遺傳穩(wěn)定的保護(hù)性機(jī)制,是包括人類在內(nèi)的從低等真核生物到哺乳動物體內(nèi)天然存在的基因沉默機(jī)制，其抑制靶基因表達(dá)的效率遠(yuǎn)比反義核酸高，持續(xù)時間也更長,具獨(dú)特優(yōu)勢及廣泛的應(yīng)用前景1。1998年Fire2和他的同伴在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來,陸續(xù)有報(bào)道在植物和果蠅等

3、其他各種生物中也發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象。目前普遍認(rèn)為RNAi是機(jī)體細(xì)胞一種強(qiáng)有力的基因調(diào)控機(jī)制。典型的RNAi技術(shù)基本上對任何mRNA系列都有非常高的成功率3。但是在哺乳細(xì)胞中導(dǎo)入外源大分子dsRNA (>30個堿基) 常常導(dǎo)致非特異性的基因沉默效應(yīng),因?yàn)樗せ盍撕颂呛怂崦付鴮?dǎo)致非特異性的RNA降解,2001年Elbashir4等證實(shí)在哺乳動物細(xì)胞中存在RNAi現(xiàn)象,介導(dǎo)RNAi的中間物質(zhì)是小干擾RNA(siRNA)，siRNA小于30個堿基，不激活核糖核酸酶,而是通過序列特異性的方式誘導(dǎo)基因沉默效應(yīng)，揭開了RNAi應(yīng)用于哺乳動物和人類研究的新篇章。1  RNAi的機(jī)制 

4、   物種之間RNAi的作用機(jī)制雖然有差異,但都要經(jīng)歷起始階段和效應(yīng)階段兩步生物進(jìn)化上保守的過程5。在起始階段,與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)的各種方式產(chǎn)生的dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后,與一種核酸內(nèi)切酶Dicer結(jié)合并被Dicer切割成2123個堿基長的小片段。Dicer是核酸內(nèi)切酶家族中特異識別dsRNA的酶,它以三磷酸腺苷(ATP)依賴的方式從dsRNA的鈍頭或3端有小懸突的dsRNA上開始切割,然后再形成5末端為磷酸基，3末端為羥基并含有2個突出的單核苷酸的2123個堿基長的片段,這些小片段就是siRNA。在效應(yīng)階段，一部分siRNA與Dicer形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA i

5、nduced silencing complex，RISC)，RISC再與目的基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA結(jié)合并降解該mRNA。這也是一個需要能量的過程。RISC以內(nèi)切的方式降解mRNA,并且只是降解與siRNA互補(bǔ)的那部分序列,因此RNAi有很高的序列特異性。另一部分siRNA則作為引物,幫助RNA依賴性RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRp)以mRNA為模板合成新的dsRNA,這些新合成的dsRNA又可以與Dicer結(jié)合并被切割成siRNA,從而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，因此只要微量的dsRNA就可以引起RNAi6。2  RNAi技術(shù)的應(yīng)用2.1 

6、; RNAi技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用 RNAi作為一種新的方法,在基因功能的研究上呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景,提供了一種高通量分析的途徑。Fraser等7與Gonczy等8曾采用此方法證實(shí)了線蟲染色體和中早期胚胎細(xì)胞分裂及細(xì)胞代謝等有關(guān)的所有基因功能，并在約19 000個基因的線蟲蠕蟲中,構(gòu)建了12 000種不同dsRNA文庫用于研究其與復(fù)雜生命現(xiàn)象相關(guān)的基因的功能,如肥胖、衰老等。運(yùn)用化學(xué)合成的siRNA可幫助確定脊椎動物基因的功能,而且已擴(kuò)展至人類細(xì)胞的體外研究。Semizarov等9運(yùn)用RNAi技術(shù)沉寂Rb1基因,其編碼產(chǎn)物是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子,結(jié)果細(xì)胞周期中G1/S和G2/M

7、期的轉(zhuǎn)換、DNA的復(fù)制和修復(fù)、有絲分裂、凋亡均受到影響。通過構(gòu)建短的RNA文庫或編碼siRNA的DNA載體,已經(jīng)分析了8 000個人類基因的功能。其與基因芯片等技術(shù)結(jié)合,可高通量地分析各基因的功能，RNAi在細(xì)胞中具有抑制或滅活特異基因的功能,可以產(chǎn)生類似基因“敲除”的效應(yīng),是功能基因組研究的有效工具,這一技術(shù)比基因敲除技術(shù)具有明顯投入少、周期短、操作簡單等優(yōu)勢,它的應(yīng)用將為基因功能的研究開辟新途徑10。2.2  RNAi在基因治療中的運(yùn)用 由于RNAi是針對轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默,相對于傳統(tǒng)基因治療對基因水平上的敲除,整個流程設(shè)計(jì)更簡便、迅速、有效,為基因治療開辟了新的途徑

8、。其總體思路是通過加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制,控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。2.2.1  RNAi在抗病毒感染疾病中的運(yùn)用RNAi技術(shù)在丙型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒11、呼吸道合胞病毒、人類乳頭瘤病毒12、皰疹病毒13、Rous肉瘤病毒14、丁型肝炎病毒15、流感病毒、登革熱病毒16、輪狀病毒17中得到了運(yùn)用。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染率的持續(xù)上升是世界各國面臨的最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,目前仍沒有有效的疫苗和特效治療藥物,而RNAi技術(shù)的出現(xiàn)為HIV感染的預(yù)防和治療提供了新的可能；乙型肝炎病毒(HBV)的感染率在我國達(dá)10%,是引起肝硬化、肝癌的最

9、重要的原因,RNAi技術(shù)的出現(xiàn)也為HBV感染的預(yù)防和治療提供了新的可能。2.2.2  RNAi在抗腫瘤治療中的應(yīng)用 腫瘤一直是基因治療研究的重點(diǎn)對象,應(yīng)用于腫瘤基因治療的靶點(diǎn)有以下幾種：突變或轉(zhuǎn)位的基因，如ras、bcrabl18；過表達(dá)的基因，如抑凋亡基因bcl2、bag1、erbB19等；多藥耐藥基因,如Pgp；腫瘤生長因子基因，如黑色素瘤中的IL6、乳腺癌中的Her2；病毒癌基因，如與子宮頸癌有關(guān)的乳頭狀瘤病毒基因E6與E712；腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,如fos與cxcr4；腫瘤血管形成相關(guān)基因,如vegf20，其他還有端粒酶等。以上靶點(diǎn)同樣適用于RNAi治療腫瘤。體外

10、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。3  RNAi在乳腺腫瘤治療中的研究進(jìn)展    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤的首位。近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病年齡也明顯年輕化，嚴(yán)重威脅著婦女的健康。得益于腫瘤分子病因?qū)W的巨大成就及RNAi技術(shù)的逐漸成熟，使RNAi成為治療乳腺癌的手段之一成為可能。cxcr4基因在器官形成,脈管的生成,自體免疫,腫瘤侵潤和HIV1病毒的感染等方面起到了重要的作用。研究表明21在具有高度浸潤性人乳腺癌MDAMB231細(xì)胞中，cxcr4基因的表達(dá)活性非常高。RNAi抑制cxcr4基因的

11、表達(dá)后,這些有高度浸潤性的人乳腺癌MDAMB231細(xì)胞的浸潤性明顯地下降。Bergamaschi等22通過RNAi介導(dǎo)產(chǎn)生了p53依賴的細(xì)胞凋亡,從而為表達(dá)野生型p53的腫瘤如乳腺癌等的治療提供了新的可能。轉(zhuǎn)錄因子E2F1在調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增生中起關(guān)鍵性作用23。有研究表明24在多種腫瘤組織中,E2F1高表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中,E2F1表達(dá)升高與乳腺癌的浸潤性有關(guān)25，E2F1是乳腺癌的預(yù)測標(biāo)記26。Milner27和Xia等28采用RNAi技術(shù)構(gòu)建重組的表達(dá)E2F1 siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將重組載體和空載體轉(zhuǎn)染入人乳腺癌MCF7細(xì)胞中，結(jié)果顯示重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染

12、組與對照組相比，E2F1 mRNA表達(dá)顯著降低，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒做載體介導(dǎo)的RNAi能特異、顯著地抑制目的基因的表達(dá)。目前腫瘤化療失敗的原因之一是腫瘤細(xì)胞對化療藥物的多藥耐藥(MDR)。MDR是指由一種藥物誘發(fā),導(dǎo)致細(xì)胞對該藥耐藥的同時,對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制無關(guān)的化療藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象。其中,腫瘤細(xì)胞mdr1基因編碼的一種分子量為170 kD的細(xì)胞膜P糖蛋白(permeabilityglycoprotein，Pgp)過度表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR的重要原因。隨著人們對MDR形成機(jī)制研究的深入,逆轉(zhuǎn)MDR的方法也逐漸從Pgp蛋白本身轉(zhuǎn)向MDR產(chǎn)生的源頭mdr1基因。從分子生物學(xué)理解,因

13、mdr1過表達(dá)而形成MDR的過程是：mdr1基因轉(zhuǎn)錄mdr1mRNA翻譯Pgp泵出胞內(nèi)抗癌藥物MDR表型。顯然,在這一過程的上游阻止其發(fā)展效果最好29。Wu30等針對mdr1基因設(shè)計(jì)出與之同源的siRNA,連接到Psilence3.1H1Hygro載體上,轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞系MCF7/ADR中,經(jīng)檢測MCF7/ADR細(xì)胞經(jīng)特異性siRNA作用后，Pgp的表達(dá)率由99.8%下降到12.3%，細(xì)胞對阿霉素的IC50由17.88下降到0.51 mol/L,證明了由siRNA引發(fā)的RNAi可特異性的降低mRNA水平,引發(fā)mdr1基因沉默,從而逆轉(zhuǎn)MDR表型,提高乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。乏氧誘導(dǎo)因

14、子1（HIF）1在人乳腺癌細(xì)胞MCF7中起抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，Wang31等設(shè)計(jì)HIF1同源的短發(fā)夾RNA并用脂質(zhì)體導(dǎo)入經(jīng)乏氧培養(yǎng)的MCF7細(xì)胞，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞凋亡增加，血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程延緩。脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）是長鏈脂肪酸生物合成終末步驟的催化酶，它能調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對于雌激素雌激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性和雌激素依賴的細(xì)胞增殖、存活的不同敏感性狀態(tài)。藥理學(xué)阻斷FASN的活性可明顯增強(qiáng)雌激素雌激素受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，而在乳腺癌細(xì)胞中用RNAi技術(shù)沉默F(xiàn)ASN基因的表達(dá)則明顯降低雌激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的雌激素需要量，在激素依賴的乳

15、腺癌細(xì)胞中阻斷FASN的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而降低腫瘤細(xì)胞的增殖和活力32。(中間絲)波形蛋白是型中間絲蛋白，在上皮癌中頻繁表達(dá)，并與癌細(xì)胞的高侵襲性及預(yù)后不良相關(guān)。在體外試驗(yàn)中，波形蛋白陽性表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞MDAMB231的侵襲性很高，McInroy33等用RNAi下調(diào)MDAMB231中波形蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到抑制。轉(zhuǎn)移是乳腺癌病人死亡的主要原因,翻譯抑制蛋白30/CC3(translationinhibiting protein30/CC3,TIP30/CC3)為一轉(zhuǎn)移抑制基因，Zhao34等在87例經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本中用免疫組化方法測得TIP30/CC3的表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000 8)及脈管侵犯(P=0.001 6)明顯負(fù)相關(guān)，用RNAi技術(shù)沉默TIP30/CC