氨基酸含量的測定

1、萌三酮顯色法測定氨基酸含量一、目的學(xué)習(xí)前三酮顯色法測定氨基酸含量的方法二、原理苗三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。氨與即三酮和還原性前三酮反應(yīng)，生成 紫色化合物。該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過測定570nm處的 光密度，測定氨基酸的含量。三、試劑與材料（1）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：配制成0. 3mmol/L溶液。（2）pH5.4, 2mol/L醋酸緩沖液:量取86mL 2mol/L醋酸鈉溶液,加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH檢查校正。（3）茁三酮顯色液：稱取85mg ®三酮和13mg還原茁三酮，用10mL乙二醇 甲瞇溶解。苗三酮若變?yōu)槲⒓t色，則需按下法重結(jié)晶：稱取5

2、g前三酮溶于1525mL熱 蒸憎水中，加入0.25g活性炭，輕輕攪拌。加熱30n）in后趁熱過濾，濾液放入冰箱 過夜。次日析出黃白色結(jié)晶，抽濾，用ImL冷水洗滌結(jié)晶，置干燥器干燥后，裝入 棕色玻璃瓶保存。還原型茁三酮按下法制備：稱取龍苗三酮，用123mL沸蒸鐳水溶解，得黃色 溶液。將5g維生素C用250mL溫蒸鐳水溶解，一邊攪拌一邊將維生素C溶液滴加 到即三酮溶液中，不斷出現(xiàn)沉淀。滴定后繼續(xù)攪拌15min,然后在冰箱內(nèi)冷卻到 4°C,過濾、沉淀用冷水洗滌3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，備用。乙二醇甲瞇若放置太久，需用下法除去過氧化物：在500mL乙二醇甲瞇中加 入5g硫酸亞鐵

3、，振蕩12h,過濾除去硫酸亞鐵，再經(jīng)蒸鐳，收集沸點(diǎn)為121 125°C的憎分，為無色透明的乙二醇中瞇。(4) 60%乙醇。(5) 樣品液:每毫升含0.550 Pg氨基酸。(6) 分光光度計(jì)。(7) 水浴鍋。四、操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別取0. 3mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液0, 0.2, 0.4, 0.6, 0. 8, 1. OmL于試管 中，用水補(bǔ)足至ImL。各加入lmL pH5. 4, 2mol/L醋酸緩沖液;再加入ImL苗三酮 顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100°C水浴中加熱lomin,用自來水冷卻。 放置5min后，加入3mL 60%乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計(jì)測定0D570nmo(脯氨酸和疑脯氨酸與即三酮反應(yīng)呈黃色，應(yīng)測定0D440nm)。以0D570nm為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 氨基酸樣品的測定取樣品液lmL,加入pH5.4, 2mol/L醋酸緩沖液lmL和苗三酮顯色液lmL,混 勻后于100°C沸水浴中加熱lomin,自來水冷卻。放置5min后，力口 3mL 60%乙醇 稀釋，搖勻后測定0D570nm (生成的顏色在60min內(nèi)穩(wěn)定)。將樣品測定的0D570nm與標(biāo)準(zhǔn)